膜-胞浆-核蛋白分步提取方法

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核蛋白提取

核蛋白提取实验准备：1 4℃离心机2 根据标本数计算所需I，II，III，IV总体积，取出液体，并加入蛋白酶抑制剂，（III由加蛋白酶抑制剂I与加蛋白酶抑制剂II混合物）实验操作：1 收集细胞。

10ml 对照细胞（1-2*105/ml ）培养48h后，15ml 离心管收集，300g（1370 rpm）* 5min。

弃上清，加1ml 1*PBS轻轻涡旋混匀后转移至1.5ml EP管。

2 4℃，300g * 5min，弃上清。

3 重悬细胞于120μl缓冲液I。

4 重悬细胞于120μl缓冲液II，4℃轻微旋转混匀，15min。

5 4℃ 2500 rpm * 1min。

6 转移上清（胞浆蛋白）至新管。

7 在沉淀中缓慢加120μl缓冲液III，轻微颠倒混匀，离心：4℃，2500 rpm * 1min。

8 弃上清，加130μl缓冲液IV（+蛋白酶抑制剂），4℃旋转混匀1h。

9 离心4℃，13000g * 10 min。

10 转移上清（核蛋白）至一新管，定量。

核提取缓冲液I（15ml）25mM HEPES 375μl HEPES5mM KCl 75μl 1M KCl0.5mM MgCl2 7.5μl 1M MgCl2DDH2O 14.54 ml核提取缓冲液II（15ml）25mM HEPES 375μl HEPES5mM KCl 75μl 1M KCl0.5mM MgCl2 7.5μl 1M MgCl21% NP-40 150μl NP-40DDH2O 14.39 ml核提取缓冲液III（15ml）25mM HEPES 250μl HEPES10% Sucrose 1g Sucrose350mM NaCl 700μl 5M NaCl0.01% NP40 1μl NP-40DDH2O 9.1 ml5M NaCl：14.61g/50 ml H2O注：1在提取浆蛋白后，吸去上清时，如第一次用100μl枪洗不干净，再离心，然后用10μl枪吸尽液体。

（完整word版）膜蛋白提取

（完整word版）膜蛋白提取1分离组织膜蛋白的方法：1、取组织，加入10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。

2、J6-HC离心机800rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管。

3、100000g，4℃离心1hr。

弃去上清，沉淀用适量的Buffer B 重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管，Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。

4、收集所得上清液即为膜组份。

Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。

冰上预冷。

Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。

冰上预冷。

2取约0.1g肝组织，加入2ml粉碎缓冲液，冰浴中超声粉碎，每次20秒，间隔30秒，共3次，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞浆蛋白，沉淀部分加入1ml胞膜蛋白提取液，超声粉碎，4°c 105xg条件下离心2小时，上清液为胞膜蛋白。

样品蛋白含量测定采用酚试剂法。

3我们实验室提取膜蛋白的方法如下：1．将细胞种于T75 或T175的培养瓶中培养数天，细胞铺满瓶底后，吸去培养液。

将PBS/EDTA 溶液(NaCl:0.1M,NaH2PO4:0.01M,EDTA:0.04%)加入量以覆盖细胞为止，置于培养箱或在超净台内消化3～5分钟，如仍未脱落瓶底，用吸管吹打，使细胞完全脱落。

2．收集细胞悬液于10毫升或50毫升的离心管中，1000rpm离心10分钟，去上清液。

RIP试剂配方

RIP试剂配方及操作步骤所有试剂需用DEPC水配置，临用前加入终浓度1 mM PMSF，1×Protease inhibitors (PIC)和100 U/ml RNase inhibitor！！！1、胞浆和核蛋白提取(10 mM Tris, pH 7.4, 200 mM NaCl, 30 mM EDTA and 0.5% Triton-X 100)(10 mM Tris, pH 7.4, 200 mM NaCl, 30 mM EDTA and 0.5% Triton-X 100, 0.5% NP40)也可以直接用RIP buffer。

2、膜蛋白提取(150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1mM EDTA)，相当于碧云天的中强裂解液。

