乳腺癌细胞培养
人乳腺癌细胞MDA-MB-231三维培养模型的构建
人乳腺癌细胞MDA-MB-231三维培养模型的构建彭雪梅;刘永文;张海燕【期刊名称】《山西大同大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2018(034)004【摘要】本研究旨在摸索一种体外构建人乳腺癌细胞MDA-MB-231三维(3D)培养的新方法,以期建立一种能够模拟体内肿瘤细胞真实形态的理想模型.利用该培养模型比较分析MDA-MB-231与正常乳腺上皮细胞MCF-10A 3D形态发生过程中极性形成的差异,主要是采用3D腺泡免疫荧光染色技术对顶部极性标记GM130和底部极性标记Laminin-5的定位进行比较研究,结果发现在3D培养10 d,MDA-MB-231形成了一种近似体内的球形结构,confocol层切MDA-MB-231球体的赤道轴发现,相对于MCF-10A形态发生形成的极性空腔腺泡,MDA-MB-231形成的是一种极性紊乱的实心球结构,其顶部极性标记GM130呈无规则分布、底部极性标记Laminin-5向球体中心内渗,这些结果与体内乳腺癌细胞去极性的特征相吻合,表明该3D培养模型可为深入阐明乳腺癌细胞MDA-MB-231恶化转移及抗癌药物作用机制等研究提供可靠的实验模型.【总页数】5页(P34-38)【作者】彭雪梅;刘永文;张海燕【作者单位】山西大同大学医学院,山西大同037009;山西大同大学化学与环境工程学院,山西大同037009;山西大同大学医学院,山西大同037009【正文语种】中文【中图分类】R73-35+1【相关文献】1.重组质粒pDNR-Dual-Rab25的构建及其在人乳腺癌细胞株MDA-MB-231中的表达 [J], 吴非;张海添;陆云飞2.稳定表达HMGA2的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231构建 [J], 刘娇娇;张慧变;于林3.心房利钠肽对人乳腺癌细胞MDA-MB-231周期分布的影响 [J], 张弛;陆俊铭;周炳刚;曹相玫4.雷公藤红素对人乳腺癌细胞系MDA-MB-231的抑制作用研究 [J], 史晓娜;徐霞;谢闺娥5.抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸对人乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移能力的影响 [J], 徐凯;金延玲;刘伟;罗晶;武雯程;李敏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
人乳腺癌细胞;MCF7贴壁培养
北京索莱宝科技有限公司
人乳腺癌细胞；MCF7贴壁培养
细胞名称：人乳腺癌细胞；MCF7
形态特性：上皮细胞
生长特性：贴壁生长
培养条件：高糖DMEM，10%FBS
传代方法：1:3传代
冻存条件：细胞冻存液
特征特性：MCF-7细胞保留了多个分化了的乳腺上皮的特性，包括：能通过胞质雌激素受体加工雌二醇并能形成圆形复合物（domes）。
该细胞含有Tx-4癌基因。
肿瘤坏死因子α（TNF alpha）可以抑制MCF-7细胞的生长。
抗雌激素处理细胞能调变IGFBP’S的分泌。
细胞处理方法：
1.细胞在培养瓶中培养至状态良好后灌满培养基运输，获得细胞后用酒精棉球擦拭瓶口消毒，然后在超
净台中操作。
2.如细胞生长至70%-80%，将瓶中的培养基移入无菌瓶中留作培养使用，保留5-8mL培养基在37℃、5%
的CO2的温箱中继续培养。
细胞培养至90%-100%后，按要求消化传代。
3.弃去培养基，用无菌PBS或者其他缓冲液清洗细胞2次，加入适量胰蛋白酶消化（EDTA胰酶），待细胞
完全脱壁后加培养基吹打混匀，分瓶培养。
注意：
我们使用自产培养基及进口血清培养细胞，在您拿回细胞后，如想更换其它品牌培养基，请依照逐次替换的原则，先保留培养瓶中的培养基，多日多次代逐步更换，以减轻对细胞的刺激。
第1页，共1页。
MAD-MB-231细胞培养
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
人乳腺癌MDA-MB-231细胞在含有10%太牛血清的RPMI-1640培养液中，于37℃
、5%CO2培养箱中常规培养，用含0.02%EDTA的胰酶消化传代。
实验分组如下：
对照组：细胞中加入含有0.1%DMSO培养液
实验组：细胞用不同浓度芹菜素（20、40、80、160µmol/L及半数IC5038.1µmol/L）处理。
1.2.2芹菜素对MDA-MB-231细胞增殖的影响
1.取处于对数期生长期的MDA-MB-231细胞常规消化，用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养基配置成5.0×104个/mL细胞悬液。
2.每孔接种100℃µL细胞悬液，每浓度设6个平行样，在37、5%CO2培养箱中培养过夜。
3.吸出培养液，每孔加入含有0、20、4、80、160µmol/L的芹菜素RPMI 1640培养液200µL，在37、5%培养箱个、分别培养24h，48h、72h后加入MTT（5g L-1）20µL，继续培养4H 后吸出上清，每孔加入DMSO150微升，震荡溶解10分，待结晶完全溶解后，在酶联免疫测定仪上选择波长570nm处，以试剂对照组调零，测定各孔吸收值OD
4.细胞存活率=实验组OD/对照组OD×100%
生长抑制率=（1-实验组OD/对照组OD）×100%
IC50值用Logit法计算：
IgIC50=xm*I（p-pm-pn）/4)，设xm=ig最大剂量，I=IG(最大剂量/相邻剂量)，P：阳性反应率之和，pm：最大阳性反应率，pn:最小阳性反应率。
1.2.3光镜形态学观察
1.。
细胞侵袭转移实验报告
细胞侵袭转移实验报告细胞侵袭转移是癌症进展和转移的重要特征之一。
了解细胞的侵袭转移机制对于癌症预防和治疗具有重要意义。
本实验旨在研究细胞的侵袭转移能力，并探究其相关机制。
实验过程如下：1. 细胞培养与处理：选取一种具有侵袭能力的癌细胞株，如乳腺癌细胞MCF-7。
将细胞培养在含有适当营养和生长因子的培养基中，经过传代培养至适当细胞数目。
2. Transwell侵袭实验：将含有细胞的培养基加入到上游腔室中，下游腔室中加入含有化膜毛细孔的过滤膜，如Matrigel。
使细胞逐渐通过过滤膜向下游腔室侵袭。
培养一定时间后，取出过滤膜并使用染色剂染色，以观察和计数通过膜孔的细胞数量。
3. Western blot分析：用Western blot方法检测有关侵袭转移的分子标志物，如转录因子Snail和转录因子Slug、E-cadherin和N-cadherin等。
提取细胞总蛋白，经SDS-PAGE电泳分离，转移至聚乙烯二醇膜上，用特异性抗体与目标蛋白结合。
通过免疫反应，使用化学发光显色剂检测目标蛋白的表达水平。
4. Real-time PCR分析：通过Real-time PCR技术检测相关基因的mRNA水平，包括Snail、Slug、E-cadherin和N-cadherin等。
提取总RNA，逆转录为cDNA 后，用特异性引物进行PCR扩增。
通过观察PCR曲线和计算Ct值，比较各样本基因表达水平的差异。
实验结果如下：1. Transwell侵袭实验表明MCF-7细胞具有较强的侵袭能力。
染色显示通过过滤膜的细胞数量较多。
