无菌检查方法验证告报告2015课件
《无菌检验方法验证》课件
无菌检验方法验证的目的
在本节中，我们将阐明无菌检验方法验证的目的和重要性，以及验证结果对 无菌产品质量的影响。
方法证的无菌检验方法。
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步骤二
制定验证计划和实施方案，包括验证样品的选择和实验室条件的准备。
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步骤三
进行实际的验证实验，收集和记录数据。
《无菌检验方法验证》 PPT课件
欢迎大家参加今天的课程！在这个课件中，我们将深入探讨无菌检验方法验 证的重要性和步骤，帮助您更好地理解这一关键概念。
概述
本节将介绍无菌检验方法验证的基本概念和背景，以及其在医疗和制药领域 中的重要性。
无菌检验的定义和意义
这一部分将详细说明无菌检验的定义和意义，以及无菌状态在医疗设备和药品生产中的关键作用。
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步骤四
数据分析和结果解释，评估无菌检验方法的准确性和有效性。
验证设计和执行
验证设计
根据验证目标和要求，选择合适 的无菌检验设备和方法。
验证执行
由经过培训和资质认证的人员执 行验证实验，确保实验过程的准 确性和可靠性。
验证报告
记录并总结验证过程的结果和结 论，生成详细的验证报告。
结果分析和解释
在本节中，我们将分析和解释验证结果，评估无菌检验方法的优缺点以及改 进措施。
结论和建议
最后，我们将通过对整个无菌检验方法验证过程的总结，给出结论和建议， 以帮助您更好地应用于实际工作中。
药品无菌检查方法的验证试验讲义(ppt 27页)
大豆－胰酪胨培养基
培养基灵敏度检查
与方法验证用菌株 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌；生孢梭菌；白色念珠菌、
黑曲霉
检验方法
只要供试品性状允许，
性状允许的样品均可采用薄膜过滤，
应采用薄膜过滤法
利于抗菌影响去除
稀释剂与
薄膜过滤冲洗液 0.1％蛋白胨水溶液； A、D、K
0.1％蛋白胨水溶液（ 0.1％
• 根据上述验证试验结果可知，氯化 钠注射液的无菌检查，不需冲洗，以金 黄色葡萄球菌为阳性对照菌。本方法适 合于氯化钠注射液的无菌检查，即氯化 钠注射液的无菌检查法通过验证。
六、注意事项
1. 预试验 2. 稀释液与冲洗液: 作用、种类、冲洗量 3. 菌液: 保存、加入方式、加入量 4. 具有抗菌活性的供试品 5.滤膜： 选择、种类 6.对照菌: 根据供试品的特性来选择(抗生素根
的。单倍量重试)
二．方法验证试验建立及要求
验证实际是伴随着整个试验过程， 试验过程中的每一个环节都应该有合理 的证明，以确保在实际检验条件下，该 供试品的无菌检查法的可靠性。
主要内容 怎么做: 一选方法二看性质三除
抑菌性四计菌数五定取样量
• 注意什么: 七注意
怎么做
一 选定试验方法: 可靠、稳定、简便
2005年版无菌检查法主要方面与USP、BP的比较
比较项目
ChP2005
USP29
BP2002
检验条件规定
总体10000级、局部100级
无具体规定
无具体规定
人员要求
无具体规定
正确培训和认可
细菌检查培养基 硫乙醇酸盐流体培养基
硫乙醇酸盐流体培养基
硫乙醇酸盐流体培
养基
2015版中国药典无菌检查法课件
（二）、无菌检查的特点和意义 由于抽样概率的限制，通过无菌检查发现产品 微生物污染的可能性极低，而当前坚持无菌检查的 意义在于： 产品上市前发现重大污染事件的最后一道关口； 通过无菌检查的执行情况可以窥视其无菌控制存 在的问题。
三、无菌检查法的有关概念和新理念
(三)、无菌检查的新理念 1.全过程控制
（二）中国药典无菌检查法的发展 1953年版 1963年版
直接接种 法 直接接种法 无阳性对照菌 三种培养基培养基 阳性对照－金葡
1977年版 培养基质量检查－金 葡、 白念。 阳性对照－金葡
培养基质量检查－藤黄、 生孢、白念。 2支（瓶） 或以上 直接接种法 4管+2管+1管 薄膜过滤法 膜剪4片，2+1+1 1990版－金葡10－6
2015版《中国药典》 无菌检查法
主要内容
一、药品无菌检查所面临的形势 二、无菌检查法的发展历史 三、无菌检查法的有关概念和新理念 四、2015年版《中国药典》无菌检查法的重大修订 五、2015年版《中国药典》无菌检查法 六、医院制剂进行微生物控制的必要性
一.药品微生物检验所面临的形势
1.医药产品的发展 2.注射用药品的挑战 3.药品微生物污染的反思 4.2015版中国药典的修订