3、RIP Buffer(150 mM KCl, 0.5 mM DTT, 25mM Tris PH7.5, 5 mM EDTA, 0.5% NP40)4、Wash buffer I（低盐）(20 mM Tris-Hcl pH 8.1, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100 and 0.1% SDS)5、Wash buffer II（高盐）(20 mMTris-Hcl pH 8.1, 500 Mm NaCl, 1% TritonX-100 and 0.1% SDS)6、PBS（137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4）7、Nuclear isolation buffer（1.28 M sucrose，40 mM Tris-HCl pH 7.5，20 mM MgCl 2，4% Triton X-100）步骤：蛋白的制备1、睾丸组织样本用预冷的PBS洗三次，加入PBS冰浴匀浆为单细胞。

膜-胞浆蛋白提取方法

膜-胞浆蛋白提取方法膜-胞浆蛋白提取方法膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒产品组成：产品组成规格试剂 A 试剂 B 试剂 C蛋白酶抑制剂混合物蛋白稳定剂BB-3111-150T 10ml 20ml 10ml 250μl 100ulBB-3111-2 100T 20ml 40ml 20ml 500μl 200ul储存条件：蛋白酶抑制剂、蛋白稳定剂-20℃保存；蛋白提取液2-8℃保存。

有效期：一年。

产品简介：哺乳动物跨膜蛋白承当各种生物功能，在疾病的发生、开展过程中扮演重要角色。

膜蛋白样品的制备需要充分考虑到与下游的胶分析^p 及质谱分析^p 等应用配套，因此膜蛋白样本制备成为一个难以逾越的挑战。

传统制备膜蛋白样品的方法是使用去污剂和外表活性剂增溶。

去污剂处理睬使膜蛋白丧失其天然构造，因此阻碍了膜蛋白的功能研究。

贝博膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒是一种基于化学而非去污剂方法的高产膜蛋白提取试剂盒。

本试剂盒提供配套试剂，适用于从细胞和动物组织提取膜蛋白和胞浆蛋白。

提取过程简单方便，可在1小时内完成。

提取的膜蛋白不仅纯度高，保持天然活性，而且绝少穿插污染。

提取的蛋白可用于Western Blotting、转录活性分析^p 、Gel shift凝胶阻滞实验、免疫共沉淀、酶活性测定等蛋白研究。

应用实例：1 4 4图片说明：用膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒提取细胞样本的'SDA-PAGE的电泳考染照片和Western照片。

图1泳道中1、4分别为Marker、膜蛋白样本。

图2为以上样品的EGFR的WB结果照片。

使用方法：A．细胞蛋白提取①1. 取5-10×106个以上细胞，在4℃，500g条件下离心2-3分钟，小心汲取培养基，尽可能吸干，搜集细胞。

2. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。

3. 细胞样品中参加200μl冷的试剂 A，2ul蛋白酶抑制剂混合物，2ul蛋白稳定剂，高速涡旋振荡15秒，置冰上10-15分钟。

胞浆胞核蛋白提取

胞浆胞核蛋白提取
1 细胞密度80%-90%时，取出细胞置于冰上。

2 使用预冷的PBS缓冲液冲洗3遍，去除残留液体。

3 向培养瓶中加入300ul的胞质溶胶提取缓冲液A(cytosol extraction buffer A, CEB-
A)，刮取细胞至1.5ml进口离心管中。

4 在涡旋震荡混匀器上震荡30s，冰上静置10min，每5min震荡一次。

5 加入30ul的胞质溶胶提取缓冲液B(cytosol extraction buffer B, CEB-B)，
涡旋震荡混匀10s，冰上放置1min.
6 4℃离心，1000g，5min。

7 吸取上清，既得到胞浆蛋白。

8 加入100ul的CEB-A，清洗核沉淀，4℃离心，1000g，5min。

9 弃上清，加入40ul的核提取缓冲液(nuclear extraction buffer，NEB)
涡旋震荡混匀10s，冰上放置30min，每5min涡旋震荡10s。

