流式细胞术检测体液T淋巴细胞亚群的临床应用

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・临床研究・流式细胞术检测体液Ｔ淋巴细胞亚群的临床应用
莫扬１，许小东２
（华中科技大学同济医学院附属裹樊医院检验科，湖北襄樊４４１０２１；２．卫生部北京医院流式细胞仪室１００７３０）
【摘要】目的探讨胸水、腹水、肺泡灌洗液Ｔ淋巴细胞亚群的榆测方法及临床价值。

方法采用流式细胞术检测良、恶性疾病患者的５０例胸水、４６例腹水、４７例肺泡灌洗液（ＢＡＬＦ）中Ｔ淋巴细胞亚群的水平并分组进行比较。

结果１）胸水：结核性胸膜炎组胸水Ｔｓ细胞占Ｔ淋巴细胞的（２７．３６±６．４１）％、Ｔｈ细胞占Ｔ淋巴细胞的（６７．９８±７．４１）％、Ｔｈ／Ｔｓ比值为２．６０±０．６４，肺部恶性肿瘤组胸水Ｔｓ细胞占Ｔ淋巴细胞的（６７．９７士４．２０）％、Ｔｈ细胞占Ｔ淋巴细胞的（３７．６１±４．８０）％、Ｔｈ／Ｔｓ比值为０．４７－４－０．１０，与结核性胸膜炎组比较，恶性组Ｔｈ、Ｔｈ／Ｔｓ比值显著Ｆ降（Ｐ＜０．０１）而Ｔｓ显著升高（Ｐ＜０．０１）；２）肺泡灌洗液：肺良性疾病组肺泡灌洗液Ｔｓ细胞占Ｔ淋巴细胞的（４４．５４－４－９．５６）％、Ｔｈ细胞占Ｔ淋巴细胞的（４９．２８－＋４－１２．８８）％、Ｔｈ／Ｔｓ比值为１．１３±０．２９，肺部恶性肿瘤组肺泡灌洗液Ｔｓ细胞占Ｔ淋巴细胞的（６５．１１±７．７７）％、Ｔｈ细胞占Ｔ淋巴细胞的（３４．５７±６．６５）％、Ｔｈ／Ｔｓ比值为０．５４－４－０．１９，与良性病变组比较，恶性组Ｔｈ卜．降（Ｐ＜ｏ．０５），Ｔｈ／Ｔｓ比值显著卜．降（Ｐ＜０．０１），而Ｔｓ显著升高（Ｐ＜０．０１）。

３）腹水：结核性腹膜炎组腹水Ｔｓ细胞占Ｔ淋巴细胞的（３３．１１±３．３４）％、Ｔｈ细胞占Ｔ淋巴细胞的（６６．６９±３．７８）％、Ｔｈ／Ｔｓ比值为２．０３士０．２８，恶性组腹水Ｔｓ细胞占Ｔ淋巴细胞的（５６．６４±９．３４）％、Ｔｈ细胞占Ｔ淋巴细胞的（３５．８６士３．３０）％、Ｔｈ／Ｔｓ比值为０．６５±０．１０，与结核性腹膜炎组比较，恶性组Ｔｈ、Ｔｈ／Ｔｓ比值显著Ｆ降（Ｐ＜０．０１），而Ｔｓ显著升高（Ｐ＜ｏ．０１）。

结论胸腹水、肺泡灌洗液Ｔ淋巴细胞亚群检测可用于分析性质并有助于评估患者局部免疫功能状态。

【关键词】支气管肺泡灌洗液；流式细胞术；Ｔ淋巴细胞哑群
中图分类号：Ｒ４４６．６１文献标识码：Ａ文章编号：１６７３—４１３０（２０１０）０１—００５０—０２
ＩｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｏｆＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｕｂｓｅｔｓｉｎｆｌｕｉｄｏｆｔｈｅｐａｔｉｅｎｔｓｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ
ＭＯＹａｎｋｌ，ＸＵＸｉａｏ－ｄｏｎｇ２
（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＡｆＪ’ｉｌｉａｔｅｄｘｉａｎｇＪａｎＨｏｓｐｉｔａｌ，ＴＤ竹ｇＪｉ
ＭｅｄｉｃｉｎｅＣｏｌｌｅｇｅ，
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Ｆｗｉｔｈｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ。

ａｎｄｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆＴｈｉｓ（３７．６１士４．８）％，Ｔｓ（６７．９７±４．２０）％，ａｎｄＴｈ／Ｔｓ（０．４７士０．１０）ｉｎＢＡＬＦｗｉｔｈｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ。

ａｎｄｔｈｅＴｈｃｅｌｌｓｉｎＢＡＬＦｗｉｔｈｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｗｅｒｅｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅｂｅｎｉｇｎｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｏｒｄｅｒ（Ｐ＜０．０５）。

ａｎｄｔｈｅＴｈ／ＴｓｒａｔｉｏｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｗｈｉｌｅｔｈｅＴｓｃｅｌｌｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｉｎＢＡＬＦｏｆｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ（Ｐ＜０．０１），ｅｏｍｐａｒｉｅｄｗｉｔｈｔｈｅｂｅｎｉｇｎｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｏｒｄｅｒ；２）ＴｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆＴｈｉｓ（３５．７６＋－７．７１）％ａｎｄＴｓ（６４．３１士７．３７）％ａｎｄＴｈ／Ｔｓ（０．５７土０．１８）ｉｎＢＡＬＦｗｉｔｈｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ，ａｎｄｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆＴｈｉｓ（４９．２７土１２．８８）％，Ｔｓ（４４．５４士９．５６）ｏＡ，ａｎｄＴｈ／Ｔｓｉｓ（１．１３±０．２９）ｉｎＢＡＬＦｗｉｔｈｂｅｎｉｇｎｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｏｒｄｅｒ．ＴｈｅＴｈｃｅｌｌｓｉｎＢＡＬＦｗｉｔｈｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｗａｓｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅｂｅｎｉｇｎｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｏｒｄｅｒ（Ｐ＜０．０５），ｔｈｅＴｈ／ＴｓｒａｔｉｏｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒａｎｄｔｈｅＴｓｃｅｌｌｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｉｎＢＡＬＦｏｆｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ（Ｐ＜０．０１）ｃｏｍｐａｒｉｅｄｗｉｔｈｔｈｅｂｅｎｉｇｎｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｏｒｄｅｒ；３）ＴｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆＴｈｉｓ（３５．７６士７．７１）％，Ｔｓｉｓ（６４．３１±７．３７）％ａｎｄＴｈ／Ｔｓａｒｅ（０．５７士０．１８）ｉｎＢＡＬＦｗｉｔｈｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ，ａｎｄｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆＴｈｉｓ（４９．２７土１２．８８）％，Ｔｓｉｓ（４４．５４±９．５６）％，ａｎｄＴｈ／Ｔｓｉｓ（１．１３±０．２９）ｉｎＢＡＬＦｗｉｔｈｂｅｎｉｇｎｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｔｈｅＴｈｃｅｌｌｓｉｎ
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ｅｒａｎｄｔｈｅＴｓｃｅｌｌｓｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｉｎＢＡＬＦｏｆｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ（Ｐ＜０．０１）ｃｏｍｐａｒｉｅｄｗｉｔｈｔｈｅｂｅｎｉｇｎｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ｃｏｎ‘ｃｌｕｓｉｏｎＴｈｅｉｍｍｕｎｉｔｙｆｕｎｃｔｉｏｎｉｎｔｈｅｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ．ＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｉｅａｐｐｒｏａｃｈｉｓｖａｌｕａｂｌｅｉｎａｎａｌｙｚｉｎｇＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｕｂｓｅｔｓｉｎＢＡＩ。

Ｆ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］Ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒｌａｖａｇｅｆｌｕｉｄ；Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ；Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｕｂｓｅｔｓ
恶性浆膜腔积液确诊的金标准是在积液巾找到肿瘤细胞。

然而在临床上，常有高度怀疑为恶性积液但未能找到肿瘤细胞的情况，从而影响到诊断的最终判断。

笔者通过对患者胸水、腹水、肺泡灌洗液Ｔ淋巴细胞亚群的分析判断其性质，为临床恶性积液的诊断提供了一种检测指标，现报道如下。

资料与方法
１．标本来源病例为２００６年６月至２００７年１２月在襄樊市巾心医院及卫生部北京医院呼吸科、消化科、肿瘤科住院治疗的相应疾病患者。

１）胸水来源：肺癌２０例（均经病理最终证实），年龄３１～６９岁，男１７例，女３例。

组织学分型：鳞癌１４例。

腺癌４例，小细胞癌２例；结核性胸膜炎３０例，年龄２６～６８岁，男１８例，女１２例。

刷检见结核杆菌（抗酸染色阳性）确诊。

２）肺泡灌洗液来源：肺癌组２５例（男１５例、女１０例），均经病理证实，年龄３９～７１岁；肺部良性疾病组２２例（男１５例、女７例），年龄２８～７０岁，其中肺结核８例、肺炎ｌｌ例、肺结节病３
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例。

