电子显微镜技术1

2.电子透镜的种类
静电电子透镜(electrostatic lens) 电子透镜 恒磁透镜 磁电子透镜 (magnetic lens) 电磁透镜 (electro-static lens)
电磁透镜的发展（分类）: 螺线管线圈 包壳透镜 极靴透镜(lens with pole peas)
3.结构 导线：提供电流，产生磁场 极靴透镜
3、增加反差的方法 降低加速电压 适当增加样品的厚度 用重金属盐溶液如锇、钨、锰、铅等为 染色剂对样品染色 利用物镜光阑
第三节 TEM的使用和调整
五.工作条件的选择
加速电压和物镜光阑的选择
第三章 TEM的样品制备技术
第一节 TEM对样品的要求和处理措施
原因 要求 脱水 措施 高真空（灯丝、电子穿透力） 所以要求样品在真空 中无挥发物 电子束穿透力弱 电子束打击力强样品易变形 浸没式的脱水、固定
取材 固定
（渗透） 脱水 包埋 （聚合）
切片
染色
一、取材 1、取材的原则
准确 迅速 防损伤 低温 体积小
２、取材的方法
（1）动物材料：边固定边取样 （2）植物材料：先取样、后固定 （3）体外培养细胞及其它单体材料 离心法；琼脂预包埋法；琼脂铸膜法 (4) 骨组织的取材 取材 预固定 漂洗 脱钙 后固定
观察记录系统
（一）照明系统：电子枪（electron gun)和聚光镜
（condenser len,CL)
阴极（Filament,Cathode)：加热后，提供热电子 1.电子枪 栅极(Wehnelt,Grid)：控制电子束的形状 阳极(Anode)：提供加速电压
2.聚光镜: 聚光镜、光阑、偏转线圈、消像散器 聚光镜的结构：极靴透镜 聚光镜的作用：将电子束无能量损失的汇聚在 样品上
10
50
100
1000
λ (nm)
0.123
0.012 0.0053 0.0037 0.0009
电磁透镜(electronmagnetic lens)
1.概念：高速运动的电子在电磁线圈通电产生的电场或 磁场的作用下会发生折射、偏转并且聚焦，就如同 普通的可见光通过光学凸透镜被折射聚焦一样，这 种电磁线圈被称为电磁透镜。
Ruska的电镜
三、其它显微技术 1.扫描探针显微镜(SPM):
扫描隧道显微镜(STM) 原子力显微镜(AFM)
百度文库
2.激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)
3.显微技术:采用一系列技术手段，通过特定仪器装备， 显示、观察、研究微小肉眼看不见的微观世界结构、 功能的技术总称。
四、课程体系
电镜的结构、使用
5.常用固定方法：戊二醛- 锇酸双重固定法
6.常用缓冲液
缓冲液的作用：用来配制固定液，防止样品变形 两次过程之间需要用缓冲液漂洗 (1)磷酸钠缓冲液
(2)巴比妥——醋酸等渗缓冲液
(3)二甲砷酸盐缓冲液
三、脱水：用脱水剂置换样品中的水份的过程 1、目的：
（1）含水的样品在真空中蒸发时，一方面降低了电 镜的真空度，另一方面，样品是水份蒸发时易变形。 （2）利于包埋剂的渗透
（2）常用固定液特点：
1）戊二醛固定液： 优点：渗透力强，渗透速度快； 能良好地保存糖元、核酸、核蛋白、细胞 基质； 较好保存抗原，适合于细胞化学的研究； 可长期保存样品； 使用条件较宽容，适用范围广； 用缓冲液配制成 2%－3％的戊二醛固定 液。 缺点：不能保存脂肪，对膜的固定效果差； 无电子染色作用；对缓冲液的要求较高。
2、机械泵及工作原理
2、扩散泵及工作原理
扩散泵工作的条件：低真空背景压 冷却循环水
三、电气系统 小电流高电压：加速电子和加热灯丝 大电流低电压：各级电磁透镜成像
要求这两种电源必须非常稳定，要经过二级稳压， 这是因为任何极微小的波动，都会改变电子束的波长， 从而影响成像质量和降低分辨率。
第二节
一、反差成像
TEM的成像原理
不同
振幅反差:光强的差别形成
色反差：光波长的差别形成
不同
二、TEM的成像原理 1、成像信号：
直接透射电子 小角度弹性散射电子 非弹性散射电子
2、电镜反差类型 振幅反差(amplitude contrast)