12Biblioteka 三、无菌检查法的有关概念和新理念
（一)、 无菌检查法的有关概念
5、无菌技术 是指在微生物试验工作中，控制或防止 各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施， 其中包括无菌环境设施、无菌试验器材及无菌操作。 6、无菌检查法的局限性 若供试品符合无菌检查法的
规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。也 就是无菌试验并不能用于保证整批产品的无菌性，但是它可 用于确定批产品不符合无菌要求。
无菌检查方法验证告报告2015
无菌检查方法验证告报告2015
无菌检查方法验证报告2015
1. 目的
本报告旨在介绍无菌检查方法验证报告2015，该报告是根据企业生产的产品特点，结合国内外相关法规要求，制定的一种无菌检查方法。
2. 范围
本报告适用于企业生产的一系列产品，这些产品都具有相同的特点，需要进行无菌检查。
3. 无菌检查方法验证过程
在本报告中，我们介绍了如何对无菌检查方法进行验证的过程。
首先，我们需要对试验样品进行灭菌处理，然后将其放入无菌环境中进行试验。
在此过程中，我们需要严格控制各种影响因素，以确保试验结果的可靠性。
最后，我们需要对试验结果进行分析和总结，以确定该无菌检查方法的可行性。
4. 结果与分析
在本报告中，我们介绍了无菌检查方法验证的结果。
通过试验，我们发现该无菌检查方法可以有效地检测出产品中的微生物，并且试验结果稳定可靠。
因此，我们可以认为该无菌检查方法可以用于企业的生产过程中。
5. 结论
综上所述，本报告介绍了一种有效的无菌检查方法验证报告2015。
该方法可以有效地检测出产品中的微生物，并且具有较高的可靠性。
4无菌检验方法验证 PPT课件
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无菌检验方法验证
无菌检验方法 验证的意义
1.符合国家药典标准，与先进国家的药典和药品 技术审评接轨 2.是分析测量科学的基本要求，是各种法规遵循 工作的基础。 3.通过验证试验，可对每种药品的具体检验方法 的可靠性和结果的准确性予以确认，从而形成标 准化的操作。 4.通过对同品种，但不同批号或不同生产厂家的 产品的微生物学验证试验比较，可以发现产品所用 原料质量或工艺流程中是否存在污染抑菌物质的 YOUR SITE HERE 问题，具有药品质量控制的意义。
2、样品的前处理方法 为达到制备成均匀的供试液及为后续采取消除抑菌活 性的方法作准备，将所采取的前处理方法应用和参加 到验证试验中，以证明所用处理方法对各试验菌的生 长无影响。 按供试品的性状选用以下适宜的方法，或几种方法联 合使用：
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无菌检验方法验证
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方法二：用实验确定是否具有抑菌性的方法 在规定量的供试液中加入实验用微生物10~100个， 如微生物生长良好，即说明供试品对该种微生物无抑 菌活性。如已用药典规定的各试验菌试验，结果均能 生长良好，说明供试品无抑菌性，可用常规方法检验 之。将这些试验记录在案——就是证明该供试品无抑 菌性的验证试验部分；如加入的微生物不生长或生长 缓慢，说明供试品有抑菌性，将这些试验记录在案— —就是证明该供试品有抑菌性的验证试验部分；如加 入的微生物中有某一种菌最不能生长或生长最缓慢， 这一种菌就是该样品的敏感菌。
4.four
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无菌检验方法验证
验证的重点环节
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无菌检验法验证
验证报告的重点
2015年版药典 无菌检查法