３）腹水来源：２８例，平均年龄４８岁，其中肝癌１０例、胃癌
１１例，结肠癌５例，卵巢癌２例，均经病理最终证实。

２．仪器试剂采用美国ＢＤＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ流式细胞仪，
ＣＤ４ＦＩＴＣ／ＣＤ８ＰＥ／ＣＤ３ＰｅｒＣＰ■色荧光抗体及同型对照、红细
胞裂解液、荧光校准微球均购自ＢＤ公司。

３．方法１）样晶的制备：肺泡灌洗液经尼龙布过滤去掉
杂质和痰液，胸水腹水以肝素抗凝采集，标本以１５００ｒ／ｒａｉｎ离
心５ｍｉｎ，弃上清液，ＰＢＳ洗涤。

计数并调节细胞数为２×１０６／
ｍＬ／管，加入ｃＤ４ＦＩＴＣ／ＣＤ８ＰＥ／ＣＤ３ＰｅｒＣＰ荧光抗体２０弘Ｌ，
窀温避光孵育２０ｍｉｎ，加１：９配制的红细胞裂解液２ｍＩ。

，避
光１０ｍｉｎ，１５００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，弃上清液，ＰＢＳ缓冲液２
ｍＩ．离心洗涤，０．５ｍＬＰＢＳ缓冲液重悬细胞。

同时另一管做
同型对照。

２）流式细胞仪测定：以荧光微球ｃａｌｉｂｒｉｔｅ３－ｃｏｌｏｕｒ
校准仪器光路使其分辨率达到最佳工作状态，采用ｃｅｌｌｑｕｅｓｔ
Ｐｒｏ软件获取与分析数据。

调节电压、阈值、补偿使细胞在图
中分布在合适的位置，在ＦＳＣ／ＳＳＣ图中圈出淋巴细胞群为
（Ｒ１），ＳＳＣ／ＣＤ３图中以ＣＤ３＋细胞群圈『Ｊ（Ｒ２）以排除巨噬细
胞、碎片及其他成分的干扰，建立ＣＤ４／ＣＤ３、ＣＤ８／ＣＤ３散点图
并设置为显示Ｇ３＝ＲＩ×Ｒ２门内的细胞，获取细胞总数１００００
个，根据Ｉ司型对照设十字门分析Ｔｈ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）和Ｔｓ（ＣＤ３＋
ＣＤ８＋）的表达情况。

同时计算出Ｔｈ／Ｔｓ比值。

３）统计分析：两
组数据统计以孑－４－＿ｓ表示，应用Ｅｘｃｅｌ统计软件进行统计学分
析，两组间比较采用￡检验，Ｐ＜ｏ．０５为差异有统计学意义。

结果
１．结核性胸膜炎与肺癌患者胸水Ｔ淋巴细胞亚群比较，
见表１。

肺癌组与结核性胸膜炎组相比Ｔｈ显著减少（Ｐ＜
０．０１），Ｔｓ显著增高（Ｐ＜０．０１），Ｔｈ／Ｔｓ比值显著减低（Ｐ＜
０．０１）。

表１胸水Ｔ淋巴细胞亚群在结核胸膜炎及肺炎患者的表达
注：与结核性胸膜炎组比较。

Ｐ＜０．０１。

２．肺恶性肿瘤患者组和良性病变组的肺泡灌洗液Ｔ淋巴
细胞亚群的结果比较，见表２。

恶性肿瘤患者肺泡灌洗液中Ｔ
淋巴细胞亚群与良性病变组比较Ｔｈ下降（Ｐ＜０．０５），Ｔｈ／Ｔｓ
比值显著下降（Ｐ＜０．０１），『『｜ｉＴｓ显著升高（Ｐ＜０．０１）。