10 4℃离心，1000g，5min。

11 吸取上清，既得到核蛋白。

12 分装至0.2进口EP管中，-80℃保存。

胞浆蛋白—核蛋白抽提试剂盒说明书

胞浆蛋白—核蛋白抽提试剂盒产品编号产品名称包装SINP001 胞浆－核蛋白抽提试剂盒50×产品简介：细胞核和细胞浆目前成为研究细胞组分的两个热点，获得高浓度的细胞核蛋白和细胞浆蛋白成为得到好的研究结果的重要实验过程。

本试剂盒主要原理是在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，离心得到细胞核沉淀。

最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。

本试剂盒是本公司非放射性EMSA试剂盒（cat; SIDET001, SIDET003, SIDET004,）实验成功的重要部分，经BCA测定24cm2贴壁细胞(或50ml规格培养瓶养的悬浮细胞)抽提物，核蛋白浓度约为 2.5ug/ul或更高。

抽提得到的蛋白可以用于Western，EMSA，footprinting，报告基因检测以及酶活力测定等后续操作。

本试剂盒可足够您进行50次抽提操作！包装清单：试剂包装总量5X Buffer A 1瓶35ml/瓶2X Buffer B1支 1.5ml/支Solution I（溶液I）1支 1.75ml/支Solution II（溶液II）1支 1.75ml/支Solution III（溶液III）1支 1.5ml/支PMSF Solution 1支0.85ml/支User Manual (说明书)1份1份/Kit保存温度： 4℃保存。

Ⅰ.准备抽提试剂：按照下列方法制备胞浆－核蛋白抽提液：1.制备3ml胞浆蛋白裂解液I ：试剂体积5X Buffer A0.6mlSolution I（溶液I）30ulSolution II（溶液II）30ulPMSF Solution 15uldd-H2O 2.325ml总体积 3.0ml注：PMSF Solution须在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入。

2.制备1.02ml胞浆蛋白裂解液II：试剂体积Solution III（溶液III）20ul胞浆蛋白裂解液I 1.0ml总体积 1.02ml3.制备1ml核裂解液：试剂体积2X Buffer B25ulSolution I（溶液I）0.5ulSolution II（溶液II）0.5ulPMSF Solution0.25uldd-H2O23.75ul总体积 50ul注：PMSF Solution须在抽提试剂加入到样品中前2-3分钟内加入。

胞浆、胞核提取(细胞)

胞浆/胞核提取（细胞）
一、胞浆蛋白的提取
1、估计细胞的量
5*1051*1065*106
Cytosol Extraction Buffer A(ul) 25 50-100 300-500 Cytosol Extraction Buffer B(ul) 1.2-1.5 3-6 18-30
Nuclear Extraction Buffer (ul) 5-10 20 100
2、每个培养皿PBS洗两次，吸干PBS（冰上操作）
3、每个培养皿加入150ul CEB-A,把细胞刮下，每个皿刮80次，直到无滑腻感，说明细胞全部刮下，将细胞转入EP管，注射器抽吸10次左右，充分裂解细胞
4、冰上孵育20min,每5min震荡10s
5、离心1000*g，4℃，5min,把上清液吸入新EP管内，为胞浆蛋白，沉淀物包含粗制核蛋白（尽量把上清吸干净）
一、细胞胞核蛋白的提取
1、粗制核蛋白由上述步骤5得到，去除膜成分，用100ul CEB-A加入5ul CEB-B，漩涡震荡10s，冰上孵育1min，在低温离心机中以1000*g，4℃，5min,倒上清，并收集细胞碎片
2、用100ul CEB-A清洗细胞核碎片，1000*g，4℃，5min,去上清
3、加入70-100ul 冰的NEB转移到粗制细胞核中涡旋
4、将EP管放到冰上孵育30min，并间隔震荡5次
5、1200*g，4℃，5min
6、将含有核蛋白的上清液转移到新的离心管中，-20℃保存。