灵敏度检査 菌 种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过 5 代(从 菌 种 保 存 中 心 获 得 的 干 燥 菌 种 为 第 0 代 ），并 采 用 适 宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验 菌株的 生物 学特 性。 金 黄 色 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus aureus ) C C M C C (B) 26 003〕 铜 绿 假 单 胞 菌 （Pseudomonas aeruginosa ) C C M C C ( B) 10 104〕 枯 草 芽 孢 杆 菌 仏 5)〔C M C C ( B ) 6 3 501〕 生 抱 梭 菌 sporogenes) C C M C C ( B ) 64 941〕 白 色 念 珠 菌 albicans) C C M C C ( F ) 98 001〕 黑 曲 霉 n ig e r) C C M C C ( F ) 98 003〕 苗 液 制 备 接 种 金 黄 色 葡 萄 球 菌 、铜 绿 假 单 胞 菌 、枯草 芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大 豆 胨 琼 脂 培 养 基 上 ，接 种 生 孢 梭 菌 的 新 鲜 培 养 物 至 硫 乙 醇 酸 盐 流 体 培 养 基 中 ，30〜 35°C培 养 18〜 2 4 小 时 ；接 种 白 色 念 珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖 琼 脂 培 养 基 上 ，20〜 25°C培 养 24〜 4 8 小 时 ，上 述 培 养 物 用 PH7. 0 无 菌 氣 化 钠 -蛋 白 胨 缓 冲 液 或 0. 9% 无 菌 氣 化 钠 溶 液 制 成 每 l m l 含 菌 数 小 于 lOOcfu( 菌 落 形 成 单 位 ）的 菌 悬 液 。接 种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上， 20〜25*C培 养 5〜7 天 ，加 人 3〜 5 m l含 a 0 5 % (m l/m l) 聚山 梨 酯 8 0 的 pH7. 0 无 菌 氣 化 钠 -蛋 白 胨 缓 冲 液 或 0. 9 % 无 菌 氣 化 钠 溶 液 ，将 孢 子 洗 脱 。然 后 ，采 用 适 宜 的 方 法 吸 出 孢 子 悬 液 至 无 菌 试 管 内 ，用 含 0.05% ( m l/m l) 聚 山 梨 醋 8 0 的 pH7. 0 无 菌 氣 化 钠 -蛋 白 胨 缓 冲 液 或 0. 9 % 无 菌 氣 化 钠 溶 液 制 成 每 l m l 含 孢 子 数 小 于 lOOcfu的 孢 子 悬 液 。 菌 悬 液 若 在 室 温 下 放 置 ，应 在 2 小 时 内 使 用 ；若 保 存 在 2〜8°C可 在 2 4 小 时 内 使 用 。黑 曲 霉 孢 子 悬 液 可 保 存 在 2 〜 8°C，在 验 证 过 的 贮 存 期 内 使 用 。 培 养 基 接 种 取 每 管 装 量 为 12ml的硫乙醇酸盐流体培 养 基 7 支 ，分 别 接 种 小 于 lO O c fu 的 金 黄 色 葡 萄 球 菌 、铜 绿 假 单胞菌、生 孢 梭 菌 各 2 支 ，另 1 支 不 接 种 作 为 空 白 对 照 ，培 养 3 天 ；取 每 管 装 量 为 9 m l的 胰 酪 大 豆 胨 液 体 培 养 基 7 支 ，分 别接种小 于lOOcfu的 枯 草 芽 孢 杆 菌 、白 色 念 珠 菌 、黑 曲 霉 各 2 支，另 1 支不接种作为空白对照，培 养 5 天 。逐 日观 察结果。 结 果 判 定 空 白 对 照 管 应 无 菌 生 长 ，若 加 菌 的 培 养 基 管 均 生 长 良 好 ，判 该 培 养 基 的 灵 敏 度 检 查 符 合 规 定 。
无菌检查法试验具体操作方法PPT课件
工作环境的污染
实验器材的污 染
培养基的污染
支原体 污染源
操作者本身的污染 某些支原体在人体 是正常菌群
制备细胞的原始组织 或器官的污染
四、具体检测方法
❖ 图为GHK细胞
当支原体污染后，因为它们不 会使细胞死亡可以与细胞长期 共存，培养基一般不发生浑浊， 细胞无明显变化，外观上给人 以正常感觉。
实则细胞受到多方面潜在影响， 如引起细胞变形，抑制细胞生 长等。
❖ 对热比较敏感，对一般抗生素不敏感。 ❖ 通常，滤过除菌的方法对支原体是没有作用的。
四、具体检测方法
❖ 细胞培养（特别是传代细胞）被支原体污染是 个世界性问题。
❖ 在细胞培养中支原体感染发生率达到63%，国 内外研究表明，大约有二十多种支原体能污染 细胞，有的细胞株可以同时污染两种以上的支 原体。
三、无菌操作要求及注意事项
4.吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留 在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有 害物带入培养基中。 开启、关闭供试品时，火焰灭菌时间要短，防止因 温度过高灭活供试品。 另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有 毒气体，危害供试品。