表２肺泡灌洗液Ｔ淋巴细胞亚群在肺良性疾病及
肺部恶性肿瘤患者的表达
注：与肺部良性疾病组比较，。

Ｐ＜０．０５，一Ｐ＜０．０１。

表３结核性腹膜炎及癌性腹水Ｔ淋巴细胞哑群的表达
注：与结核性腹膜炎比较，。

Ｐ＜０．０１。

３．结核性腹膜炎及恶性腹水Ｔ淋巴细胞亚群的比较，见・５１・
表３。

恶性腹水组与结核性腹膜炎组相比Ｔｈ显著减少（Ｐ＜０．０１），Ｔｓ显著增高（Ｐ＜０．０１），Ｔｈ／Ｔｓ比值显著减低（Ｐ＜０．０１）。

讨论
某些疾病时人体浆膜腔会出现过多的液体积存，如肺结核、肺癌时引起胸腔积液，消化系统疾病时出现腹腔积液。

肺部疾病患者进行支气管肺泡灌洗町采取到肺泡表面衬液，对这些液体性质的检测有助于疾病的诊断和鉴别诊断。

机体依靠各种免疫细胞之Ｉ．日ｊ的相互协作和制约维持正常的免疫功能状态。

恶性肿瘤患者普遍存在免疫功能低下，免疫细胞不能有效识别、排斥和杀灭肿瘤细胞是肿瘤发生的根本原因。

抗肿瘤免疫以细胞免疫为主，Ｔ细胞在免疫监视、杀伤靶细胞及免疫调节方面具有极其重要的作用。

Ｔ淋巴细胞进一步分化为辅助性Ｔ淋巴细胞（Ｔｈ，ＣＤ３＋ＣＤ４＋）和细胞毒性Ｔ淋巴细胞（Ｔｓ，ＣＤ３＋ＣＤＳ＋），对于抗原刺激的应答，辅助性Ｔ淋巴细胞分泌细胞因子，辅助诱导其他免疫细胞共同发挥抗肿瘤作用。

近来研究发现，辅助性Ｔ淋巴细胞可被肿瘤细胞直接活化而不需要抗原呈递细胞系统，对肿瘤细胞也有直接杀伤作用，并且在机体的肿瘤免疫中有重要的记忆功能，对再次抗肿瘤免疫起决定性的作用【１］，Ｔｈ细胞数量减少造成Ｔ细胞产生细胞因子的能力下降，抗瘤效应明显降低，可使肿瘤细胞发生免疫逃逸；Ｔｓ细胞通过分泌抑制因子在免疫反应中起负相作用，抑制抗体形成及细胞免疫反应，还可以通过与Ｔｈ细胞争夺ＩＬ一２等细胞因子来维持自身生长，造成效应性Ｔ细胞不能活化，肿瘤不被杀伤口］。

细胞免疫功能改变往往敏感地表现在Ｔｈ／Ｔｓ比值改变上，Ｔｈ／Ｔｓ比值的下降被认为是疾病严重和预后不良的重要指标之一。

正常情况下，Ｔ细胞及眶群的数目在周围组织中相对稳定，机体发生肿瘤时，肿瘤局部的微环境紊乱，Ｔｈ、Ｔｓ平衡打破，表现为局部的Ｔｓ亚群增高，Ｔｈ／Ｔｓ比值减低口４Ｊ。

本文资料显示，恶性腹水组、肺癌组胸水及灌洗液巾的Ｔｈ、Ｔｈ／Ｔｓ比值明显低于非恶性组，Ｔｓ细胞增高，说明肿瘤患者有抑制功能的Ｔ细胞增加杀伤肿瘤的Ｔ辅助细胞明显减少。

随着肿瘤不断牛长，机体对肿瘤细胞产牛免疫耐受，加之肿瘤本身产生的一些免疫抑制闪子抑制免疫细胞的功能，从而导致机体免疫功能进行性下降［５］，是肿瘤发生、发展的原因之一。

结核是由结核杆菌引起的一种感染性疾病，机体抗结核主要是Ｔ淋巴细胞介导的细胞免疫反应，本文资料显示结核性胸水及腹水中Ｔｈ细胞显著增高，说明结核患者存在局部免疫力增强，这与淋巴细胞定向募集有关。

黄泽信等［６］发现结核性胸腔积液巾ＩＩ，１６水平明显高于癌性胸腔积液中ＩＬ＿１６水平，并且胸腔积液中ＩＬ－１６水平与ＣＤ４＋细胞数呈正相关，提示胸腔积液中的ＩＬ－１６有可能具有趋化ＣＤ４＋细胞的作用，能够将ＣＤ４＋细胞浸润到胸膜腔。

