微生物细胞破碎

不同细胞可采用的化学渗透处理方式
细胞类型 革兰氏阴 性细菌 革兰氏阳 性细菌 酵母菌 植物细胞 巨噬细胞 * 变性剂 清洁剂 * * * * * * * 表示适用 有机溶剂 * * * * * 酶 * * * * * * * * 抗生素 * 生物试剂 螯合剂 *
☀各种试剂的不同作用机理，将几种试剂合 理地搭配使用能有效地提高胞内物质的释 放率。
击板，得以破碎。
喷雾撞击破碎特点
喷雾撞击特点：
（1）细胞破碎仅发生在与撞击板撞击的一瞬，细胞破碎 度均匀，可避免细胞反复受力发生过度破碎现象。
（2）细胞破碎程度可通过无极调节载气压力（流速）控 制，避免胞内结构的破坏，适用于细胞器（叶绿体、 线粒体）的回收。
喷雾撞击适用于微生物细胞和植物细胞的破碎，通 常处理悬浮液质量控制浓度为100-200g/L。实验室规 模的撞击破碎器间歇处理能力为50-500mL/h，而工 业规模的处理能力为10L/h。与其他机械法一样，此 种破碎方法也会造成操作系统的温度上升，破坏生物产 品的生物活性，单程操作使温度大约上升10摄氏度。 因此，操作系统中必须设有冷却系统，以保证生物产品 的活性。
酶溶法的优点： 选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。
缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同 的酶），产物抑制的存在。 如在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑 制葡聚糖酶。
（2）自溶法（Autolysis）
诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的 活力，以达到细胞自溶的目的。 影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、 激活剂和细胞代谢途径等。常用加热法和干燥法。 缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的 变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。
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不宜采用高压匀浆法的细胞类型：
易造成堵塞的团状或丝状真菌 较小的革兰氏阳性菌 含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）
思考问题： 比较高压匀浆法与珠磨法的异同点？
3.喷雾撞击破碎
细胞弹性体 刚性体
喷雾撞击破碎器结构简图
3.喷雾撞击破碎
细胞悬浮液以喷雾状高速冻结（每分钟数千摄氏度）， 形成粒径小于5微米的微粒子。高速载气，氮气流速 300m/s，将冻结的微粒子送入破碎室，高速冲向撞
高速珠磨机
实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速 组织捣碎机、 Braun匀浆器； 中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理； 在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士 WAB公司和德国西门子机械公司制造）。
胶体磨
德国进口珠磨机
破碎作用方程
破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程，符合 下列公式： ln[1/(1-R)]=Kt 其中 R — 破碎率； K一 一级反应速度常数； t一 时间。 一级反应速度常数K与许多操作参数有关，如如 搅拌转速、细胞悬浮液的浓度和循环速度、玻璃 小珠的装量和珠体的直径，以及温度等。
第四章
微生物细胞的破碎
知识点：细胞壁的组成和结构，微生物细胞 的破碎技术，破碎率的测定。 重点：工业生产中常用的几种细胞破碎方法 的原理，操作过程及常用设备，并能就实际 生产情况予以合理的选择。
难点：常用破碎方法的合理选用。
一、细胞壁的组成和结构
为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解 各种微生物细胞壁的组成和结构（表1）：
操作条件的选择：
珠体大小——根据细胞大小、浓 搅拌转速——过高将 度以及连续操作时不使珠体带出 使能量消耗大增，而 来选择。 破碎率上升不明显。 珠体装量——装量少时，细胞不 能耗 易破碎；装量大时，能量消耗大， 研磨室热扩散性能降低，引起温 度升高。 R 温度——温度高时细胞较易破碎， 但要考虑目的产物不受破坏。一 般温度控制在5～40℃内时影响 较小。 n
机械破碎作用机制不同，有各自的适用范围和处理规
模。 适用范围：菌体细胞，目标产物。 破碎大肠杆菌提取质粒DNA，珠磨法完整质粒收得率 在90%,其他方法50%以下。因此针对目标产物性质
（分子量、分子形态、稳定性等）选择细胞破碎法，
并确定合适的操作条件非常重要。
机械破碎的缺点
需高能，并且产生高温和高的剪切力，容易使不稳定
例：单独用0.1mol/L盐酸胍处理E.coli仅释放约1%的蛋白质 0.5% TritonX-100处理蛋白质释放率为4% 二者合用，蛋白质释放率可达53%左右
珠磨法的破碎率一般控制在80%以下： 降低能耗 减少大分子目的产物的失活 减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易 分离而给后续操作带来的困难。
2.高压匀浆法（High-pressure homogenization） ——大规模细胞破碎的常用方法
采用高压匀浆器（由高压泵和匀浆阀组成，英国APV公司和美国 Microfluidics公司均有产品出售）。
原理：
利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲 击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时， 每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环 上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动 过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成 细胞破碎。
高压匀浆器
大、中、小型高压匀浆器
液体剪切作用
液体剪切作用 固体剪切作用
可达较高破碎率，可大规模操作，不适合 丝状菌和含有包含体的基因工程菌
对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作 破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目 的产物不适合
酶溶法 酶分解作用 具有高度专一性，条件温和，浆液易分离， 非 溶酶价格高，通用性差 机 械 化学渗透法 改变细胞膜的渗透性 具一定选择性，浆液易分离，但释放率较 低，通用性差 法 渗透压法 冻结融化法 干燥法 渗透压剧烈改变 反复冻结-融化 改变细胞膜渗透性 破碎率较低，常与其他方法结合使用 破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物 条件变化剧烈，易引起大分子物质失活
多聚糖 （80-90%） 脂类 蛋白质
细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结 构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不 及革兰氏阳性细菌的坚固；
酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密 程度和它的厚度；