2. Western blot结果显示Snail、Slug和N-cadherin的蛋白表达水平较高，而E-cadherin的蛋白表达水平较低。
这表明细胞侵袭转移相关的转录因子和黏附分子表达异常。
3. Real-time PCR结果进一步证实了上述结果，Snail、Slug和N-cadherin的mRNA水平较高，而E-cadherin的mRNA水平较低。
无血清培养富集乳腺癌干细胞的初步研究
（ １ ． 贵 阳医学院 检验学院 ， 贵州 贵阳 ５ ５ ０ ０ ０ ４； ２ ．Ｃ ａ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｍ ｅＭｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｒ ｏ ｕ ｅ ｎ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙｉ ｎ Ｆ ｒ ａ ｎ ｃ ｅ ， Ｒ ｏ ｕ ｅ ｎ Ｆ－７ ６ １ ８ ３ ， Ｆ ｒ ａ ｎ ｃ ｅ ５ ５ ０ ０ ０ ４； ５ ５ ０ ０ ０ ４） ３ ．Ｒ ｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｍ ｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｉ ｎ Ｆ ｒ ａ ｎ ｃ ｅ ， Ｐ ａ ｉ ｒ ｓ Ｆ一７ ５ ０ １ ０， Ｆ ｒ ａ ｎ ｌ ｅ ； ４ ． 贵阳医学院 组织工程与干细胞研究 中心 ，贵州 贵阳 ５ ．贵阳医学院 免疫学教研ｔ ｏ ｆ Ｂｒ ｅ ａ ｓ ｔ Ｃａ ｎｃ ｅ ｒ Ｓｔ ｅ ｍ Ｃｅ ｌ ｌ ｓ ｉ ｎ Ｓｅ ｒ ｕ ｍ． ｆ ｒ ｅ ｅ Ｍｅ ｄｉ ｕｍ
Ｌ Ｉ ＡＮ Ｆ ａ ｎ ｇ ，Ｇ Ｅ Ｚ ｈ ａ ｎ ｇ ｗｅ ｎ ，Ｌ Ｉ Ｈｏ ｎ ｇ ，Ｌ Ｕ Ｈｅ ，Ｌ Ｉ Ｕ Ｊ ｉ ｅ ｌ ｉ ｎ ，
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［ Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ］Ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ： Ｔ ｏ ｅ ｘ ｐ ｌ ｏ ｒ ｅ ｔ ｈ ｅ ｍ ｅ ｔ ｈ ｏ ｄ ｓ ｆ ｏ ｒ ｇ ａ ｔ ｈ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ ｂ ｒ ｅ ａ ｓ ｔ ｃ ａ ｎ ｃ ｅ ｒ ｓ ｔ ｅ ｍ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ｔ ｏ ｏ ｂ ｔ ａ ｉ ｎ ａ ｓ ｔ ａ ｂ ｌ ｅ
MCF-7ADR培养1
1、MCF-7 是一种很好养的人乳腺癌细胞，培养基用DMEM或RPMI1640均可， 10－15％的小牛血清就能长得很好。
一般两到三天传一代。
传代也很常规。
吸出培养基，加入0.25％的胰酶1ml，轻轻晃动培养瓶，使胰酶流遍瓶壁，以去除残余的培养基。
再加入2ml胰酶（25ml 培养瓶）静置消化2－5min，待细胞缩起变圆，将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。
我一般都不用缓冲液冲洗，而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用，感觉效果还不错。
因为MCF-7消化较快，一般不放到培养箱中消化，以免消化太过。
需要注意的是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起，一般都来不及抢救。
2、MCF-7/ Adr 耐药细胞在培养时逐步加入至终浓度为8µmol/ L的阿霉素以维持抗药性, 实验前2周无药培养。
乳腺癌细胞株整理docx(一)2024
乳腺癌细胞株整理docx（一）引言概述：乳腺癌是一种常见的恶性肿瘤，其治疗涉及到研究和使用乳腺癌细胞株。
乳腺癌细胞株整理是为了系统化地研究乳腺癌的发生机制以及开发治疗方法的重要工作。
本文档将从以下五个大点出发，对乳腺癌细胞株整理进行详细阐述。
一、乳腺癌细胞株的来源和筛选方法1.常见的乳腺癌细胞株来源2.乳腺癌细胞株的特点和分类3.乳腺癌细胞株筛选方法的原则和步骤4.细胞株的基本鉴定和验证方法5.常用的乳腺癌细胞株库介绍二、乳腺癌细胞株的培养和传代方法1.培养基的选择和制备2.细胞的传代和细胞密度控制方法3.细胞培养的注意事项和问题解决方案4.细胞冻存和解冻方法5.乳腺癌细胞株的病毒污染检测和预防三、乳腺癌细胞株在药物筛选中的应用1.药物筛选的原理和方法2.乳腺癌细胞株的药物敏感性评估指标3.药物筛选实验的步骤和操作要点4.影响细胞药物反应的因素和解决方法5.常用的药物筛选平台和技术进展四、乳腺癌细胞株在基因表达和调控研究中的应用1.基因表达分析的原理和方法2.乳腺癌细胞株的转染和过表达方法3.基因沉默和干扰技术的应用4.表达谱分析和差异基因筛选方法5.研究乳腺癌细胞株基因调控网络的新进展五、乳腺癌细胞株在动物模型研究中的应用1.动物模型构建的原理和方法2.乳腺癌细胞株在裸鼠模型中的应用3.乳腺癌细胞株在转基因小鼠模型中的应用4.评估乳腺癌细胞株在动物模型中的肿瘤形成能力5.乳腺癌细胞株在治疗有效性评估中的作用总结：乳腺癌细胞株整理在乳腺癌研究和治疗中具有重要的意义。
通过筛选、培养和应用乳腺癌细胞株，可以深入研究乳腺癌的发生、发展机制，开展药物筛选和基因调控的研究，以及评估治疗方法的有效性。
随着技术的不断进步，乳腺癌细胞株整理将在乳腺癌领域发挥越来越重要的作用。
乳腺癌细胞培养上清液促进人脂肪间充质干细胞迁移和增殖的机制探讨
细胞与分子生物学乳腺癌细胞培养上清液促进人脂肪间充质干细胞迁移和增殖的机制探讨刘丹阳1，王璐璐2，何军2，姜杨2，李永涛2，张晓东2，李鹏辉2，沈雷2△摘要:目的探讨MDA-MB-231乳腺癌细胞培养上清液对人脂肪间充质干细胞（hAdMSC）迁移、增殖和凋亡的影响及分子机制。
方法将MDA-MB-231细胞上清液和不含胎牛血清的RPMI-1640培养基以1∶4的体积比混匀后培养的hAdMSC为MDA-MB-231上清液组。
向MDA-MB-231上清液组添加10µmol/L Reparixin（CXCR1/2抑制剂）为CXCR1/2抑制剂组；向MDA-MB-231上清液组添加10nmol/L GSK690693（Akt抑制剂）为Akt抑制剂组。
无任何刺激进行培养的hAdMSC为对照组。
细胞划痕实验检测各组hAdMSC的迁移能力，CCK-8实验检测各组hAdMSC增殖情况，Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞凋亡实验检测各组hAdMSC凋亡率，Western blot检测各组hAdMSC的mTOR/磷酸化mTOR（p-mTOR）和Akt/磷酸化Akt（p-Akt）蛋白表达。
结果与对照组相比，MDA-MB-231上清液组hAdMSC的24h和48h细胞划痕闭合面积、细胞增殖水平以及p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量均增加，细胞凋亡率降低（P＜0.05）；与MDA-MB-231上清液组相比，Akt抑制剂组和CXCR1/2抑制剂组hAdMSC的48h细胞划痕闭合面积、细胞增殖水平以及p-Akt和p-mTOR蛋白相对表达量均降低，细胞凋亡率均增加（P＜0.05）。