5.进行试验时，吸管抽取供试品后，要与培养基试管 平行且垂直，动作要准确敏捷，但又不必太快，以 防空气流动，增加污染机会。
无菌试验对培养基的质量要求高，应选用完全透明无 沉淀的培养基，确认检查合格后放入试管架中，置操 作间，方可使用。
二、试验物品准备
❖在选取培养基时，放于眼 前细致观察（包括PH值，装 量是否一致、试管有无裂痕） ❖因培养基在搬运过程中， 容易造成个别试管胶栓松动， 从而影响PH值的细微变化。 ❖如不细致察看，在试验中 会存有很大的隐患，影响结 果的判定。
无菌检查ppt课件
精选编辑ppt
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三、检测环境
GB/T 14233.2-2005：无 菌室操作台或超净工作 台局部应符合洁净度100 级单向流空气区域要求。
单向流空气 、工作台面及环境应定 期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、 浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国 家标准进行洁净度确认。隔离系统应 定期按相关的要求进行验证，其内部 环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
试验组 阳性对照组
试验组 阳性对照组
试验组 阳性对照组
试验组
—— √
—— √
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枯草 白念 白念 黑曲霉 黑曲霉
胰酪大豆胨液 体培养基
阳性对照组 试验组
阳性对照组 试验组
阳性对照组
培养
30~35℃ 不得超过5天
20~25℃ 不得超过5天
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八、验证方法——结果判断
与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则 说明供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作 用可以忽略不计，照此检查方法和检查条件进行供试品的无菌 检査。
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十、日常无菌检查
准备间
无菌检查室
培养基、 供试品、 灭菌物 品的准
备
供试品接入培 养基
FTM+供:2管 TSB+供:1管 阴性:各1管 （FTM、TSB）
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阳性对照室
取其中一管 FTM+供，加入
1~100cfu 金黄色葡萄球
菌
准备间
FTM+阴:30~35℃ TSB+阴:20~25℃
微生物限度和无菌检查法验证PPT教学课件
2020/12/09
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中国药典2005年版对微生物限度检查法和无菌 检查法进行了修订完善，明确规定进行药微生物 限度和无菌检查法验证目的是确认试验中应选择 药典收载的何种供试液制备方法、何种测定方法， 以及验证确定的检测系统是否适用于该药品的检 验。如果供试品有抑菌性，影响测定结果，则应 采用适当的方法消除供试液的抑菌活性后再进行 检查。也就是说，只有通过方法验证，才能确定 针对具体品种的具体的检验方法，保证采用的方 法的科学性和检验结果的准确性。
适宜、简单有效的消除抑菌性的方法是当前验证 工作的关键。Βιβλιοθήκη 2020/12/096
方法验证的步骤与内容 1、制备验证试验用菌液 按药典无菌检查法中培养基灵敏度检查项中试验用 菌液的制备方法将规定需用的试验菌分别制成每毫 升中含10～100个菌（CFU）的供试菌液。 2、样品的前处理方法 样品的前处理方法是验证试验的一部分，需证明所 用的处理方法对各试验菌的生长无影响。
微生物限度和无菌检查法验证
2020/12/09
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微生物限度和无菌检查法验证意义：
