直接化学发光与电化学发光之比较

直接化学发光与电化学发光之比较

自1982年人们就开始研究将电促化学发光标记物（ECL）用于各种免疫检查，但直到最近，随着罗氏公司力图将这一技术用于其新系列的仪器中，才重新引起人们对电化学发光的关注。

尽管电化学发光标记物同经典的化学发光标记物吖啶酯（AE）有很多相似的特性，但在技术细节方面并不相同，这使得电化学发光并不适合于现代自动免疫仪器。

本文详细探讨了电化学发光的技术特点以及该技术对仪器性能的局限性，并根据厂家所给的性能指标将电化学发光系统与采用AE技术的仪器进行了比较。尽管同老式的手工操作或与采用比色法、包被管和酶免法的半自动分析仪相比，罗氏公司的仪器在检测技术和操作特性上颇具吸引力，但实际上罗氏所面对的真正竞争对手并非这些过时的技术，而是象Bayer诊断产品公司出品的ACS：180SE这样的先进仪器。

背景与发展过程

早在19世纪20年代，人们就观察到电解过程中的发光现象，但在60年代以前，很少有人对此现象进行研究。从1982年开始，人们就一直在研究将可产生电促发光的三联吡啶衍生物应用于免疫实验中。1991年，IGEN公司（美国马里兰州洛克威尔公司）推出了采用这一技术的商品化仪器和试剂，1990年和1991年，IGEN公司分别与ESAI公司（日本）和罗氏公司签订协议，共同发展免疫检验项目，并授予它们ECL技术的使用权。

电化学发光“理论上”的优越性

ECL具有许多与AE相同的优点，但在理论上，ECL较之目前AE技术的最重要的优越性就是其具有更高的灵敏度，该论点是基于电化学标记物具有循环参与电化学反应的能力，每个标记物分子可多次产生光子。但在实际中，即使ECL所宣传的检测范围也一直没有超过AE的检测限，而且，采用ECL的免疫实验较之大量采用AE技术的商品化免疫项目并没有显示其具有更优越的灵敏度。

电化学发光的缺点

ECL有三个最主要的缺点：

l 检测标记物时需要三个电极（一个金/铂激发电极，两个测定电极），3000美元/5000美元一个，需更换。

l 仪器采用的流动比色池，交叉污染为潜在问题。

l 对环境因素和其它非特异性反应过于敏感。

采用ECL技术的仪器需要三个电极，每个电极都会涉及到电极的稳定性、重复性、污染问题和额外的常规维护。另外，仪器所采用的流动式设计和电极本身都会造成严重的交叉污染问题。因此，这些仪器在每个测定间都需要进行化学清洗、化学调节和电极调节，这些清洗和调节过程使得每次测试都要产生大量的废液并严重限制了仪器的检测速度。

大量的固相物也易于与上次实验的残留试剂反应，这使得罗氏公司所推出的随机任选式仪器的试剂交叉污染问题更为严重。

最后，电化学反应的复杂性也使其容易受到更多因素的干扰，对于一些使用近似的稀土螯合物的免疫实验，干扰很可能来自金属离子的污染（样品管、加样头或实验用水），或是存在EDTA和其它作为抗凝剂或防腐剂的金属螯合物。另外，反应副产品的沉积也是一个潜在的干扰源。

在这类仪器中，由于缓冲液中存在高浓度的TPA造成自身的电化学发光，使得背景信号过高，光子的产生对6到7范围内的pH值非常敏感。很明显，ECL所用试剂如果不避光保存将很不稳定并易于自发光，遭致失效。

以下总结了采用AE标记物的直接化学发光和采用Ru(bpy)32＋标记物化学发光之间的关键区别点。

表1：AE和ECL的区别点

检测的难易

直接化学发光只需与H2O2反应就可激活AE。

ECL需要使用三个电极才能进行一个未知的、多个电活性样品间复杂反应。

速度

直接化学发光AE闪光可在2秒钟内完成。

电化学发光ECL闪光在5秒钟内完成，但需要40到60秒进行电极清洗和环境调节。

灵敏度

AE检测范围可小于10－15M，远远高于免疫实验所需的灵敏度。

ECL的检测范围据称在10－11M到10－17M之间。

背景信号

由于近乎没有纯自然的化学发光，AE所产生背景信号非常低。

由于高浓度的TPA所造成的电化学发光使得ECL具有较高的背景信号。

特异性

AE对温度和pH值不敏感

ECL对超出6到7范围的pH值非常敏感，对金属离子或螯合物的污染也非常敏感。

最近一篇关于ECL技术的综述文章总结道：“还需要进一步的工作以解决电极污染问题，提高ECL试剂的稳定性和效价，并对流动室的设计进行改进，由于电极和光检测装置间的不协调使得这一问题变得非常复杂。”简而言之，ECL技术的局限性随着其在现代高速免疫仪器中的应用而显得日益突出。相对于AE技术，ECL并没有什么真正的优势。

结论

尽管同老式的手工操作或与采用比色法、包被管和酶免法的半自动分析仪相比，罗氏公司这两款新仪器在检测技术和操作特性上颇具吸引力，但是与此相反，同拜耳诊断产品公司首次采用了直接化学发光技术，1991年推出了全自动的ACS：180，1995年推出ACS：180Plus，1998年推出ACS：180SE。

多电极检测系统、流动式仪器设计、复杂的、易受干扰的化学反应和对试剂交叉污染和样品干扰非常敏感，以上种种缺点严重阻碍了ECL技术应用现代高性能的免疫分析仪器。

流动式的仪器设计配以ECL电化学检测方式，造成了这些仪器的检测速度慢（ECL2010为80-88测试/小时，ACS：180SE为180测试/小时）。为了弥补速度上的不足，罗氏公司正在开发一套计算机化的仪器控制系统和传送带系统，以将多个ELecsys系统连接起来。很明显，这种方法起码需要两台仪器、一台机算机和一套传送带才能达到一台ACS：180的处理能力。

本文浅析的ECL技术和基于此技术的免疫仪器所具有的缺点，将会随着新型仪器在常规工作中的使用而变得日趋明显。