结论MDA-MB-231乳腺癌细胞培养上清液通过激活Akt-mTOR信号通路促进hAdMSC迁移和增殖，抑制hAdMSC凋亡，其中IL-8-CXCR1/2轴发挥关键作用。
关键词：乳腺肿瘤；细胞迁移；细胞增殖；肿瘤微环境；脂肪间充质干细胞中图分类号：R737.9文献标志码：A DOI：10.11958/20230255The mechanism of breast cancer cell culture supernatant promoting migration andproliferation of human adipose mesenchymal stem cellsLIU Danyang1,WANG Lulu2,HE Jun2,JIANG Yang2,LI Yongtao2,ZHANG Xiaodong2,LI Penghui2,SHEN Lei2△1Department of Histology and Embryology,2Medical Research Center,Qiqihar Medical College,Qiqihar161006,China△Corresponding Author E-mail:Abstract:Objective To explore the effect of MDA-MB-231breast cancer cell culture supernatant on migration, proliferation and apoptosis of human adipose mesenchymal stem cell(hAdMSC)and its molecular mechanism.Methods hAdMSC cultured from MDA-MB-231cell supernatant and RPMI-1640medium without fetal bovine serum were mixed at a volume ratio of1∶4to form the MDA-MB-231supernatant group.CXCR1/2inhibitor group was added with10µmol/L Reparixin(CXCR1/2inhibitor)to the MDA-MB-231supernatant group.The Akt inhibitor group was added with10nmol/L GSK690693(Akt inhibitor)to the MDA-MB-231supernatant group.hAdMSC cultured without any stimulation was used as the control group.The migration ability of hAdMSC in each group was detected by cell scratch assay.hAdMSC proliferation was detected by CCK-8assay.Annexin V-FITC/PI double labeled flow cytometry was used to detect hAdMSC apoptosis rate in each group.The protein expression levels of mTOR/phosphorylated mTOR(p-mTOR)and Akt/phosphorylated Akt(p-Akt)in hAdMSC of each group were detected by Western blot assay.Results Compared with the control group,the24h and48h scratch closure area,cell proliferation level and relative expression levels of p-Akt,p-mTOR protein of hAdMSC were increased in the MDA-MB-231supernatant group,and the apoptosis rate was decreased(P＜0.05).Compared with the MDA-MB-231supernatant group,the48h cell scratch closure area,cell proliferation level and relative expression levels of p-Akt,p-mTOR proteins of hAdMSC were decreased in the Akt inhibitor group and the CXCR1/2inhibitor group,and the apoptosis rate was increased(P＜0.05).Conclusion MDA-MB-231breast cancer cell culture supernatant promotes hAdMSC migration and proliferation and inhibits hAdMSC apoptosis by activating Akt-mTOR signaling pathway,in which IL-8-CXCR1/2axis plays a key role.Key words:breast neoplasms;cell migration;cell proliferation;tumor microenvironment;adipose derived mesenchymal stem cells基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究项目资助（2020-KYYWF-0010）；齐齐哈尔市科技计划联合引导项目（LHYD-2021002）作者单位：1齐齐哈尔医学院组织胚胎学教研室（邮编161006），2基础医学科研中心作者简介：刘丹阳（1982），女，讲师，主要从事肿瘤微环境与肿瘤生物学方面研究。
常用肿瘤细胞株的培养
常用肿瘤细胞株的培养常用肿瘤细胞株的培养是细胞试验室的日常工作之一，常用的肿瘤细胞株无数，各试验室所用法和保存的细胞株种类各异，培养的办法和习惯也不尽相同。
本节介绍了五种常用的肿瘤细胞株的培养和复苏、冻存的办法。
一、乳腺癌细胞株的培养乳腺癌细胞系的种类无数，而且功能各异，下面介绍几种常用的乳腺癌细胞系的培养的办法。
（一）MCF 一细胞株的培养 MCF-7是一种易于培养的人乳腺癌细胞，来源于乳腺腺癌组织，贴壁生长，形态不规章。
普通培养基采纳DMEM，含10％的。
贴壁生长后，2～3天即可传代。
【材料】 1．冻存的MCF-7细胞株。
2．培养基（DMEM）含10％、含EDTA终浓度为0.25％的,75％。
3．培养瓶、无菌的玻璃吸管或自立包装的塑料吸管、离心管。
【办法】 1．培养细胞的换液 (1)预备好超净工作台，将试剂及材料用75％杀菌后置于超净台，开头试验。
(2）从孵箱中取出培养瓶首先要认真观看培养基有无污染或衰退迹象。
