基因工程基因克隆所需的工具酶
基因工程常用的工具酶
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识别序列呈典型的旋转对称型回文结构
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
回文结构:两条核苷酸链的核酸序列呈双重旋转对称排列的 DNA双螺旋结构
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第三节 DNA聚合酶
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DNA聚合酶：能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤 的一类酶
❖作用特点
能够把脱氧核苷酸分子连续的加到DNA分子引物链的3’-OH末端，催 化核苷酸的聚合
❖作用条件
➢ 脱氧核苷酸原料：四种脱氧核苷三磷酸dNTP（dATP、dTTP、 dCTP、dGTP）
属名
种名
株名
Haemophilus influenzae d
HindΙ、 HindⅡ、 Hind Ⅲ
不同限制修饰系统
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三、Ⅱ型限制酶的特性-识别序列
识别双链DNA分子中特定的4 - 8对核苷酸序列
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
5‘ HO 3‘ HO
T4-PNP
5‘ p 3‘ HO
OH 3‘ OH 5‘
Mg2+ pppATP（g-32P-ATP）
OH 3‘
5‘ HO
BAP / CIP
基因工程中常用的三种工具酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。
2．类型：来自原核生物，有三种类型。
Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。
Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。
另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。
同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。
与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。
常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。
显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。
但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。
Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。
三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。
基因工程基因工程工具酶
基因工程工具酶引言基因工程是一门利用重组DNA技术来改变生物体遗传性状的学科。
在基因工程的过程中，基因工程工具酶发挥着关键的作用。
本文将介绍几种常用的基因工程工具酶，包括限制性内切酶、连接酶和修饰酶。
一、限制性内切酶1.1 定义限制性内切酶（Restriction Enzyme）是一类具有特异性切割DNA双链的酶。
它可以识别并切割DNA的特定序列，通常这个序列是对称的，在切割后会产生特定的片段。
1.2 工作原理限制性内切酶能够通过识别和结合DNA的特定序列来进行切割。
它们通常识别的序列是4到8个碱基对长，具有一定的对称性。
一旦内切酶与特定序列结合，它会切断DNA的链，在特定的位置形成断裂，从而将DNA切割成特定的片段。
1.3 应用限制性内切酶在基因工程中有着广泛的应用。
它们可以用于构建基因工程载体、进行DNA片段的精确克隆等。
通过选择适当的限制性内切酶，可以对DNA进行特定的切割和连接，从而实现对目标基因的定向操作。
二、连接酶2.1 定义连接酶（Ligase）是一种酶类，能够将两条DNA片段连接起来。
在基因工程中，连接酶通常被用于连接目标基因和载体。