中国药典2000年版及以前的版本虽然收载了微生 物限度检查法和无菌检查法，但在如何保证检验方 法的科学性及检验结果的准确性方面存在一些问题， 与国外药典的相关要求比较有一定差距，关键是未 明确对检验方法进行必要的方法学验证。以前品种 的申报资料中一般仅提供微生物限度检查或无菌检 查的检查结果，无方法学验证内容。但从保证药品 安全性的实际出发，不同品种需要选择建立各自适 当的检查方法，即使是仿制药，由于不同生产企业 采用的工艺、辅料等的不同，其产品可能表现出不 同的抑菌特性，进行微生物限度检查或无菌检查时， 具体的检查方法也不能简单地照搬，需要通过试验 验证核实已有的试验方法和检测系统是否适用，因 此，也需要进行必要的方法验证。
无菌微生物限度检查及方法验证.ppt
• 实验人员进入洁净室（无菌室）不得化妆、戴手表、戒指等首饰；不得 吃东西。应严格按更衣程序更衣。
• 记录温湿度是否在规定的范围内，每次实验时，对操作室和层流台做微 生物沉降菌落计数并记录；如发现问题应找原因，及时报修和报告并将 报修原因和结果记录归档。如遇停电，应立即停止实验，重新进入无菌 室前，至少开启机房运转1小时以上。
菌种的传代和保藏
菌种的保藏方法
• 使菌种的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，从而在一定时间内 不发生变异并保持生命活力。
• 一般来说，低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的三个 重要因素
• 无论使用那种菌种保藏方法，都应进行验证，以确保在相应保存条 件下的菌种不会变异并且性能稳定。
• 菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代（GMP，药 典）
微生物实验室应制定菌种的保藏管理规程来规范菌种的来源、申购、保 管、转种传代、存储和领用等方面的要求，确保菌种的溯源性和稳定性； 防止试验用菌种因多次传代而失去典型生物学特征发生变异或死亡，保 证菌种长期正确、稳定，从而确保实验的灵敏度和重现性。
微生物实验室的质量管理
•菌种保存应有专人负责，加锁保存于冰箱中。 •实验室的标准菌株应来自CMCC（中国药品生物制品检定所医学菌种保 藏中心或ATCC（美国菌种保藏中心）等国际法定菌种保藏机构。有接 收、确认记录。 •菌种的转种等均应在超净工作台进行，以防污染。 •各种菌种应按规定时间接种，所有保藏的菌种均应贴有相应的标签，有 菌种清单。
• 培养箱、冰箱需在设备的每个腔室内放置经校准过的玻璃温度计，每天 检查设备腔室内的温度状况并且在日志上做好相应的记录。定期回顾每 个设备的温度记录数据，以考察设备的运行状态。
无菌检验方法验证报告
文件制修订记录1. 概述：无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
本公司的无菌检查只是针对于灭菌注射用水的无菌检查。
灭菌注射用水灭菌工艺采用121℃30min过度杀菌法，按照2005年版《中国药典》的规定，注射剂的无菌检查应采用薄膜过滤法。
制定的《无菌检查法标准操作规程》（SOP4.14.038-B）应经过验证后，才能批准使用。
2. 验证目的：验证所采用的方法和条件是否适合于供试品的无菌检查。
即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不计。
3. 验证范围：适用于灭菌注射用水无菌检查法的验证。
4. 验证人员及职责质量部负责该验证方案的起草及组织实施；验证小组负责验证方案的审批；质量部参与验证的实施及监督。
5. 文件准备和培训检查验证所需的各类文件资料，应齐全；相关的文件草案是否已具备。
6.1. 无菌检查室空气净化系统已经过验证并合格，仪器安装完成；仪表量器经过校验合格，且在有效期内。
6.2. 供试品：3批，批号：批号：批号：6.3. 培养基及试剂：6.3.1. 试剂试液：氯化钠:临用前配成0.9%浓度的溶液，配制记录见附件1。
冲洗液：0.1%蛋白胨水溶液，配制记录见附件2。
6.3.2. 培养基硫乙醇酸盐流体培养基生产厂家：批号：改良马丁培养基生产厂家：批号：营养肉汤培养基生产厂家：批号：改良马丁琼脂培养基生产厂家：批号：蛋白胨生产厂家：批号：培养基配制记录见附件3。
6.4. 验证用菌株：金黄色葡萄球菌【CMCC（B）26003】铜绿假单胞菌【CMCC（B）10104】枯草芽孢杆菌【CMCC（B）63501】生孢梭菌【CMCC（B）64941】白色念珠菌【CMCC（F）98001】黑曲霉【CMCC（F）98003】购自：各验证用菌种传代记录见附件4。
6.5. 无菌检验仪器及相关设备：压力蒸汽灭菌器型号：生产厂家：校验日期：有效期：生化培养箱（细菌培养）型号：生产厂家：校验日期：有效期：生化培养箱（霉菌培养）型号：生产厂家：校验日期：有效期：7. 验证内容：7.1. 培养基无菌性检查：每批培养基随机取不少于5支，培养14天，应无菌生长。