(3)观看培养．基的pH和细胞密度及浓度，如培养基从红色变成橙色，或变成黄色，解释培养基的pH已变酸，需要更换培养基；如培养基从红变为紫色，解释培养基的pH已变碱，可能细胞已死亡，需拣出丢弃。
(4）将细胞培养瓶置于无菌工作区域，无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。
(5）用PBS反复冲洗细胞2～3遍，细胞培养条件要求苛刻的，可用细胞培养液冲洗细胞。
(6)加入预热的培养基，倒置显微镜下观看，放入培养箱中培养。
2．细胞的传代 (1)预备超净工作台，将试剂及材料用75％杀菌后置于超净台，开头试验。
(2)认真检查培养基DMEM有无污染或衰退迹象。
(3)在镜下观看MCF-7细胞是否需要传代（主要看细胞密度是否长至彼此汇集，铺满培养瓶即可传代），若需要传代，举行如下操作。
(4）将MCF-7细胞置于超净台无菌工作区中，弃去原培养基。
(5)加入无血清培养液并轻轻晃动培养瓶，用培养液清洗细胞，然后弃去清洗液。
细胞转移机制实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的本研究旨在探究细胞转移机制，以期为癌症转移的预防和治疗提供理论依据。
通过建立细胞转移模型，观察细胞在不同环境下的迁移和侵袭能力，分析细胞转移的相关分子机制。
二、实验材料1. 细胞：人乳腺癌细胞系MCF-7、人结直肠癌细胞系HCT-116、人肺腺癌细胞系A549、人黑色素瘤细胞系SK-MEL-2。
2. 试剂：细胞培养试剂、细胞迁移实验试剂、细胞侵袭实验试剂、实时荧光定量PCR试剂、蛋白质提取试剂、Western blot试剂等。
3. 仪器：细胞培养箱、显微镜、细胞培养板、酶标仪、凝胶成像系统、Western blot成像系统等。
三、实验方法1. 细胞培养：将人乳腺癌细胞系MCF-7、人结直肠癌细胞系HCT-116、人肺腺癌细胞系A549、人黑色素瘤细胞系SK-MEL-2接种于细胞培养瓶中，置于细胞培养箱中培养。
2. 细胞迁移实验：采用Transwell小室进行细胞迁移实验。
将细胞悬液加入Transwell小室的上室，下室加入含有血清的培养基，培养一段时间后，用棉签刮除未迁移的细胞，固定、染色、观察细胞迁移情况。
3. 细胞侵袭实验：采用Transwell小室进行细胞侵袭实验。
将细胞悬液加入Transwell小室的上室，下室加入含有基质胶的培养基，培养一段时间后，用棉签刮除未侵袭的细胞，固定、染色、观察细胞侵袭情况。
4. 实时荧光定量PCR：提取细胞总RNA，反转录成cDNA，进行实时荧光定量PCR，检测相关基因的表达水平。
5. 蛋白质提取与Western blot：提取细胞总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，转膜，用一抗和二抗进行Western blot，检测相关蛋白的表达水平。
四、实验结果1. 细胞迁移实验：结果显示，与正常细胞相比，癌细胞在迁移实验中的迁移距离明显增加，说明癌细胞具有较强的迁移能力。
2. 细胞侵袭实验：结果显示，与正常细胞相比，癌细胞在侵袭实验中的侵袭能力明显增强，说明癌细胞具有较强的侵袭能力。
《2024年4T1乳腺癌细胞微环境对RAW264.7巨噬细胞增殖及分化的影响》范文
《4T1乳腺癌细胞微环境对RAW264.7巨噬细胞增殖及分化的影响》篇一一、引言乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病机制复杂，涉及多种细胞和分子间的相互作用。
其中，肿瘤微环境在乳腺癌的发生、发展和转移过程中起着重要作用。
巨噬细胞作为肿瘤微环境中的重要组成部分，与肿瘤细胞的相互作用对肿瘤的发展具有深远影响。
本研究以4T1乳腺癌细胞与RAW264.7巨噬细胞为研究对象，探讨乳腺癌细胞微环境对巨噬细胞增殖及分化的影响。
二、材料与方法1. 细胞系本实验采用4T1乳腺癌细胞系和RAW264.7巨噬细胞系。
2. 实验方法（1）细胞培养：在体外培养4T1乳腺癌细胞和RAW264.7巨噬细胞，并调整细胞密度。
（2）共培养体系建立：将4T1乳腺癌细胞与RAW264.7巨噬细胞以不同比例共培养，模拟肿瘤微环境。
（3）检测指标：通过流式细胞术、免疫荧光、Western blot 等方法，检测巨噬细胞的增殖、分化及相关分子表达。
三、实验结果1. 巨噬细胞的增殖情况在4T1乳腺癌细胞微环境下，RAW264.7巨噬细胞的增殖情况受到显著影响。
共培养体系中，随着共培养时间的延长，巨噬细胞的增殖率逐渐提高，且与4T1乳腺癌细胞的密度呈正相关。
2. 巨噬细胞的分化情况在4T1乳腺癌细胞微环境的刺激下，RAW264.7巨噬细胞发生分化，表现为M1型和M2型巨噬细胞的比例发生变化。
其中，M1型巨噬细胞的比例降低，M2型巨噬细胞的比例升高。
3. 相关分子表达情况通过Western blot检测发现，在4T1乳腺癌细胞微环境下，巨噬细胞中相关分子的表达发生改变。
例如，M1型巨噬细胞的标志物如iNOS、TNF-α等表达降低，而M2型巨噬细胞的标志物如Arg-1、IL-10等表达升高。
四、讨论本研究结果表明，4T1乳腺癌细胞微环境对RAW264.7巨噬细胞的增殖及分化具有显著影响。
在肿瘤微环境中，巨噬细胞的增殖率提高，同时发生M1型向M2型的分化转变。
乳腺癌组织原代细胞安全操作及保养规程
乳腺癌组织原代细胞安全操作及保养规程背景乳腺癌是一种多发性恶性肿瘤，其发病率逐年上升。
乳腺癌组织原代细胞的培养与研究对于研究乳腺癌的发病机制以及开发相关治疗手段具有重要的意义。
然而，乳腺癌组织原代细胞的培养和操作需要特殊的安全措施，以保证实验人员的安全以及实验结果的可靠性。
安全操作规程实验前准备1.实验前需穿戴实验室专用的个人防护装备，包括实验服、手套、口罩和护目镜等。
2.准备完整的实验材料和设备，包括培养皿、培养基、培养箱、离心机和显微镜等。
实验操作细胞分离1.将乳腺癌组织样本放入无菌环境中，使用无菌器械进行细胞分离。
2.使用细胞培养基中的酶类，如胰蛋白酶等，进行组织的消化，使细胞得以分离。
3.分离后的细胞通过离心机进行离心，去除上清液，得到细胞沉淀。
培养细胞1.将细胞沉淀用培养基进行悬浮，使细胞均匀分布。
2.将细胞悬浮液转移到培养皿中，一般建议使用培养皿的表面涂层，如胶原蛋白、明胶等。
3.将培养皿放入培养箱中，设置适当的温度和湿度条件，通常为37摄氏度和5%二氧化碳浓度。
细胞培养条件1.细胞培养基应保持适当的pH值，通常为7.2-7.4，可通过添加缓冲液进行调节。
2.细胞培养箱中的培养基应定期更换，一般为2-3天一次。
3.细胞培养箱的温度、湿度和二氧化碳浓度应保持恒定，避免对细胞生长产生不良影响。
细胞处理与传代1.传代细胞前应检查细胞的状态，如细胞数量、生长形态等。
2.细胞传代前应注意将细胞培养基中的胶原酶等酶完全去除，避免对细胞影响。
3.传代时应进行细胞计数，以确定合适的传代比例，一般为1:3至1:5。
4.传代细胞后，应及时更换培养基，并将细胞培养箱恢复至正常的培养条件。
实验结束1.实验结束后，将培养皿和废弃物器皿等进行消毒处理，避免对环境产生污染。
2.将实验室的工作区域进行清洁和消毒，以确保实验的安全性和整洁性。
保养规程1.定期对培养箱进行维护，清洁箱体和控制系统，确保温度、湿度和二氧化碳浓度的准确性和稳定性。
乳腺癌细胞株整理
具有CD44+/hi/CD24-
/低癌症干细胞标记
LY2
浸润性导管癌
胸腔积液
DMEM培养基，90%;优质胎牛血清，10%。气相：37C,5%CO2