细胞膜-胞浆-核膜蛋白分步提取方法

蛋白提取步骤： 1. 提取液制备：每400ul 冷的蛋白提取液A/D 中加入分别加入2ul 蛋白酶抑制剂混合物和2ul 磷酸酶抑制剂混合物，混匀后置冰上备用。 2. 取5-10×106 个细胞①，在4℃，1000rpm 条件下离心5-10 分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，用细胞刮刀收集细胞。（组织样本50-100mg 剪碎，加冷PBS，用组
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
浴10 分钟，37℃下②1000g-2000g 力离心5 分钟，此时溶液分为两层
（对着光线看），上层为核内蛋白，下层是核膜蛋白约为20-40μl。小心移除上层，用1-2 倍体积的提取液D 溶解下层即为细胞核膜蛋白。 9. 在步骤6 中所得到的上清（I）中加入5ul 提取液C，充分混匀。37℃水浴10 分钟。
10. 37℃下② 1000g 离心3 分钟，此时溶液分为两层（对着光线看），上层是胞浆
蛋白部分，下层是细胞膜蛋白部分约为40-50μl。 11. 将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞浆蛋白。
12. 用80-200μl 冰冷的提取液D 溶解步骤10 中的下层部分，即得细胞膜蛋白。 13. 将上述蛋白提取物定量③后分装于-80℃冰箱保存备用或直接用于下游实验④。
织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体（或用液氮研磨），冰上静置5 分钟，小心将匀浆吸入另一预冷的干净离心管。在4℃，500g 条件下离心2-3 分钟，弃上清。）
3. 用冷PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。 4. 每5×106 个细胞中加入400ul 冷的蛋白提取液A，混匀后，在4℃条件下用试剂盒所配针筒反复吸吹细胞，使细胞完全破裂。 5. 在4℃，1000g 条件下离心5 分钟。 6. 快速将上清（I）吸入另一预冷的干净离心管，在沉淀中加入200μl 冷的提取液 B，高速涡旋振荡15 秒。 7. 将混匀的提取液B 置2-8℃振荡1-2 小时，至沉淀充分裂解，沉淀明显减少。8. 37℃水

核与胞质蛋白提取方法

细胞质与细胞核蛋白提取方法
注意：红色斜体字成分可用蛋白酶抑制剂混合物代替，使用前加入
方法如下：
1.将细胞收集到EP管中，离心（4000r/min，5min，4度)。

2.用PBS洗三次，离心同上，弃上清。

3.加入100微升缓冲液A，冰上孵育10min，离心（14000r/min，1min），弃上清。

4.将沉淀重悬于60微升缓冲液B中，混匀，冰上30min，离心（14000r/min，15min，0度),收集上清，弃沉淀。

（核蛋白提取后可用裂解液A透析2h，合并用于IP；或用其他溶液稀释后用浓缩离心管替换溶液后用于IP或其他实验）
裂解液A的作用主要用于释放胞浆蛋白和膜蛋白，裂解液B用于释放核蛋白，NP-40既是一种表面活性剂又是一种去垢剂，它的作用是既可破坏细胞膜（较温和），又可结合释出的蛋白防止沉淀，所以通过第一步离心去上清后大部分胞浆蛋白和膜蛋白可去掉。