2.2 工作原理连接酶通过催化两条DNA片段之间的磷酸二酯键的形成来连接DNA。
它可以将两条具有互补末端的DNA片段连接在一起，形成一个新的DNA分子。
2.3 应用连接酶在基因工程中的应用非常广泛。
它们可以用于构建重组DNA分子、进行目标基因的插入等。
通过连接酶的作用，可以将多个DNA片段连接起来，构建出符合需要的重组DNA分子。
三、修饰酶3.1 定义修饰酶是指能够修饰DNA分子的酶类。
在基因工程中，修饰酶通常被用于添加或去除特定的DNA序列。
3.2 工作原理修饰酶可以通过催化酸解或碱解反应来改变DNA分子的结构。
它们可以添加或去除DNA上的甲基基团、酶解酶切位点等。
3.3 应用修饰酶在基因工程中起着重要的作用。
它们可以用于DNA甲基化的分析、目标基因的修饰等。
基因工程的基本工具_基因工程的原理及技术_基因工程和蛋白质工程的应用-高中生物知识点
基因工程的基本工具_基因工程的原理及技术_基因工程和蛋白质工程的应用-高中生物知识点·基因工程基因工程三种工具原理及基因工程的四个步骤一、基因工程需要三个工具：1、剪刀：限制酶。
2、针线：DNA连接酶。
3、运输：运载体。
二、基因工程四个步骤：1、目的基因的获取。
2、基因表达载体的构建目的基因与运载体结合。
3、将目的基因导入受体细胞。
4、目的基因的检测与表达。
基因工程又称基因拼接技术和DNA重组技术。
是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。
基因工程，又称基因操作，DNA重组技术，基因克隆，分子克隆等。
克隆就是来自同一祖先的相同副本或拷贝的集合，而获得同一拷贝的过程则称为克隆化，也就是无性繁殖。
蛋白质工程是研究蛋白质的结构及结构与功能的关系，然后人为地设计一个新蛋白质，并按这个设计的蛋白质结构去改变其基因结构，从而产生新的蛋白质。
1983年，美国生物学家厄尔默首先提出了“蛋白质工程”的概念，随即被广泛接受和采用。
蛋白质工程是以蛋白质结构与功能关系的知识为基础，通过周密的分子设计，把蛋白质改造为合乎人类需要的新的蛋白质。
人们利用分子遗传学的知识和对蛋白质结构的了解，在实验室条件下，设计出全新的优良蛋白质。
利用基因工程生产的胰岛素就是蛋白质工程的第一个成功范例。
由于蛋白质工程是在基因工程的基础上发展起来的，在技术方面有许多同基因工程技术相似的地方，因此人们也把蛋白质工程称为第二代基因工程。
蛋白质工程与基因工程的区别蛋白质工程就是根据蛋白质的精细结构与功能之间的关系，利用基因工程的手段，按照人类自身的需要，定向地改造天然的蛋白质，甚至创造新的、自然界本不存在的、具有优良特性的蛋白质分子。
蛋白质工程自诞生之日起，就与基因工程密不可分。
基因工程-第二章--基因克隆所需的工具酶
常用限 制性内 切酶种 类及特 性
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
6、限制性内切酶的星号活性
在某些反应条件下，限制酶识别顺序的 特异性可能发生变化，结果一种限制酶 酶切同一种DNA片断会产生新的酶切位点， 得到不同的酶切片断，这就是限制酶的 星号活性（ activity） 星号活性（star activity） EcoR 1 GAATTC---- AATT
第二章 基因克隆所需的工具酶
限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 限制性内切酶 DNA甲基化酶 甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 DNA甲基化酶 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸酶 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸聚合酶 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸连接酶 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 核酸末端修饰酶 其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等 其它酶类
2010-11-8
苏州科技学院生物系
叶亚新