ER(+);PR(-);TP53(+/-)
MCF7
乳腺腺癌细胞
浸润性导管癌
乳腺，从转移位点(胸水)处获得/上皮细胞样，
MEM培养基中加入0.01mg/ml人重组胰岛素和10%胎牛血清。
细胞角蛋白19
HCC202
腺癌
乳房，乳腺
RPMI-1640，90%;优质胎牛血清，10%。气相：37°C,5%CO2
ER(-)；PR(-)；HER2(+);
TP53-
HCC2157
腺癌
乳房，乳腺
RPMI-1640，90%;优质胎牛血清，10%。气相：37°C,5%CO2
ER(-);PR(-);TP53+
贴壁生长，三阴，转移性乳腺导管腺癌
MDA-MB-436
乳腺腺癌细胞
浸润性导管癌
乳腺腺癌胸水转移灶/
有多核成分的多形细胞
L-15培养添加10ug/ml胰岛素和16ug/ml谷胱甘肽，90%;优质胎牛血清，10%。气相：空气，100%。温度：37°C。
ER(-);PR(-);TP53-
MDA-MB-453
DMEM培养基，90%;优质胎牛血清，10%。气相：37C,5%CO2
ER(+);PR(+);P53(+/-Wt表达WNT7B表达胰岛素样生长因子结合蛋白
(IGFBP)BP-2;BP-4;BP-
5;TNF-a可以抑制MCF-7细胞的生长；
MCF-10A
MCF-7培养
MCF/Adr人乳腺癌阿霉素耐药细胞Cat Number：KG031-1For Research Use Only一、组成:组份KG031-1细胞一瓶25cm2细胞说明书1份细胞培养注意事项1份二、客户自备试剂:1、PBS(凯基货号：KGB500)2、Complete growth medium(凯基货号：KGM1640SF)3、0.25%（W/V）Trypsin-0.53mM EDTA(凯基货号：KGY001)三、细胞简介:培养基:RPMI-1640+10%进口胎牛血清+1%双抗+1000ng/ml阿霉素消化液0.25%胰蛋白酶+0.53mMol/L EDTA冻存液胎牛血清:DMSO=9:1培养条件二氧化碳培养箱:温度37℃,5%的二氧化碳客户收到细胞后按照下面的要求操作：培养瓶里面的培养液是不含药物的。
待细胞长到70-80%的汇合度时，去掉培养液，加入含500ng/ml阿霉素药物的培养液，放入培养箱，这段时间肯定会有小部分细胞悬浮起来，但是不要紧，通过换液可以去掉，下面的细胞待长满就可以消化传瓶了，这时可以一直用含药培养液来消化培养细胞，一两代之后可以将药物浓度提高到1000ng/ml，含药培养液用于细胞培养都没问题的，冻存的时候就不要在冻存液里面加药物了。
四、常见问题及解决方案:1、培养瓶有破裂，培养液有漏液：细胞极大可能会污染，所以我们会及时安排帮老师解决。
2、细胞漂浮：培养瓶不开封，瓶口酒精擦拭后平躺放置在培养箱。
次日观察，如细胞大部分又贴回瓶底，表明细胞活力正常，剩余漂浮的细胞可以离心去掉，留10ml培养液培养观察，细胞生长至汇合度80%，进行消化传代；如细胞还是不贴壁，将细胞离心收集转到新培养瓶，原培养瓶加部分培养液继续培养，中间注意观察，我们的技术人员会一直跟踪指导，直到问题解决。
客户收到细胞后请务必仔细阅读细胞注意事项，确保细胞的培养条件一致，如果由于培养条件不一致导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。
癌细胞定植实验报告
一、实验目的本研究旨在通过体外实验，观察和探讨癌细胞在异种组织中的定植过程，为癌症转移的机制研究和治疗策略提供实验依据。
二、实验材料1. 细胞株：人乳腺癌细胞系MCF-7、人肺腺癌细胞系A549、人肝细胞癌细胞系HepG2、人黑色素瘤细胞系A375。
2. 培养基：DMEM培养基、RPMI-1640培养基。
3. 胶原酶：0.25%胰蛋白酶。
4. 细胞计数板。
5. 实验器材：显微镜、细胞培养箱、CO2培养箱、离心机、移液器、培养皿等。
三、实验方法1. 细胞培养：将人乳腺癌细胞系MCF-7、人肺腺癌细胞系A549、人肝细胞癌细胞系HepG2、人黑色素瘤细胞系A375分别接种于培养皿中，置于CO2培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期时，收集细胞用于实验。
2. 细胞悬液制备：将收集的细胞用胰蛋白酶消化，制成细胞悬液，调整细胞浓度至1×10^6个/mL。
3. 定植实验：将实验细胞悬液分别接种于盖玻片上，每个细胞系设置3个复孔。
将盖玻片放入含有基质胶的培养皿中，37℃、5%CO2培养箱中培养24小时，观察细胞形态。
4. 悬浮培养：将细胞悬液接种于6孔板中，每组细胞设置3个复孔，加入适量培养基，置于CO2培养箱中培养。
5. 定植观察：培养24小时后，取出盖玻片，置于显微镜下观察细胞形态及定植情况。
6. 细胞计数：培养48小时后，用胰蛋白酶消化收集细胞，调整细胞浓度，采用细胞计数板进行计数。
四、实验结果1. 细胞形态观察：实验细胞在基质胶上培养24小时后，观察到细胞形态良好，呈梭形或圆形，与正常细胞形态相似。
2. 定植观察：培养24小时后，显微镜下观察到细胞在盖玻片上均匀分布，呈单层生长，无重叠现象。
3. 细胞计数：培养48小时后，细胞计数结果显示，实验细胞在基质胶上生长良好，细胞数量明显增多。
五、讨论本研究通过体外实验，观察了癌细胞在异种组织中的定植过程。
实验结果显示，实验细胞在基质胶上生长良好，且能形成单层细胞，说明癌细胞具有一定的定植能力。
Matrigel三维细胞培养方法培养的原代乳腺癌细胞生长情况及对阿霉素敏感性观察
Matrigel三维细胞培养方法培养的原代乳腺癌细胞生长情况及对阿霉素敏感性观察张震;齐晓敏;张薇;张培;曹旭晨;肖春花【摘要】Objective To observe the growth of primary breast cancer cells cultured in Matrigel three-dimensional cell culture method and its sensitivity to adriamycin.Methods The primary breast cancer cells were cultured by two-dimensional monolayer culture and Matrigel three-dimensional cell culture methods.On the 1st, 3rd, 5th and 7th day of culture, Olympus IX70 inverted microscope was used to observe the morphology of primary breast cancer cells under the condition of two-dimensional monolayer culture and three-dimensional culture.CellTiter-Glo(R) Luminescent Cell Viability Assay was applied to observe the cell proliferation and its sensitivity to adriamycin.Primary breast cancer cell growth curve and drug sensitivity curve were drawn based on the observation