质量 厚度大
质量 厚度小
散射 能力强
散射 能力弱
散射 角度大
(1)电镜仪器的发展:分辨本领的提高和功能的改进
(2)样品制备技术的发展:
复杂
简单
3.电镜技术的未来
第二章 透射电子显微镜
第一节 透射电镜的结构
(Transmission Electron Microscope)
电子光学部分
透 射 电 镜
真空部分
供电部分
照明系统
电 子 光 学 系 统
样品室
成像系统
（三）成像放大系统
物镜、物镜光阑、偏转线圈、消像散 中间镜 投影镜 减小相差 物镜光阑又称为反差光阑，其作用为 增加反差 TEM的放大倍数=物镜×中间镜1×中间镜2×投影镜 （四）观察、记录系统 荧光屏上观察 底片记录 焦深的概念
二、真空排气系统
（一）真空的必要性 气体分子会与高速运动的电子碰撞，引起“弦光”并使成 像的反差偏低。这种碰撞还会使气体电离放电，并产生 “闪烁”现象。 波长短的入射光不能穿透空气 残余的气体还会污染样品的表面，再次降低成像的质量。 灼热的灯丝遇到气体会受到腐蚀而容易断裂。 因此，为了提高成像质量和延长灯丝寿命，使镜筒内保 持高真空是必要的。
（二）真空的获得 1、电镜的真空系统包括真空泵、阀门、真空管 道和检测装置 检测装置 旋转泵
大气 10万P 760Torr 低真空 0.1P 10-3Torr
扩散泵
镜筒
高真空 10-3-10-5P 10-5-10-7Torr
TEM有真空检测装置，当镜筒中的真空度下降时， 高压电路自动中断，同时开启真空泵。
2、常用脱水剂
（1）选择 （2）常用脱水剂：乙醇或丙酮
3、方法：浓度梯度逐级置换的方法，每级大约15分钟
四、包埋：包括浸透、包埋和聚合三步。 1.方法
（1）浸透 目的： 用包埋剂逐步替代样品中的脱水剂，使包埋剂填充 样品结构中的空间，硬化后可支撑样品保持其原有形态。 （2）包埋 目的：电镜的样品块约1mm见方，体积太小不便于夹持切片， 将其包裹于较大物体中，形成一整体便于切片操作。 模具：常用药用胶囊、 包埋模板
软铁：包围导线，屏蔽作用，集中磁场
小孔极靴：进一步集中磁场，
增加会聚作用，
形成短焦距高倍透镜
4.场深和焦深 场深(depth of space site,Ds):也称景深,是一种 轴向距离,在给出清晰的像的前提下,允许 样品的位置可变动的最大距离。 焦深(depth of focus,Df):也是一种轴向距离， 在保持样品不变的位置，给出清晰的像的 前提下，允许像的位置可变动的最大距离 范围。
（3）显微镜的放大倍数
有效放大倍数(useful magnification,Mu)：显微镜的 分辨本领或图像的极限分辨率放大到人眼的分辨本领所 需要的最小放大倍数。 MU=放大后的距离/放大前的距离 =人眼睛的分辨本领/显微镜的分辨本领 M光镜=0.2mm/0.2um=1000倍 M电镜=0.2mm/0.2nm=106倍
生物学电子显微镜技术
Biology electron microscope technology
课程性质：应用技术 授课方式： 理论：基本原理 基本概念 实验：基本操作 关键技术 考试形式：开卷考试
第一章
1.认识世界的方法 形态学:宏观(眼睛观察) 微观(显微技术) 化学组成:分析化学
绪
论
一、光镜的产生及发展
样品切片厚度<0.1µm 超薄切片 样品结实 脱水、固定时易浸透 固定、包埋 取材小 重金属染色
样品组成元素原子系数小---- 增加反差 -样品反差小
第二节 超薄切片样品制备技术
• 超薄切片技术是透射电镜最基本的生物样品制备 技术；切片的厚度小于0.1μm。
普通超薄切片 • 分类 冷冻超薄切片 • 超薄切片流程：
光学显微镜 电子显微镜
2.形态学的观测方法:
工具 分辨本领 肉眼 0.2mm 研究对象 动植物器官 大小 >100 µm 相应学科
解剖学 分类学 组织学 细胞学 微生物学
动植物组织器官 10~100 µm 光镜 0.2 µm 细胞、细菌 大细胞器 细胞器微观结构 及其分子结构 电镜 0.2nm 生物大分子 原子、原子晶格 ~1nm 0.1nm 0.2~10 µm