四．限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点 识别４ １）识别４-8个相连的核苷酸 MboI NGATCN； NGATCN；AvaII GG(A/T)CC Bam HI GGATCC； GGATCC；PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC N’ N N N CCGG N N’N’N’N’ CCGG Fok I 5 -ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’ 5’-ＧＧＡＴＧ( )93’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突 -ＣＣＴＡＣ( )13- 外侧，产生５ 起 富含ＧＣ ２）富含ＧＣ
基因工程常用的工具酶
农作物的产量和质量。
医学领域
基因工程被用于治疗遗传性疾 病、癌症、感染性疾病等，以 及制备疫苗和单克隆抗体。
工业领域
基因工程被用于生产高价值的化 学品、生物燃料和生物材料等， 降低生产成本和提高产品质量。
基础研究
基因工程被用于研究基因的结构 和功能、蛋白质的表达和调控等
常见的限制性核酸内切酶包括EcoRI、BamHI、HindIII等。
DNA聚合酶
DNA聚合酶是催化DNA复制过程中 DNA聚合反应的酶。
常见的DNA聚合酶包括Taq酶和T7噬 菌体DNA聚合酶等。
DNA聚合酶具有合成DNA的功能，可以在 模板DNA的指导下，将脱氧单核苷酸逐个加 到引物RNA的3'-OH末端，形成新的互补链 。
，促进生命科学领域的发展。
02 基因工程常用的工具酶概 述
工具酶的定义与分类
定义
工具酶是指用于基因工程操作的一类 酶，能够催化DNA或RNA的切割、连 接、修饰等反应，是基因工程实验中 必不可少的工具。
分类
根据功能的不同，工具酶可以分为限 制性核酸内切酶、DNA聚合酶、反转 录酶、T4核酸连接酶等。
工具酶在生物制药和农业生产中应用广泛，如基因工程的抗体药物、疫
苗、农作物改良等领域，能够提高产品的产量和质量。
工具酶的来源与生产
来源
工具酶主要来源于微生物、植物和动 物等生物体，其中微生物来源的酶是 最常用的。
生产
工具酶的生产通常采用基因工程技术 ，通过克隆和表达酶的基因来获得相 应的酶蛋白，再经过纯化和复性等步 骤得到高活性的工具酶。
VS
转录激活因子
激活特定基因的表达，实现基因治疗。
分子克隆技术常用的工具酶
已分离到与许多Ⅱ类限制酶相对应的甲基化酶。其命名是在 对应II类限制酶名称前加一个M表示。
如M．EcoR I是能使EcoR I识别序列中(GAATTC)3’-端的A甲
基化(GAm6ATTC)的酶
识别序列中某些碱基甲基化对II类限制酶的影响至 少有3种：
①敏感的，甲基化后不能再切割；
DNA用的乙醇。
2）甲基化
识别序列中某些碱基甲基化后会阻碍酶活性。 限制酶识别序列内或其邻近的胞嘧啶、腺嘌呤或尿嘧啶被甲基化后，会 阻碍限制酶的酶解活性。 受甲基化影响的酶在商品说明书中都会有标示。
所用符号为：m4C表示N4-甲基化胞嘧啶，m5C为C5-甲基胞嘧啶。
3）底物性状
随底物的不同而活性发生改变
仅2003年1-4月份就有150余种新的酶被登录入网，至2003年 04月19日, REBASE (The Restriction Enzyme Database) 收集的 编号已有7096种；其中Ⅱ类酶有3845种．
根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修饰活性等， 一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ 三大类。
②不敏感的．甲基化后仍可切割；
③依赖于甲基化的，只有甲基化后才能切割。
一、大肠杆菌DNA聚合酶 I
1 三种酶活性 1 ）DNA聚合活性
5' A T
||| |
3' T A C G dTTTP
5'
5’ 5’
引物
2）核酸外切酶活性
5’ A G C T T C A G G A T A
(-) 放线菌素D (-)
DNA合成
RNA
DNA(前病毒)
RNA
逆转录酶的应用:
应用于基因工程
基因工程试题及答案
基因工程试题及答案# 基因工程试题及答案## 一、选择题1. 基因工程中常用的工具酶是：A. 限制性内切酶B. DNA聚合酶C. 逆转录酶D. DNA连接酶2. 基因工程中，用于目的基因的克隆通常使用：A. 质粒B. 噬菌体C. 人工染色体D. 转座子3. 下列哪项不是基因工程的应用领域？A. 农业改良B. 疾病治疗C. 能源开发D. 武器制造## 二、填空题1. 基因工程中，常用的宿主细胞包括________、________和________。