results.Results The primary breast cancer cells with two-dimensional monolayer culture were in adherent growth, and the cancer cells gathered like a nest, with a variety of forms.The primary breast cancer cells with three-dimensional cell culture gathered into close multi-tumor cell microspheres.The proliferation of primary breast cancer cells cultured by two-dimensional monolayer culture on the 1st, 3rd, 5th and 7th day was 1.00±0.00, 1.39±0.29, 2.08±0.25 and 3.26±0.41.The proliferation of primary breast cancer cells cultured by Matrigel three-dimensional cell culture was 1.00±0.00, 1.25±0.08, 1.79±0.10 and 1.58±0.02.With theincrease of adriamycin concentration, the inhibition rate of proliferation of primary breast cancer cells increased under two-dimensional monolayer culture and three-dimensional culture.But the proliferation inhibition rateof primary breast cancer cells with three-dimensional cell culture was lower than that with two-dimensional cell culture.Conclusion The primary breast cancer cells with Matrigel three-dimensional cell culture can gather into close spheres, the cell proliferation rate slows down, and the sensitivity of adriamycin decreases.Matrigel three-dimensional cell culture is better for culturing primary breast cancer cells.%目的观察Matrigel三维细胞培养方法培养的原代乳腺癌细胞生长情况及其对阿霉素的敏感性.方法分别采用二维单层培养法、Matrigel三维细胞培养方法培养原代乳腺癌细胞.在培养的第1、3、5、7天,采用Olympus Ⅸ70倒置显微镜观察二维单层培养及三维培养条件下的原代乳腺癌细胞形态, 采用CellTiter-Glo(R)发光法观察细胞生长增殖情况及其对阿霉素的敏感性,绘制原代乳腺癌细胞生长曲线及药敏曲线.结果二维单层培养的原代乳腺癌细胞贴壁生长,癌细胞聚集成巢状,呈多种形态.三维细胞培养的原代乳腺癌细胞聚集成紧密的多肿瘤细胞微球.二维单层培养第1、3、5、7天原代乳腺癌细胞的增殖倍数分别为1.00±0.00、1.39±0.29、2.08±0.25、3.26±0.41;三维培养第1、3、5、7天原代乳腺癌细胞的增殖倍数分别为1.00±0.00、1.25±0.08、1.79±0.10、1.58±0.02.随阿霉素浓度升高,二维单层培养及三维培养下的原代乳腺癌细胞增殖抑制率增高.但三维细胞培养的原代乳腺癌细胞增殖抑制率均低于二维细胞培养.结论 Matrigel三维细胞培养的原代乳腺癌细胞可聚集成紧密的球形,细胞增殖速度变慢,对阿霉素的敏感性降低.Matrigel三维细胞培养原代乳腺癌细胞效果较好.【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2017(057)019【总页数】4页(P17-20)【关键词】乳腺肿瘤;乳腺癌;Matrigel三维细胞培养方法;细胞形态;细胞增殖;药物敏感性【作者】张震;齐晓敏;张薇;张培;曹旭晨;肖春花【作者单位】天津医科大学肿瘤医院,国家肿瘤临床医学研究中心,天津300060;天津市"肿瘤防治"重点实验室;天津市恶性肿瘤临床医学研究中心;天津医科大学肿瘤医院,国家肿瘤临床医学研究中心,天津300060;天津市"肿瘤防治"重点实验室;天津市恶性肿瘤临床医学研究中心;天津医科大学肿瘤医院,国家肿瘤临床医学研究中心,天津300060;天津市"肿瘤防治"重点实验室;天津市恶性肿瘤临床医学研究中心;天津医科大学肿瘤医院,国家肿瘤临床医学研究中心,天津300060;天津市"肿瘤防治"重点实验室;天津市恶性肿瘤临床医学研究中心;天津医科大学肿瘤医院,国家肿瘤临床医学研究中心,天津300060;天津市"肿瘤防治"重点实验室;天津市恶性肿瘤临床医学研究中心;天津医科大学肿瘤医院,国家肿瘤临床医学研究中心,天津300060;天津市"肿瘤防治"重点实验室;天津市恶性肿瘤临床医学研究中心【正文语种】中文【中图分类】R734.2乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，病死率占女性癌症死亡原因的15%[1]。
癌症细胞实验报告
一、实验目的本实验旨在研究癌症细胞的生长特性、细胞周期调控以及抗癌药物对其的影响，以期为癌症的早期诊断、治疗和预后评估提供科学依据。
二、实验材料1. 细胞：人肺癌细胞系A549、人乳腺癌细胞系MCF-7、人胃癌细胞系SGC-7901。
2. 试剂：DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、MTT试剂、CCK-8试剂、5-氟尿嘧啶（5-FU）、顺铂（DDP）等。
3. 仪器：细胞培养箱、显微镜、酶标仪、超净工作台、离心机等。
三、实验方法1. 细胞培养：将人肺癌细胞系A549、人乳腺癌细胞系MCF-7、人胃癌细胞系SGC-7901分别接种于培养瓶中，在37℃、5%CO2的条件下培养。
2. 细胞增殖实验：（1）MTT法：将不同浓度的5-FU和DDP加入细胞培养体系中，培养24小时后，加入MTT试剂，继续培养4小时，检测吸光度值，计算细胞抑制率。
（2）CCK-8法：将不同浓度的5-FU和DDP加入细胞培养体系中，培养24小时后，加入CCK-8试剂，检测吸光度值，计算细胞抑制率。
3. 细胞周期检测：采用流式细胞术检测不同浓度的5-FU和DDP对细胞周期的影响。
4. 细胞凋亡检测：采用Annexin V-FITC/PI双重染色法检测不同浓度的5-FU和DDP对细胞凋亡的影响。
四、实验结果1. 细胞增殖实验：（1）MTT法：结果显示，随着5-FU和DDP浓度的增加，A549、MCF-7和SGC-7901细胞的吸光度值逐渐降低，细胞抑制率逐渐升高。
（2）CCK-8法：结果显示，随着5-FU和DDP浓度的增加，A549、MCF-7和SGC-7901细胞的吸光度值逐渐降低，细胞抑制率逐渐升高。