无菌、微生物检查法方法学验证实例 PPT课件
操作方法 菌液制备：
取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大 肠埃希菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物少许 接种至营养肉汤培养基中 , 生孢梭菌的新鲜 培养物少许接种至硫乙醇酸盐流体培养基中, 32.5±2.5℃培养18～24小时；
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取经 32.5±2.5℃ 培养 19~21h小时的大肠 埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、 铜绿假单孢菌肉汤培养物1ml，加9ml生理盐 水，10倍稀释至约10-5~10-8之间。 取经36℃培养18~22h的生孢梭菌硫乙醇 酸盐流体培养基培养物1ml，加9ml生理盐水 ，10倍稀释至10-6，混匀备用。
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头孢噻肟钠无菌原料的无菌实验方法验证
• 样品：头孢噻肟钠无菌原料，规格：0.5g/瓶； 批号：40807001；生产单位：Aventis Pharma Deutschland GmbH
• 培养基：硫乙醇酸盐流体培养基、真菌培养基、 营养肉汤、普通斜面、真菌斜面、营养琼脂、 虎红琼脂(均由中国药品生物制品检定所培养 基室提供)
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结论： 根据上述结果，由于采用直接接种 法进行虎杖苷注射液的无菌检查，存在 对金黄色葡萄球菌和枯草杆菌ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ长的抑 制作用。因此，虎杖苷注射液的无菌检 查应依据中国药典无菌检查方法中的薄 膜过滤法进行，冲洗量规定为500ml。
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• 方法：中国药典2005版无菌检查中薄膜 过滤法方法验证 • 验证试验用菌种：验证试验用菌种包括 金黄色葡萄球菌（26003）、铜绿假单胞 菌（10104）、枯草芽孢杆菌（63501）、 生孢梭菌（64941）、白色念珠菌 （98001）、黑曲霉菌（98003），来自 中国医学细菌保藏中心。
中国药典2015版无菌检查方法适用性试验（直接接种法）
中国药典2015版⽆菌检查⽅法适⽤性试验（直接接种法）*********公司*********产品⽆菌检查⽅法适⽤性试验1、样品信息2、培养基及试剂3、菌种基本信息：4、菌液制备：2.1接种⾦黄⾊葡萄球菌、⼤肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物⾄胰酪⼤⾖胨培养基中或胰酪⼤⾖胨脂培养基上，30～35℃培养18～24⼩时，培养物⽤0.9%⽆菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数⼩于100cfu的菌悬液。
2.2接种⽣孢梭菌的新鲜培养物⾄硫⼄醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24⼩时，培养物⽤0.9%⽆菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数⼩于100cfu的菌悬液。
2.3接种⽩⾊念珠菌的新鲜培养物⾄沙⽒葡萄糖液体培养基或沙⽒葡萄糖琼脂斜⾯培养基上，20～25℃培养24～48⼩时，培养物⽤0.9%⽆菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数⼩于100cfu的菌悬液。
2.4接种⿊曲霉菌的新鲜培养物接种⾄沙⽒葡萄糖琼脂斜⾯培养基上，20～25℃培养5～7天，加⼊3～5ml含0.05%（ml/ml）聚⼭梨酯80的0.9%⽆菌氯化钠溶液，将孢⼦洗脱。
然后，采⽤适宜的⽅法吸出孢⼦悬液⾄⽆菌试管内，⽤含0.05%（ml/ml）聚⼭梨酯80的0.9%⽆菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数⼩于100cfu的菌孢⼦悬液。
6、⽆菌检查直接接种法⽅法适⽤性试验6.1供试品制备：描述供试品制备过程（主要为每个样品的取样部位及⽤量）。