2. 基因枪法是一种________技术，可以将目的基因直接导入植物细胞。
## 三、简答题1. 简述基因工程的基本操作步骤。
2. 基因工程在医药领域的应用有哪些？## 四、论述题1. 论述基因工程对现代农业的影响及其潜在风险。
## 参考答案### 一、选择题1. 答案：A, D。
限制性内切酶和DNA连接酶是基因工程中用于切割和连接DNA片段的常用工具酶。
2. 答案：A。
质粒是基因工程中常用的载体，用于克隆和表达目的基因。
3. 答案：D。
基因工程的应用领域广泛，但武器制造不属于其应用范围。
### 二、填空题1. 答案：大肠杆菌、酵母菌、哺乳动物细胞。
这些是基因工程中常用的宿主细胞，用于表达外源基因。
2. 答案：基因转移。
基因枪法是一种基因转移技术，通过高速微粒子将DNA射入细胞内。
### 三、简答题1. 答案：基因工程的基本操作步骤包括：目的基因的获取、载体的选择与构建、目的基因与载体的连接、转化宿主细胞、筛选含有目的基因的细胞、目的基因的表达与检测。
2. 答案：基因工程在医药领域的应用包括：生产重组蛋白药物、基因治疗、疫苗开发、疾病诊断等。
### 四、论述题1. 答案：基因工程对现代农业的影响主要体现在作物改良、提高产量、增强抗病虫害能力等方面。
通过基因工程，可以培育出抗旱、抗盐碱、抗病的作物新品种，提高作物的适应性和产量。
然而，基因工程也存在潜在风险，如基因流可能导致非目标物种的基因改变，以及转基因作物对生态环境的影响等。
《基因工程的工具——酶与载体》 知识清单
《基因工程的工具——酶与载体》知识清单基因工程作为现代生物技术的核心领域之一，为人类带来了前所未有的机遇和挑战。
而在基因工程中，酶和载体是至关重要的工具，它们就像是工匠手中的精巧工具，帮助我们实现对基因的精确操作和转移。
一、基因工程中的酶1、限制性内切酶限制性内切酶，也被称为“分子剪刀”，是基因工程中最重要的工具酶之一。
它能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点将 DNA 分子切断。
这种特性使得我们能够从复杂的 DNA 分子中切取特定的基因片段。
不同的限制性内切酶识别的序列不同，这为基因工程的操作提供了丰富的选择。
限制性内切酶的作用就像是一把精准的剪刀，能够在 DNA 这个长长的“绳子”上剪出我们需要的特定片段。
比如，EcoRI 能识别GAATTC 序列，并在 G 和 A 之间切断 DNA 双链。
2、 DNA 连接酶当我们用限制性内切酶切下所需的基因片段后，需要将它们与其他DNA 片段连接起来，这时候就轮到 DNA 连接酶发挥作用了。
DNA 连接酶能够将两个具有相同黏性末端或平末端的 DNA 片段连接在一起，形成一个完整的 DNA 分子。
想象一下，DNA 连接酶就像是一个“胶水”，把被剪开的 DNA 片段重新粘在一起，使它们成为一个连续的整体。
3、 DNA 聚合酶在基因工程中，DNA 聚合酶常用于 DNA 的复制和扩增。
例如，PCR（聚合酶链式反应）技术就依赖于耐高温的 Taq DNA 聚合酶。
通过 PCR 技术，我们可以在体外大量扩增特定的 DNA 片段，为后续的实验和应用提供足够的材料。
4、反转录酶反转录酶能够以 RNA 为模板合成互补的 DNA（cDNA）。
这在获取真核生物的基因时非常有用，因为真核生物的基因中含有内含子，而通过反转录得到的 cDNA 不含内含子，更便于在原核生物中表达。
二、基因工程中的载体1、质粒质粒是一种存在于细菌细胞质中的小型环状 DNA 分子。
它具有自主复制能力，可以在细菌细胞内独立存在和复制。
生物技术课件——基因工程常用工具酶
HO GCA…5’
5’…ACGAATTCGT…3’
T4DNA连接酶 Mg2＋，ATP
3’…TGCTTAAGCA…5
反应系统：ATP，Tris－HCl，MgCl2，DTE（二硫赤藓糖醇），ATP， pH7.5，4～15℃
h
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也可以连接两条平起末端的DNA分子，但反 应速度较慢。
5’…CGAOH
DNA聚合酶在DNA复制时起关键作用。
DNA聚合酶主要有三类：聚合酶Ⅰ(polⅠ)、 聚合酶Ⅱ(polⅡ) ，聚合酶Ⅲ(polⅢ)。其 中聚合酶Ⅰ参与DNA修复，聚合酶Ⅲ参与DNA 复制。聚合酶Ⅰ是基因工程中的常用酶。
h
32
DNA聚合酶Ⅰ在DNh A复制过程中的作用 33
DNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ的比较
h
7
2.1.1.2 R-M系统
细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构 成了寄主控制的限制—修饰系统(R-M Restrictionmodification system)。
R-M系统是细菌安内御外的积极措施。细菌R-M系统的 限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细菌可 以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA则 会被降解。
2 基因工程常用工具酶
h
1
基因工程的重要特点之一是在体外实行DNA分子的切 割和重新连接。因此，工具酶是DNA体外操作必不可 少的工具。
取得编码某种药物的目的基因，大多需要工具酶－限 制性核酸内切酶
将目的基因与载体DNA连接在一起，也需要工具酶－ DNA连接酶。
目前，许多厂商都在生产各种优质工具酶，简化了分
感染
E.coli k
Phageλ（k）
B 限制 λ（不k感）染』
《基因工程的工具——酶与载体》 知识清单
《基因工程的工具——酶与载体》知识清单一、基因工程简介基因工程，又称为重组 DNA 技术，是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外 DNA 重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
它是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，而实现这一技术的关键就在于一系列特殊的工具，其中酶和载体起着至关重要的作用。
二、基因工程中的酶1、限制性核酸内切酶（限制酶）限制酶是能够识别双链 DNA 分子的某种特定核苷酸序列，并使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开的酶。
限制酶具有特异性，即一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割 DNA 分子。
例如，EcoRⅠ限制酶只能识别GAATTC 序列，并在 G 和 A 之间切断磷酸二酯键。
限制酶切割DNA 分子产生的末端有两种类型：黏性末端和平末端。
黏性末端是指被限制酶切开的 DNA 双链的切口，带有几个伸出的核苷酸，它们之间正好互补配对；平末端则是指切口平整，不带有伸出的核苷酸。
2、 DNA 连接酶DNA 连接酶的作用是将两个具有相同末端（如黏性末端或平末端）的 DNA 片段连接起来，形成一个完整的 DNA 分子。
DNA 连接酶与限制酶的作用相反，它通过催化磷酸二酯键的形成，将断开的 DNA 片段重新连接起来。
3、 DNA 聚合酶在基因工程中，DNA 聚合酶常用于 DNA 片段的扩增，如 PCR 技术（聚合酶链式反应）。
PCR 技术中使用的热稳定 DNA 聚合酶（Taq 酶）能够在高温环境下保持活性，不断地将脱氧核苷酸加到引物的 3'端，使 DNA 链得以延伸。
4、反转录酶反转录酶能够以 RNA 为模板合成互补的 DNA 链，即 cDNA。
这在获取目的基因时非常有用，例如从真核生物细胞中提取出mRNA，然后通过反转录酶合成 cDNA，再进行后续的基因操作。
三、基因工程中的载体1、载体的作用载体在基因工程中主要起到运输目的基因的作用，它能够将目的基因导入到受体细胞中，并使其在受体细胞中稳定存在和表达。
基因克隆的四大要素
基因克隆的四大要素(Four Elements for Gene Cloning)将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，使该基因能在受体细胞内复制、转录、翻译和表达，整个操作称为基因重组技术。
要实施该技术必须具备四大要素：工具酶、载体、基因和受体（宿主）细胞。
一、工具酶：基因工程的基本技术是人工进行基因的剪切、拼接、组合。
基因是一段具有一定功能的DNA分子，要把不同基因的DNA 线形分子片段准确地切出来，需要各种限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）；要把不同片段连接起来，需要DNA 连接酶（DNA ligase）；要合成基因或其中的一个片段，需要DNA 聚合酶（DNA polymerase）等。