由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构， 其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。
3.超声破碎法（Ultrasonication）
利用发射15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。 一般认为超声波破碎的机理是：在超声波作用下液体发生 空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和 剪切力，使细胞破碎。 一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌 的效果较差，该法在实验室小规模细胞破碎中常用（声能传递 和散热）。 超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。
影响超声对生物产品的回收有很多因素
（1）温度 避免方法 预冷 冷凝循环水 （2）游离基的生成等化学效应. 应对方式 添加游离基的清除剂{胱氨酸，谷胱甘肽或者利用氢 气顶吹细胞悬浮液来缓和}
微波破碎
基于微波加热的瞬时性、选择性、和高效性，控制适 宜的微波条件而实现。植物细胞不同部位的物质，对 微波的吸收能力存在显著差异。
5.化学渗透法（Chemical permeation）
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、 抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透 性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。 该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。
（1）表面活性剂
可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。
如Triton X-100是一种非离子型清洁剂，对疏水性物质 具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双 分子层，使某些胞内物质释放出来。 其他的表面活性剂，如牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠等也可 使细胞破碎。
（2）EDTA螯合剂
处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜
结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来
不同种类的细胞结构差别很大，破碎的难易程度也不同， 由难到易的大致排列顺序为：植物细胞＞真菌（如霉菌、 酵母菌）＞革兰氏阳性细菌＞革兰氏阴性细菌＞动物细胞。
二、常用破碎方法
分 类 作 用 机 理
固体剪切作用
适
应
性
珠磨法 机 械 法 高压匀浆法 超声破碎法 X-press法
可达较高破碎率，可较大规模操作，大分 子目的产物易失活，浆液分离困难
破碎的动力学方程为：ln[1／（l－R）]＝KNPα 其中 R——破碎率； K——与温度有关的速度常数； P一操作压力； N一悬浮液通过匀浆器阀的次数。 α——与微生物种类有关的常数； 破碎酵母菌,α值可取2. 2。可见，影响破碎的主要 因素是压力、温度和通过匀浆器阀的次数。
在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及高浓度 的细胞，常采用多次循环的操作方法。 一般说来，酵母菌较细菌难破碎，处于静止状态的细胞较 处于快速生长状态的细胞难破碎，在复合培养基上培养的 细胞比在简单合成培养基上培养的细胞较难破碎。
超声波破碎法
3.超声破碎法（Ultrasonication）
其破碎率的相关因素:
声频、声能； 处理时间 细胞浓度 菌种类型
与破碎效率直接相关的参数
振幅，与声能有关，直接影响蛋白释放的比速率
黏度，影响能耗，抑制空穴现象
表面张力，添加表面活性剂或者从细胞中释放出蛋白 质等活性物质，会显著影响超声破碎效率。起泡在气液界面上会使蛋白质变性或清除空穴现象。
微生物
壁厚/nm 层次
革兰氏阳性细菌 革兰氏阴性细菌
20-80 单层 10-13 多层
酵母菌
100-300 多层
霉菌
100-250 多层
主要组 成
肽聚糖 （40-90%） 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 （1-4%）
肽聚糖 （5-10%） 脂蛋白 脂多糖 （11-22%） 磷脂 蛋白质
葡聚糖 （30-40%） 甘露聚糖 （30%） 蛋白质 （6-8%） 脂类 （8.513.5%）
被处理悬浮液的体积。大体积需要高的声能引起强烈 的涡流和大气泡的形成。
与破碎效率直接相关的参数
珠粒的体积和直径，对于刚性细胞的粉碎常添加细小
的珠粒以产生辅助研磨效应。 探头的形状和材质，一般是钛金属材料。 细胞悬浮液的流速。
由于其局限性，在工业上一般不采用，主要是用于 实验室规模的细胞破碎。
维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子 将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷 脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。
（3）有机溶剂
能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂， 胞内物质被释放出来。 甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。
（4）变性剂
盐酸胍（Guanidine hydrochloride）和脲（Urea） 是常用的变性剂。 变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而 使疏水性化合物溶于水溶液。
产品失活。 破碎的有机体或者产物，非专一，产生碎片微粒尺寸 的大范围细分布，大量的细微颗粒给后续分离造成困 难。
4.酶溶法（Enzymatic Lysis）
（1）外加酶法
溶菌酶 溶菌酶主要用于细菌类 β-1，3-葡聚糖酶 β-1，6-葡聚糖酶 蛋白酶 甘露糖酶 糖苷酶 肽键内切酶 壳多糖酶等
常用的溶酶
细胞壁溶解酶是几种酶的复合物
利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学 组成选择适当的酶，并确定相应的次序。
如：对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露 聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层， 最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破 裂，释出胞内产物。
细胞破碎机理图
1.珠磨法（Bead mill）
原理：
进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化 铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨 剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放 出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内， 浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹 套冷却的方式带走。