1 2 3 4 5 6
直接透射电子 弹性散射电子 非弹性散射电子 二次电子 X射线 反射电子
电子信号
直接透射电子 弹性散射电子 非弹性散射电子 二次电子 X－射线 反射电子
产生方式
成像作用
入射电子不与核、核外电 TEM 子发生碰撞 TEM 入射电子与原子核碰撞 入射电子与核外电子碰撞 TEM 样品表面电子受激发产生 SEM 样品原子跃迁产生 入射电子反射而产生 X－射线分 析仪 SEM
二、固定(Fixation) 1.固定的概念：用物理或化学的方法快速 杀死细胞的过程。 2.固定的原理：通过固定剂的作用使蛋白质、脂 质等生物大分子发生某种交联，阻止细胞自溶， 稳定细胞化学成份和超微结构。 3.固定的方法 根据固定液的成份分为 单固定 双固定 多固定
灌流固定 根据固定方式可分为 原位固定 浸没固定 4.常用固定剂 （1）固定液的选择：固定液的渗透力强 固定效果好
< 0.2 µm
病毒学 免疫学 分子生物学
3.光学显微技术的发展
4.光学显微技术的局限性
（1）分辨本领和分辨率 分辨本领:反映一个光学系统性能的最重要的指标,它用该光学系统的 能分辨清的两点间的最小距离来表示。
分辨率:是表示图象清晰程度的指标,是指图象中能分辨清的两点间的 实际最小距离.
2）四氧化锇：俗称锇酸。
优点：对脂类、蛋白质和磷脂蛋白的固定较好； 增加样品的反差。 缺点：渗透速率较醛类慢，所以常用于后固定； 不固定糖原和核酸； 其水溶液在室温下易挥发，有毒性； 使用浓度为1%水溶液； 固定时间不易过长，否则易使样品变脆。 3）高锰酸钾：对脂蛋白的固定较好，如神经髓鞘、叶绿体 和各种膜结构。3%工作浓度，4℃固定2小时。
微生物学中 的各种细菌
T4噬菌体
生化、生理学：蛋白质、核酸、酶的结构
医 学 应 用：
HIV
SARS
H5N1 Infection
农 林 应 用：
柞蚕卵背纹气孔 粟蚕卵精孔
拟南芥上表皮毛
拟南芥茎上的气孔
植物的寄生线虫
小白鼠的毛
花粉粒
材料学：微结构、生物陶瓷、生物矿物等 刑侦科学：
2.电镜技术的发展
3.电子显微镜的特点： 电子波；电磁透镜；电子显微信号
1.发现
1924年法国科学家De.Broglie证明: 任何一种粒子当它们在快速运动的时候均为波，且波长 为λ=h/mv 。
2.理论计算
λ =12.25/ V1/2 即λ ∝1/ V 加速电压V越大,波长越短,仪器的分辨本领越高
V (千伏) 0.1
散射 角度小
透过光阑的 电子少
透过光阑的 电子多
暗区 明区
振幅反差主要对厚样品的成像起作用， 同时物镜光阑在反差成像中起重要作用
位相反差（phase contrast) 对薄的样品成像起作用
成像信号 作用范围 物镜光阑
振幅反差 散射电子 厚的样品 小孔径
位相反差 透射和散 薄的样品 大孔径 射电子
无效放大：超过有效放大倍数的放大称为无效放大， 又称为空放大。
二、电子显微镜的产生
1.电子显微镜产生的理论基础
1924 德布罗利 电子波 1926 布什 电磁透镜 1931 Ruska 电子显微镜
2.电子显微镜的分类（电子显微信号）
根据电子束和样品互相作用的方式 : TEM和SEM TEM SEM AEM TSEM 高分辨的TEM、SEM HVEM ESEM
透射电镜 （TEM）
扫描电镜 （SEM）
电镜技术
电镜的生物样品 制备技术
TEM： 超薄切片 负染色 冷冻制样技术 免疫电镜技术 生物大分子电镜技术 SEM： 干燥技术 金属镀膜技术
LSCM技术
离心技术
五、电镜技术的应用与未来
1.电镜技术的应用 生命科学: 组织学、细胞学
Human’s Egg and Sperm
（2）阿贝公式 δ=0.61λ/n*sinα=0.61λ/NA 其中， δ：分辨本领 λ：入射光波长 n ：透镜所在介质的折射率 α：入射孔径角的一半 NA：数值孔径 当NA=1.2时, δ= 0.5λ λ为决定分辨本领的因素,分辨本领约为入射光波长的1/2 提高显微镜分辨本领的方法：电镜的波长<光镜的波长