细胞核蛋白提取技巧

细胞核蛋白提取技巧1. 选择合适的细胞裂解液：细胞裂解液的选择对于细胞核蛋白的提取至关重要。

通常使用含有低浓度盐、洗涤剂和蛋白酶抑制剂的缓冲液。

一些常用的细胞裂解液包括 RIPA 缓冲液、NP-40 缓冲液等。

根据不同的细胞类型和实验需求，可以尝试不同的细胞裂解液。

2. 控制裂解条件：在细胞裂解过程中，需要控制适当的条件，以确保细胞核的完整性。

避免过度裂解，以免破坏细胞核结构。

可以通过调整裂解液的组成、裂解时间和温度等参数来优化裂解条件。

3. 使用适当的离心方法：离心是分离细胞核和细胞质的常用方法。

在细胞核蛋白提取过程中，可以使用低速离心去除细胞碎片和细胞质，然后使用高速离心沉淀细胞核。

选择合适的离心速度和时间，以确保细胞核的沉淀和细胞质的去除。

4. 添加核蛋白提取试剂：为了提高细胞核蛋白的提取效率，可以添加一些核蛋白提取试剂。

这些试剂可以帮助溶解细胞核膜和核内蛋白质，从而提高提取产量和质量。

常用的核蛋白提取试剂包括 SDS、NaCl 等。

5. 注意蛋白酶抑制剂的使用：在细胞核蛋白提取过程中，蛋白酶的活性可能会导致蛋白质的降解。

为了保护细胞核蛋白的完整性，需要添加适当的蛋白酶抑制剂。

常用的蛋白酶抑制剂包括 PMSF、AEBSF 等。

6. 控制温度和时间：在细胞核蛋白提取过程中，温度和时间的控制也很重要。

避免高温和长时间处理，以免引起蛋白质的变性和降解。

通常，细胞核蛋白提取可以在 4°C 下进行，以保持蛋白质的稳定性。

7. 离心清洗：在细胞核蛋白提取后，为了去除残留的杂质和洗涤剂，可以进行离心清洗步骤。

使用适当的缓冲液进行离心清洗，以确保细胞核蛋白的纯度。

8. 储存和保存：提取的细胞核蛋白应尽快进行下游分析。

如果需要储存，应将细胞核蛋白保存在适当的缓冲液中，并在-80°C 或更低温度下保存。

避免反复冻融，以免影响蛋白质的稳定性。

以上是一些细胞核蛋白提取的技巧。

在实际操作中，需要根据具体的实验需求和细胞类型进行适当的调整和优化。

膜蛋白——精选推荐

膜蛋白的提取：用冰浴1×PBS洗两次，加入细胞裂解液（step⌝ 1），刮下细胞；用27-Gauge针头吹吸5次，冰上静置5min；⌝4℃，3000g，离心10min，取上清进行下一步离心，沉淀保留（其中含有细胞碎片和细胞核）；⌝4℃，12000g，离心10min，取上清进行下一步离心，沉淀保留（其中含有线粒体，内质网等细胞浆成分）；⌝4℃，130000g，离心30min，将上清收集至另一Eppendorf管内（其中含有其它胞浆蛋白）；⌝用膜蛋白裂解液（step⌝ 2）溶解沉淀（其中含有细胞膜蛋白）；于95℃变性5min，将所有样品（各步沉淀）保存于-80℃。

⌝1 细胞质膜资料1895年,Overton从研究细胞透性得出"细胞膜由连续的脂类物质组成"。

1925年Gorter&Grendel:用脂单分子膜技术测定细胞膜中脂分子的总面积，提出："细胞膜是由双层脂分子组成"。

1935年Danielli&Davson：从测定膜的表面张力得出细胞膜的"三明治结构模型"，即蛋白质－脂-蛋白质。

1959年Robertson:用电镜观察生物膜提出"单位膜模型"，将膜的分子结构与超微机构统一起来厚度：2(暗)+3.5(亮〕+2（暗)=7.5细胞质膜的主要功能概括如下：(1) 为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境;(2) 选择性的物质运输，包括代谢底物的输入与代谢产物的排除，其中伴随着能量的传递；(3) 提供细胞识别位点，并完成细胞内外信息跨膜传递；(4) 为多种酶提供结合位点，使酶促反应高效而有序地进行；(5) 介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接;质膜参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构。

2 膜蛋白虽动物细胞主要有9种膜脂，而膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白分子数目较少，但却赋予细胞膜非常重要的生物学功能。