6.2试验组：取装量为 ml硫⼄醇酸盐流体培养基，接种规定的供试品量（同6.1），并接种⼩于100cfu的⾦黄⾊葡萄球菌；⼤肠埃希菌、⽣孢梭菌、枯草芽孢杆菌、⽩⾊念珠菌、⿊曲霉按照上述步骤操作，其中⼤肠埃希菌、⽣孢梭菌加⼊硫⼄醇酸盐流体培养基，枯草芽孢杆菌、⽩⾊念珠菌、⿊曲霉加⼊胰酪⼤⾖胨液体培养基。
6.3对照组：取装量为 ml硫⼄醇酸盐流体培养基3管，分别接种⼩于100cfu的⾦黄⾊葡萄球菌、⼤肠埃希菌、⽣孢梭菌；取相同装量的胰酪⼤⾖胨培养基3管，分别接种⼩于100cfu枯草芽孢杆菌、⽩⾊念珠菌、⿊曲霉。
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编号：FAL-YZ-003.1
无菌检查方法
验证报告
科技发展有限公司
目录
无菌检查方法验证报告
1.目的
通过对培养基无菌性检查、灵敏度检查，对产品的无菌检查方法适用性进行试验，证明该方法适用于产品无菌检查日常检测。
2.范围
适用于本公司产品的无菌检查方法的建立和确认。
3．依据
中国药典（2015年版）
GB/T14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学实验方法
4. 职责权限
5. 验证方法
实验前的准备
a仪器设备
b操作环境
微生物限度检查应在环境洁净度10000 级下的局部洁净度100 级的单向流空
气区域内进行。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度验证。
c稀释液和试剂： PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液
d器具无菌注射器仪液器 YT－603集菌仪
5.1培养基的适用性检查
无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及胰胳大豆胨肉汤培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。
本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。
培养基：硫乙醇酸盐批号20140408 生产厂家：青岛日水生物技术有限公司胰胳大豆胨肉汤培养基批号20151023 生产厂家：青岛尼赛欣合生物技术有限公司
5.1.1无菌性检查：每批培养基随机取不少于 5 支（瓶），培养 14 天，应无菌生长。
5.1.2灵敏度检查
菌种：培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过 5 代（从菌种保存中心获得的冷冻干燥菌种为第 0 代），试验用菌种应采用适宜的菌种保存技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 〔CMCC(B) 10 104〕
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕
生孢梭菌(Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕
白色念珠菌(Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕
黑曲霉(Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98 003〕
5.1.3菌液制备
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉微生物培养基质控品,使用前注入1.1ml稀释液充分溶解后,在漩涡混合器上震荡混匀,制成10-100 cfu/0.1ml菌悬液,3-5天内用完。
5.1.4培养基接种取每管装量为12ml 的硫乙醇酸盐流体培养基7支，分别接种小于100 cfu 的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌各2 支，另1支不接种作为空白对照，培养3 天；取每管装量为9ml的胰胳大豆胨肉汤培养基7支,分别接种小于100 cfu 的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2 支，另1 支不接种作为空白对照，培养5 天。
逐日观察结果。
5.1.5结果判定空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度检查符合规定。
见附件无菌培养基的适用性检查记录
5.2无菌检查方法验证试验