本文资料显示，肿瘤患者局部体液中Ｔｈ／Ｔｓ比值减低而结核患者局部体液Ｔｈ／Ｔｓ比值增高，说明肿瘤免疫和抗感染免疫虽然都足以细胞免疫为核心，但免疫反应的结果却是截然不同。

体液和灌洗液Ｔ淋巴细胞亚群反映了患者局部免疫功能的异常，可作为判断性质的一项指标，『『｜ｉ流式细胞仪为我们提供ｒ准确、快捷的检测手段。

参考文献：
［１］吉春宇，杨异，赵珩，等．手术对肺癌患者（下转第５３页）
鬯堕丝堕堕堂垒查！！！！芏！旦笙！！鲞箜！塑！坐』！苎！！尘！：』！！竺翌丝！！：坠！：！！！垒堕！・５３・
３．６０例经拉米大定抗病毒治疗的患者血清ＨＢＶ－Ｉ，Ｐ和出率差异无统计学意ｚ（ｘ２—０．２５，Ｐ＞０．０５），结果见表３。

ＨＢＶＤＮＡ的阳性结果分析：ＨＢＶ—Ｉ。

Ｐ和ＨＢＶＤＮＡ阳性检
表１ＨＢＶＭ、ＨＢＶＤＮＡ、ＨＢＶＬＰ检测结果
表２２００例ＨＢｓＡｇ阳性血清
ＨＢＶＤＮＡ、ＨＢＶ～Ｉ。

Ｐ、ＨＢｅＡｇ结果
表３６０例拉米大定治疗血清ＨＢＶＤＮＡ、ＨＢＶ—ＬＰ结果
讨论
ＨＢＶＤＮＡ和ＨＢｅＡｇ是日Ｉｊ｛『临床用于反映ＨＢＶ感染，复制的最耍标志，传统认为ＨＢｅＡｇ转阴提示ＨＩｊＶ病毒停止复制。

本研究显示，在ＨＢｅＡｇ阴性组中部分标本仍存在ＤＮＡ病毒复制，并且ＨＢＶＤＮＡ与ＨＢＶＩ。

Ｐ的阳性差异无统计学意义，说明ＨＢＶ—ＬＰ作为新的检测乙肝病毒复制的指标优于ＨＢｅＡｇ，且与ＨＢＶＤＮＡ有较好的一致性，其可能原因：１）ＨＢＶ为逃避宿宅的免疫反应常发生基因突变，ＨＢＶ基闪前Ｃ区或ＣＰ区发生突变后不能合成ＨＢｅＡｇ［３］。

２）ＨＢｖ－ＬＰ是ＨＢＶＤａｎｅ颗粒和亚病毒颗粒（管状颗粒）的主要包膜成分，可形成２个跨膜拓扑结构¨］，在形成拓扑结构过程中，在胞质滞留的前Ｓ２区有机会与细胞中信号转导相关因子相互作用发挥其反式激活作用，这种反式激活作用与ＨＢＶ病毒的复制程度密切相关，是ＨＢＶ颗粒成熟包装的关键㈨。

拉米夫定是１４前乙肝患者治疗的常用药。

本研究显示，ＨＢＶ－ＬＰ和ＨＢＶＤＮＡ在抗病毒治疗患者中，阳性检出率的一致性好，说明ＨＢＶ－ＬＰ可用为一种新的指标判断乙肝患者抗病毒治疗的效果。

综上所述，血清ＨＢＶ—ＬＰ测定是反映乙肝患者体内病毒复制、疗效和判断预后的新的敏感性指标，对指导临床乙肝的治疗具有较高的运用价值。

参考文献：
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（本文责任编辑陈开红收稿日期：２００９—１０－０８）
（上接第５１页）
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Ｅ４３ＫｌｉｍｉｕｋＪ。

Ｄｏｍａｇａｌａ—ＫｕｌａｗｉｋＪ，ＫｒｅｎｋｅＲ，ｅｔａ１．Ｉ．ｙｍｐｈｏｃｙｔｅａｎｄｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｕｂｓｅｔｓｉｎｐｌｅｕｒａｌｆｌｕｉｄ－ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｍａｌｉｇｎａｎｔａｎｄ
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（本文责任编辑陈开红收稿日期：２００９—１０－０８）。