根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为两大类型：外在膜蛋白、内在膜蛋白。

细胞核蛋白提取技巧

细胞核蛋白提取技巧
细胞核蛋白提取是一项重要的实验技术，用于研究细胞内的核蛋白结构和功能。

以下是一种常用的细胞核蛋白提取技巧：
1.细胞培养和收获：首先，将所需细胞培养至适当的密度，
并在培养基中加入适当的培养条件。

接下来，使用适当的
方法（例如离心或胶原酶消化）将细胞收获。

2.细胞裂解：将收获的细胞用适当的细胞裂解缓冲液（例如
低盐缓冲液）裂解。

可以通过机械方法（如均质器或声波
处理器）或化学方法（如洗涤剂或酶）来裂解细胞。

3.细胞核分离：通过离心，将裂解的细胞分为上清液和沉淀。

上清液中含有细胞质蛋白，而沉淀中主要包含细胞核。

4.细胞核裂解：将细胞核沉淀用适当的细胞核裂解缓冲液
（例如高盐缓冲液）进行裂解。

同样，可以使用机械或化
学方法来裂解细胞核。

5.清除细胞核残渣：通过离心等方法，去除裂解细胞核残渣，
以获得纯净的细胞核蛋白上清液。

6.蛋白浓缩：将获得的细胞核蛋白上清液进行浓缩，以获得
足够的蛋白量。

常用的方法包括酒精沉淀、有机溶剂沉淀、离心滤膜等。

7.蛋白质定量：使用合适的蛋白质定量方法（如Lowry法、
Bradford法或BCA法）对细胞核蛋白进行定量。

8.蛋白存储：将浓缩的细胞核蛋白分装并冻存于-80°C的冰
箱中，以备后续实验使用。

以上是一种常用的细胞核蛋白提取技巧，具体的实验流程和步骤会因实验目的和细胞类型的不同而略有差异。

015-细胞核蛋白提取

细胞核蛋白分离提取方法
1．将培养皿内的培养基倒去，用预冷的1xPBS洗两遍后，每盘加入
2.5ml1xPBS，放在冰上；
2．用细胞刮讲细胞刮下，移至15ml离心管，再用2.5ml1xPBS清洗培养皿一次，共5ml；
3．1500g离心5min，倒去上清，移入1.5ml离心管中，再每管加入800ul1xPBS清洗一次；
4．每管加入低渗bufferA（1M HEPES,1M KCL,100mMEDTA,100mM EGTA）（buffer：蛋白酶抑制剂：1M DTT=1000:10:1）200ul（原500ul）,冰上静置15min裂解；
5．每管加入25ul 10%NP-40，涡旋10s；
6．1500g4℃离心10min，上清为细胞质蛋白，收集至新的离心管中；
7．每管加入500ul bufferA清洗沉淀，离心速度约2000g；
8．每管加入RIPA buffer（buffer：蛋白酶抑制剂：1M DTT=1000:10:1）50ul，吹散沉淀颗粒，4℃震荡15min，其间每隔5min重新吹散一次，使其充分裂解；
9．14000rpm4℃离心15min，上清为细胞核蛋白，收集至新离心管中。

膜蛋白的提取方法

膜蛋白的提取方法
膜蛋白的提取方法通常包括以下几个步骤：
1. 细胞裂解：将包含膜蛋白的细胞或组织用不同的方式进行裂解，例如超声波处理、酸碱处理、高压处理等。

2. 膜蛋白分离：通过离心、过滤等方法将膜蛋白分离出来。

3. 纯化：采用膜层联萃取、柱层析、电泳等方法对膜蛋白进行纯化。

4. 确认：通过蛋白质定量、SDS-PAGE、Western blot等方法验证膜蛋白的存在和纯度。

常见的膜蛋白提取方法有：
1. 酸性洗涤法：利用低pH值时，膜蛋白和膜脂亲性增强的特性，将细胞裂解物在酸性条件下洗涤获得膜蛋白。

2. 有机溶剂提取法：利用膜蛋白亲性较强的有机溶剂，如丙酮、甲醇等，将膜蛋白从细胞裂解物中提取出来。

3. 离心法：通过离心分离膜细胞，从而获得膜蛋白。

4. 免疫亲和层析法：利用特异性抗体将目标膜蛋白从混合蛋白中分离纯化。

以上方法的选择需根据具体情况来定，不同的细胞类型或膜蛋白性质有着不同的最佳提取方法。

细胞核蛋白和细胞浆蛋白的提取方法

蛋白质分离与提取是生命科学研究基础中的基础，分离细胞核蛋白和细胞浆蛋白，不仅可以
用于研究蛋白在细胞内的定位，而且很多时候分离出来的核蛋白可以用于转录调控方面的研究，例如WB，EMSA(也称gel shift)，footprinting，报告基因，酶活性分析等。