5.2.1当建立产品的无菌检查法时，应进行方法的验证，以证明所采用的方法适合于本产品的无菌检查。
若本产品的组分或原检验条件发生改变时，检查方法应重新验证。
验证时，按“中国药典2015版四部1101无菌检查法”的规定进行操作。
对每一试验菌应逐一进行验证。
5.2.2菌种及菌液制备金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉同培养基灵敏度检查。
5.2.3薄膜过滤法
5.2.3.1FAL胶无菌检测:使用YT－603集菌仪，滤膜孔经不大于0.45µｍ。
A样品组：取1ml医用胶缓慢滴入100ml氯化钠蛋白胨缓冲液中，使其固化成白色胶膜充分冲洗振荡1分钟，制成样品组供试液，取一幅二联式集菌培养器，将样品组供试液平均通过每只集菌培养器过滤，再用100ml氯化钠蛋白胨缓冲液冲洗，然后通过集菌仪每只集菌培养器加入100ml胰胳大豆胨肉汤培养基或硫乙醇酸盐培养基，后每只加入10～100cfu试验菌，做为样品组。
B中和剂对照组：取一幅二联式集菌培养器，将100ml氯化钠蛋白胨缓冲液平均通过每只集菌培养器过滤，然后通过集菌仪每只集菌培养器加入100ml胰胳大豆胨肉汤培养基、或硫乙醇酸盐培养基，后每只加入10～100cfu试验菌，做中和剂对照组。
C阳性对照组（菌液组）：取一幅二联式集菌培养器，通过集菌仪每只集菌培养器加入100ml胰胳大豆胨肉汤培养基、或硫乙醇酸盐培养基，后每只加入10～100cfu试验菌，做为阳性对照组。
D阴性对照：另取一幅二联式集菌培养器，通过集菌仪一只通过100ml胰胳大豆胨肉汤培养基，另一只通过100ml硫乙醇酸盐培养基，作为阴性对照。
5.2.3结果判断样品组与中和剂对照组微生物生长浓度相似，表明中和剂的中和方式有效消除了样品的抑菌性（即有效性），如对照组与阳性对照的微生物浓度相似，表明样品预处理，消除样品抑菌性的方法，检测程序和培养条件等均不影响微生物生长（即无毒性）。
阴性对照无菌生长。
否则实验无效。
6.验证结论
通过培养基无菌性检查、培养基灵敏度检查、无菌检查方法验证，结果表明，制定的无菌检查方法适用本公司的产品。
无菌检查方法验证试验记录
编号：ZJ/JL-8.2.4-4-10序号：
样品名称：样品批号：检测日期：样品数量：
试验方法：依据《中国药典》2015年版四部1101 无菌检查法：方法验证试验
□薄膜过滤法□直接接种法
注：“+”为生长，“-”为不生长
结论：
检验者：复核者：复核日期：
无菌培养基的适用性检查记录编号：ZJ/JL-8.2.4-4-9
培养基：1.硫乙醇酸盐流体培养基批号：_______________ 检验日期：
2.胰酪大豆胨豆汤培养基批号：_______________ 完成日期：以上均为符合药典规定的干燥培养基。
一、培养基的无菌性检查
培养温度：硫乙醇酸盐流体培养基℃胰酪大豆胨豆汤培养基℃
注：“+”为生长，“-”为不生长
二、培养基的灵敏度检查
1.菌液制备：
（1）金黄色葡萄球菌新鲜肉汤培养物
[CMCC(B)26003] 第_____代注入1.1ml稀释液充分深解后，在漩涡
混合器上震荡混匀.
至_______含菌量
_______CFU/0.1ml
（2）枯草芽孢杆菌新鲜肉汤培养物1ml
[CMCC(B)63501]第_____代注入1.1ml稀释液充分深解后，
在漩涡混合器上震荡混匀.
至_______含菌量
_______CFU/0.1ml
（3）铜绿假单胞菌新鲜肉汤培养物1ml
[CMCC(B) 10104]第_____代注入1.1ml稀释液充分深解后，
在漩涡混合器上震荡混匀.至_______含菌量
_______CFU/0.1ml
（4）生孢梭菌新鲜硫乙醇酸盐培养物
[CMCC(B)64941]第_____代注入1.1ml稀释液充分深解后，
在漩涡混合器上震荡混匀.
至_______含菌量
_______CFU/0.1ml
（5）白色念珠菌新鲜改良马丁培养物1ml
[CMCC(F)98001]第_____代注入1.1ml稀释液充分深解后，
在漩涡混合器上震荡混匀.
至_______含菌量
_______CFU/0.1ml
（6）黑曲霉新鲜孢子洗脱液1ml [CMCC(F)98003]第_____代注入1.1ml稀释液充分深解后，
在漩涡混合器上震荡混匀.
至_______含菌量
_______CFU/0.1ml
2. 检查结果
细菌培养温度____℃ 3天霉菌及酵母菌培养温度____℃ 5天
注：“+”为生长，“-”为不生长
三、结论：
本品按《中国药典》2015年版四部1101无菌检查法培养基的适用性检查，结果_______________。
检验人：复核人：复核日期：。