因此，酶是DNA 重组技术中必不可少的工具，基因工程中所用的酶统称为工具酶。
工具酶就其用途而言可分为三大类：限制性内切酶、连接酶和修饰酶，其中限制性内切酶为一大类酶（达上千种）。
基因重组正是利用了这些工具酶对DNA 分子进行一系列的酶催化反应，才得以在体外实现DNA 分子的切割和连接。
因此，工具酶的发现为基因操作提供了十分重要的技术基础。
首先重点介绍限制性内切酶（restriction endonucleases＝restriction enzyme），其他酶在相关内容中再一一介绍。
从分子生物学发展历史看，核酸限制性内切酶的发现和应用对该学科发展所起的作用是难以估量的。
首先使外源基因在大肠杆菌中克隆的实验是在1973 年完成的，Stanley Cohen，Herbert Boyer（见补充资料2.1）正是利用了限制性内切酶这一分子手术刀才得以实现。
核酸限制性内切酶是原核生物中的一类能识别双链DNA 中特定碱基顺序的核酸水解酶。
原核生物的限制和修饰系统犹如高等动物的免疫系统，依靠一对识别相同序列的核酸限制性内切酶和甲基化酶活性来对抗外来DNA 的入侵：当自身的基因组在复制完成下轮DNA 复制尚未开始前就被甲基化酶修饰(使某特定序列甲基化), 避免了被对应的限制性内切酶的识别和水解，而入侵的噬菌体由于未来得及修饰而被破坏，从而保护细菌不受噬菌体的感染。
基因工程的主要工具酶及其功能
基因工程的主要工具酶及其功能基因工程，听起来有点高大上是不是？不过，别紧张，其实它就是通过一些技术手段去“修修补补”我们基因里的东西，改改它们的“工作方式”。
你想想，就像是给手机换个更强大的处理器，或者把家里的WiFi升级成超速光纤，基因工程就是想通过这种方法让某些生物更强大、效率更高。
你可能会想，基因工程到底怎么做到的？答案就是：它有一堆超级厉害的工具，而这些工具的幕后英雄，正是酶。
对，就是那些在生物体内帮忙做各种“化学工作”的小能手。
酶是啥？简而言之，酶就是大自然的“万能钥匙”，它们能帮助我们剪、粘、拼接、修复、拆解基因链。
没有它们，基因工程可能就成了空谈。
所以，酶就是基因工程的“主力军”，它们有着不可或缺的地位。
就像我们上学时，如果没有老师的引导，知识就没法传授到我们手里；如果没有酶的帮助，基因操作也是无从下手。
首先要聊聊的是“限制性内切酶”，这是基因工程中最常见的一种酶，简直可以说是基因“剪刀”。
它的功能很简单却非常强大——它能在特定的DNA序列上找到并切割掉不需要的部分，哎呀，这就像你在看视频时用剪辑软件裁掉那些你觉得无聊的部分，留下一段精简有趣的内容。
限制性内切酶其实是自然界中细菌用来对抗病毒入侵的一种防御武器，它通过切割外来病毒的DNA来保护自己。
科学家们聪明地发现，利用这些“剪刀”可以方便地切割我们想要的DNA片段，从而为基因工程的“拼图”提供了素材。
要聊的是“连接酶”。
你可以把连接酶想成是基因工程中的“胶水”。
有了限制性内切酶剪出DNA片段之后，这些片段就需要拼接起来，才能形成新的基因。
连接酶就是做这件事的“能手”。
它能够把切开的DNA片段连接在一起，把它们重新合并成一个完整的基因，就像你把几块乐高积木拼成一个完整的房子。
没有连接酶，基因工程的“拼图”就无法完成，那些小小的DNA片段就只能任其散落一地，完全无法发挥作用。
可能有些人开始好奇，这些酶真的有那么神奇吗？当然啦！接下来我们要说的“聚合酶”，它是基因工程中的“扩音器”。
基因工程中常用的酶
分类与用途
分类
根据识别序列的长度和切割位点的特性，限制性内切核酸酶 可分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型限制性内切核酸酶识别位点较长， 切割位点不规则；Ⅱ型限制性内切核酸酶识别位点较短，切 割位点规则。
用途
限制性内切核酸酶在基因工程中主要用于DNA的克隆、基因 的定位、突变分析等方面。通过限制性内切核酸酶的切割， 可以将DNA片段分离出来，再进行后续的克隆和转化等操作 。
生物制药
在生物制药中，使用DNA 连接酶将药物基因或疫苗 基因插入到载体中，制备 基因药物或基因疫苗。
03
聚合酶
定义与特性
聚合酶
是一种能够催化DNA复制和修复的酶， 通过聚合核苷酸片段，合成新的DNA 链。
特性
聚合酶具有专一性、高效性和耐受性 等特性，能够在特定的模板指导下， 高效地合成DNA链。
分类与用途
分类
根据来源不同，反转录酶可分为天然反转录酶和重组反转录酶。
用途