Abbkine细胞核蛋白&胞浆蛋白提取试剂盒（KTP3001）
细胞核蛋白&胞浆蛋白提取试剂盒组分：原理：通过细胞浆蛋白抽提试剂，在低渗透压条件下，使细胞充分膨胀，然后破坏细胞膜，释放出细胞浆蛋白，然后通过离心得到细胞核沉淀。

最后通过高盐的细胞核蛋白抽提试剂抽提得到细胞核蛋白。

∙细胞浆蛋白溶液A (CES A)
∙细胞浆蛋白溶液B (CES B)
∙核提取溶液 (NES)
∙DTT (500X)
∙蛋白酶抑制剂 (100X)
∙
另外还有蛋白酶抑制剂套装（Cocktail）
特点：
多功能—适合从新鲜的哺乳动物组织和培养细胞中提取蛋白，提取的蛋白纯度高且保持天
然活性，绝少交叉污染。

快速方便—不到两小时就能纯化出非变性的活性蛋白质。

兼容性好—适用于各种下游检测，包括蛋白质印迹、凝胶转移检测、蛋白质分析、报告基因检测和酶活性检测等。

蛋白质分离提取效果展示：
使用α-tubulin内参抗体（A01080）分别检测胞浆蛋白与核蛋白提取物。

使用Histone H3内参抗体（A01070）分别检测胞浆蛋白与核蛋白提取物。

*C : Cytoplasmic ，胞浆蛋白；N : Nuclear ，核蛋白。

细胞膜蛋白的提取

细胞膜蛋白的提取
细胞膜蛋白的提取可以通过以下步骤进行：
1. 细胞收集：从所需的细胞类型中收集足够数量的细胞。

可以使用细胞培养方法培养细胞，或者从活体组织中分离细胞。

2. 细胞破碎：将细胞用适当的方法破碎，以释放细胞内的蛋白。

可以使用机械方法（如超声波破碎器或高压细胞击碎器）或化学方法（如洗涤液或界面活性剂）来破碎细胞。

3. 蛋白质提取：使用适当的缓冲液或溶液将细胞破碎物悬浮并离心，以去除细胞碎片和细胞核。

随后，可以使用不同的方法来提取膜蛋白，例如溶解细胞膜并提取蛋白。

4. 蛋白质纯化：使用不同的技术来纯化细胞膜蛋白。

这包括以蛋白质的特定性质为基础的方法，例如亲和层析、凝胶过滤层析、离子交换层析等。

5. 蛋白质浓缩：将纯化的细胞膜蛋白浓缩到所需的浓度。

可以使用蛋白质浓缩技术，例如氨基酸纤维柱、浓缩管或旋转蒸发器等。

6. 蛋白质鉴定：利用蛋白质检测方法，如SDS-PAGE、Western blotting或质谱分析等，确定提取的蛋白质的纯度和数量。

细胞膜蛋白的提取过程需根据实验目的和具体需求来选择和优化各个步骤。

Western_Blot过程步骤详解

做了五个月的Western Blot ，有一点点小心得，给新手点经验．蛋白提取：１．总蛋白提取（胞膜，胞浆，胞核）：组织匀浆后,15000g, 4度, 20分钟后,取上清.Buffer:NP40 750ul, 脱氧胆酸钠0.5克, SDS 0.1克, 加1*PBS 至100ml. 再加入PMSF(7.4mg/ml) 0.1ml. (现用现加)7.4mg/ml PMSP异丙醇溶液: 取A mg PMSF 加A/7.4 ml 异丙醇.工厂-20度储存２．组织膜蛋白提取：所在操作冰上进行（1）取组织，用PBS冲洗干净组织上的血液. 加入10ml Buffer A , 用剪刀尽可能剪碎组织,于冰上充分匀浆。