2. 细胞周期检测：结果显示，5-FU和DDP处理后的细胞周期分布发生改变，G2/M 期细胞比例升高，S期细胞比例降低。
3. 细胞凋亡检测：结果显示，5-FU和DDP处理后的细胞凋亡率逐渐升高。
五、实验讨论1. 本实验通过MTT法和CCK-8法检测了5-FU和DDP对A549、MCF-7和SGC-7901细胞的抑制率，结果表明这两种药物对三种癌细胞均具有显著的抑制作用。
去胰岛素的乳腺癌干细胞培养及雌激素诱导的作用
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２２ ９７ ・
［ 文章编号 ］ １ ０ ０ ０ — ４ ７ １ ８ （ ２ ０ １ ３ ） １ ２ — ２ ２ ９ ７ — ０ ４
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MCF-7 就是一种很好养的人乳腺癌细胞,培养基用DMEM或RPMI1640均可, 10－15％的小牛血清就能长得很好。
一般两到三天传一代。
传代也很常规。
吸出培养基,加入0、25％的胰酶1ml,轻轻晃动培养瓶,使胰酶流遍瓶壁,以去除残余的培养基。
再加入2ml胰酶(25ml培养瓶)静置消化2－5min,待细胞缩起变圆,将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。
我一般都不用缓冲液冲洗,而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用,感觉效果还不错。
因为MCF-7消化较快,一般不放到培养箱中消化,以免消化太过。
需要注意的就是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起,一般都来不及抢救。
MDA-MB-231人乳腺癌细胞细胞中文名称人乳腺癌细胞细胞英文名称 MDA-MB-231物种人细胞形态特征上皮样细胞生长特性贴壁生长细胞特种特性 MDA-MB-231就是从一名51岁的白人女性乳腺癌患者的胸水中分离建立的。
该细胞表达表皮生长因子EGF受体、TGF-α受体与WNT7B癌基因培养基 L15: Leibovitz Medium血清 10%FBS细胞传代方法 1:2~1:4传代;每周2~3次细胞传代情况 C5细胞冻存条件MDA-MB-231 人乳腺癌细胞基础培养基+5%DMSO+20%FBS支原体检测阴性说明培养基:DMEM 90%, Fetal Bovine Serum 10%培养条件:37℃ 5% CO2消化条件:0、25% (w/v) Trypsin-0、53mM EDTA溶液,消化5-10min传代的比例:1:2~1:4换液时间:2~3天换液一次冻存液比例:85%培养基,10%FBS, 5% (v/v) DMSO冻存密度:1-2 ×10 6/管,液氮保存MDA-MB-231 人乳腺癌细胞复苏方法:取出冻存管后,投入37 ℃水浴中,震荡解冻2 min,酒精消毒管壁外侧后,将其转入超净台中,将管内细胞转移至离心管中,加入5 ml 37 ℃预热的培养基,并清洗冻存管一次,将离心管离心(1000 rpm,5 min),弃去上清液,再加入2 ml培养基,转入培养瓶中培养。
产品名称:人正常乳腺细胞 Hs 578Bst规格:70%密度的25cm2培养瓶的细胞一瓶特点:细胞代数为4-5代左右包装:内层无菌自封袋;专用防压泡沫盒;外层防压保温气泡袋;说明书细胞来源:ATCC、sciencell、ICLC货期:1-2周运输方式:快递运输售后:收到细胞后7天,如发现细胞有质量问题(如污染,死亡,快递运输等原因)时,应出具书面质量问题报告并及时传真或E-mail致销售人员,我们将尽快为您解决。
细胞培养常见问题分析细胞培养1、冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后,须立即放入37 ℃水槽中快速解冻,轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化,并注意水面不可超过冷冻管盖沿,否则易发生污染情形。
另冷冻管由液氮桶中取出解冻时,必须注意安全,预防冷冻管之爆裂。
2、细胞冷冻管解冻培养时,就是否应马上去除DMSO？除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外,绝大部分细胞株(包括悬浮性细胞),在解冻之后,应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中,待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可,如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
3、可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。
每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基,若骤然使用与原先提供之培养条件不同之培养基,细胞大都无法立即适应,造成细胞无法存活。
4、可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。
血清就是细胞培养上一个极为重要的营养来源,所以血清的种类与品质对于细胞的生长会产生极大的影响。
来自不同物种的血清,在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同,血清使用错误常会造成细胞无法存活。
5、何谓FBS, FCS, CS, HS ?FBS (fetal bovine serum)与FCS (fetal calf serum)就是相同的意思,两者都就是指胎牛血清, FCS 乃错误的使用字眼,请不要再使用。
CS (calf serum)则就是指小牛血清。
HS (horseserum)则就是指马血清。
6、培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作为pH 的缓冲系统,而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。
当培养基中NaHCO3 含量为每公升3、7 g 时,细胞培养时应使用10 % CO2;当培养基中NaHCO3 为每公升1、5 g 时,则应使用5 % CO2 培养细胞。
7、何时须更换培养基？视细胞生长密度而定,或遵照细胞株基本数据上之更换时间,按时更换培养基即可。
8、培养基中就是否须添加抗生素？除于特殊筛选系统中外,一般正常培养状态下,培养基中不应添加任何抗生素。
9、附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0、05% trypsin-0、53mMEDTA、4 Na。
次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于–20 ℃,避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低,并可减少污染之机会。
10、悬浮性细胞应如何继代处理？一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中,稀释细胞浓度即可,若培养液太多时,可将培养角瓶口端稍微抬高,直到无法容纳为止。