每次30秒,重复3-5次.（2）离心机1000rpm，4℃离心10min 后，所得上清液转入超速离心管。

(去掉大块组织及结缔组织)（3）100000g，4℃离心1hr, 弃去上清.(此为胞浆蛋白,若只提取胞浆蛋白,可用10000rpm, 4度, 30分钟离心，取上清即可)。

沉淀用适量的Buffer B重悬，4度过夜后，分装至EP管，Eppendorf 台式离心机10000rpm，4℃离心30min。

（4）收集所得上清液即为膜组份。

Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。

冰上预冷。

Buffer B 20mM HEPES（PH 7.5），10% 甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM，PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。

冰上预冷。

所得蛋白分装EP管（每管约50ul），取一管测蛋白浓度，其它放入-70度深冻冰箱保存。

细胞和动物组织核蛋白的提取方法

细胞和动物组织核蛋白的提取方法产品组成 310001 310002规格 50 assays 100 assaysBuffer A (Cytoplasmic Extraction Reagent) 10ml 20mlBuffer B (Nuclear Extraction Reagent) 10ml 20ml蛋白酶抑制剂混合物 250ul 500ul使用方法：A．细胞蛋白提取1. 取5-10×106个细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。

2. 用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。

3. 每20ul细胞压积中加入200μl冷的Buffer A，2ul蛋白酶抑制剂混合物，高速涡旋振荡15秒，置冰上10分钟。

4. 再次高速涡旋振荡5秒，然后在4℃，16000×g条件下离心5分钟。

5. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到胞浆蛋白，请置于冰上或-80℃冰箱保存备用。

6. 在沉淀中加入200μl冷的Buffer B，2ul蛋白酶抑制剂混合物，高速涡旋振荡15秒。

7. 置冰上40分钟，每隔10分钟高速涡旋振荡15秒。

8. 在4℃，16000×g条件下离心10分钟。

9. 快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，即可得到核蛋白。

B．组织蛋白提取1. 取适量组织样本剪碎，加冷PBS，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体（或用液氮研磨），冰上静置5分钟，小心将上清吸入另一预冷的干净离心管。

2. 在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，弃上清。

3. 按照细胞蛋白的提取方法的第3步骤往下操作即可。

上述蛋白提取物请分装后于-80℃冰箱保存备用。

注意事项：1. 实验过程中的所有BestBio-贝博生物试剂须预冷；所有器具须放-20℃冰箱预冷。

2. 整个过程须保持样品处于低温状态。

储存条件：-20℃保存。

有效期：一年。

胞质蛋白的提取

1，弃去培养基用PBS洗2次后，加入冷的裂解液，裂解液配方：50 mM Hepes, 150 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 调整pH至7.5, 根据需要加入蛋白酶抑制剂，有钱可以买pierce的蛋白酶抑制剂鸡尾酒（英文好像是cocktail）。

2，在裂解液中用细胞刮子收集所有细胞，转移裂解液至EP管，用21号针头反复吹打裂解细胞。

3，1000g*3min离心，将上清转移至另一EP管(A管)，沉淀用适量含1%SDS的裂解液（上述裂解液加入SDS）溶解即可得到核蛋白。

4，将A管上清21460g*1h 4 °C离心，即可得到胞浆蛋白（上清）和胞膜/骨架蛋白（沉淀）。

对于沉淀根据需要有两种处理，
A, 将沉淀用含SDS的裂解液溶解，即可得到溶于SDS的胞膜/骨架蛋白。

B, 将沉淀用含TritonX-100裂解液(100 mM phosphate buffer, 150 mM NaCl, measured pH 8, 1.5% TritonX-100, 10% glycerol, plus inhibitors)溶解，即可得到溶于Triton X-100（Sol）的胞膜/骨架蛋白，转移上清后剩下沉淀使用含SDS裂解液溶解，即可得到不溶于Triton X-100（Insol）的胞膜/骨架蛋白。