分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶,加入新鲜培养基稀释至适当浓度,重复前述步骤即可。
11、欲将一般动物细胞离心下来,其离心速率应为多少转速？欲回收动物细胞,其离心速率一般为300xg (约1,000rpm),5 - 10 分钟,过高之转速,将造成细胞死亡。
12、细胞之接种密度为何？依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。
细胞数太少或稀释的太多亦就是造成细胞无法生长之一重要原因。
13、细胞冷冻培养基之成份为何？动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基就是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide)与90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。
注意:由于DMSO 稀释时会放出大量热能,故不可将DMSO 直接加入细胞液中,必须使用前先行配制完成。
14、DMSO 之等级与无菌过滤之方式为何？冷冻保存使用之DMSO 等级,必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650),其本身即为无菌状况,次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中,保存于4°C,避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质,并可减少污染之机会。
若要过滤DMSO,则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。
15、冷冻保存细胞之方法？冷冻保存方法一: 冷冻管置于4℃30~60 分钟→(-20 ℃30 分钟*) → -80 ℃16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase长期储存。
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 ℃至–80 ℃以下,再放入液氮槽vapor phase长期储存。
*-20 ℃不可超过1 小时,以防止冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。
15、细胞欲冷冻保存时,细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial,融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。
16、应如何避免细胞污染？细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒与霉浆菌。
主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清与污染之细胞等。
严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源与培养基配制就是减低污染之方法。
17、如果细胞发生微生物污染时,应如何处理？加入相应抗生素。
直接灭菌后丢弃之。
18、支原体(mycoplasma)污染的细胞,就是否能以肉眼观察出异状？不能。
除极有经验之专家外,大多数遭受支原体污染的细胞株,无法以其外观分辨之。
19、支原体污染会对细胞培养有何影响？支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数,代谢及研究之任一数据。
故进行实验前,必须确认细胞为mycoplasma-free,实验结果之数据方有意义。
20、CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？定期(至少每两周一次)以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。
21、为何培养基保存于4 ℃冰箱中,颜色会偏暗红色,且pH值会越来越偏碱性？培养基保存于4 ℃冰箱中,培养基内之CO2 会逐渐溢出,造成培养基越来越偏碱性。
而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red)的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。
培养基偏碱之结果,将造成细胞生长停滞或死亡。
若培养基偏碱时,可以通入无菌过滤之CO2,以调整pH 值。
22、各种细胞培养用的dish,flask就是否均相同？不同厂牌的dish 或flask,其所coating 的polymer 不同,制造程序亦不同,虽对大部分细胞没有太大之影响,惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。
23、购买之细胞冷冻管经解冻后,为何会发生细胞数目太少之情形？购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？研究人员在细胞培养时出现存活率不佳,常见原因可归纳为:培养基使用错误或培养基品质不佳。
血清使用错误或血清的品质不佳。
解冻过程错误。
冷冻细胞解冻后,加以洗涤细胞与离心。
悬浮细胞误认为死细胞。
培养温度使用错误。
细胞置于–80℃太久。
24、收到之冷冻管瓶身破裂,瓶盖有裂纹,或瓶盖脱落之原因？冷冻管瓶盖裂纹,或瓶身破裂,可能就是因为操作者夹取冷冻管时用力不当,造成冷冻管裂损,建议使用止血钳小心夹取。
另冷冻管瓶盖松动或松脱,乃因热胀冷缩之物理现象,冷冻管有可能因此而造成细胞污染,故冷冻管于放入与取出液氮桶时,均应立刻将冷冻管再一次扭紧。
25、如何选用特殊细胞系培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件。
在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。
总之,首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养就是一个好的开始,各种目的无血清培养首选AIM V(12005)培养基(SFM)。
26、L-谷氨酰胺在细胞培养中重要不？它在溶液中不稳定不？L-谷氨酰胺在细胞培养时就是重要的。
脱掉氨基后,L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成与核酸代谢。
L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解,但就是确切的降解率一直没有最终定论。
L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成,而氨对于一些细胞具有毒性。
27、GlutaMAX-I就是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？GlutaMAX-I 二肽就是一个L-谷氨酰胺的衍生物,其不稳定的alpha-氨基用L-丙氨酸来保护。