在基因工程中，反转录酶主要用于将RNA转录为cDNA，以便进行基因克隆、表达和功能研究。
反转录酶的应用案例
基因克隆
通过反转录酶将mRNA转化为 cDNA，再利用限制性内切酶将其 切割成适当大小的片段，进行基 因克隆和测序。
基因工程中常用的酶
• 限制性内切核酸酶 • DNA连接酶 • 聚合酶 • 反转录酶 • 其他常用酶类
01
限制性内切核酸酶
定义与特性
定义
限制性内切核酸酶是一类能够识 别并切割DNA特定序列的酶，是 基因工程中常用的工具酶之一。
特性
限制性内切核酸酶具有高度的特 异性，能够识别并切割DNA中的 特异序列，切割位点通常是DNA 双链中的特定位点。
限制性内切核酸酶的应用案例
《基因工程的工具——酶与载体》 知识清单
《基因工程的工具——酶与载体》知识清单一、基因工程简介基因工程，又称基因拼接技术或 DNA 重组技术，是指按照人们的意愿，将一种生物的基因在体外进行改造和重新组合，然后导入另一种生物的细胞内，使其能够表达并产生新的性状或产物的技术。
这项技术的出现，为人类解决许多问题提供了新的途径和方法。
二、酶在基因工程中的作用1、限制性核酸内切酶（简称限制酶）限制酶是基因工程中最重要的工具酶之一。
它能够识别特定的核苷酸序列，并在特定的位点切割 DNA 分子。
例如，EcoRⅠ限制酶能够识别 GAATTC 序列，并在 G 和 A 之间切断磷酸二酯键。
限制酶的作用就像是一把“分子剪刀”，能够将 DNA 剪成不同的片段，为后续的基因重组提供材料。
不同的限制酶识别的核苷酸序列不同，切割位点也不同。
这使得我们可以根据需要选择合适的限制酶来切割 DNA。
2、 DNA 连接酶在基因工程中，将切割后的 DNA 片段连接起来需要用到 DNA 连接酶。
DNA 连接酶能够将两个具有相同黏性末端或平末端的 DNA 片段连接在一起，形成一个完整的 DNA 分子。
DNA 连接酶的作用就像是“胶水”，将断开的 DNA 链条重新连接起来，保证基因的完整性和稳定性。
3、反转录酶反转录酶在基因工程中也有着重要的作用。
它能够以 RNA 为模板合成 DNA，这一过程被称为反转录。
例如，在获取目的基因时，如果我们只有相应的 mRNA，就可以利用反转录酶合成与之互补的 DNA 链，即 cDNA。
4、聚合酶聚合酶在基因工程中的应用也非常广泛。
例如，在 PCR 技术（聚合酶链式反应）中，DNA 聚合酶能够在体外快速大量地扩增特定的DNA 片段。
三、载体在基因工程中的作用载体是基因工程中用于携带目的基因进入受体细胞的工具。
常用的载体有质粒、噬菌体和动植物病毒等。
1、质粒质粒是一种存在于细菌等微生物细胞中的小型环状 DNA 分子。
它具有自主复制能力，能够在细胞内独立地进行复制和遗传。
基因工程
Genetic Engineering
山西医科大学生化与 分子生物学教研室
常冰梅
本章主要内容 相关概念 DNA克隆 克隆 工具酶 目的基因 基因载体 基本原理 重组DNA技术与医学的关系 技术与医学的关系 重组
基因克隆示意图
载载DNA (限细外细外反外限) 限ຫໍສະໝຸດ ＋目目目目＋
宿宿细细
重重 载
已 反 杂 目 宿宿 细 细
繁繁 阳 外 阳 阳阳
表表
常用的工具酶： 常用的工具酶：
限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ 反转录酶 多聚核苷酸激酶 末端转移酶 碱性磷酸酶 切割DNA 生成3′- 5′磷酸二酯键 探针标记、补平3′末端 cDNA合成 5′磷酸化、探针标记 3′末端多聚尾 切除末端磷酸基
整聚 细细细细细
重组DNA医药产品 医药产品 重组
产 品 组织胞浆素原激活剂 血液因子VIII 血液因子 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 颗粒细胞 巨噬细胞集落剌激因子 促红细胞生成素 生长因子(bFGF, EGF) 生长因子 生长素 胰岛素 干扰素(α 干扰素 α 1b, α2a, α 2b, γ) 白细胞介素 超氧化物歧化酶 单克隆抗体 乙肝疫苗(CHO, 酵母 酵母) 乙肝疫苗 口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗 口服重组 亚单位菌体霍乱菌苗 抗凝 促进凝血 剌激白细胞生成 剌激白细胞生成 刺激细胞生长与分化 治疗侏儒症 治疗糖尿病 抗病毒感染及某些肿瘤 激活、 激活、剌激各类白细胞 抗组织损伤 利用其结合特异性进行诊断试验、 利用其结合特异性进行诊断试验、肿 瘤导向治疗 预防乙肝 预防霍乱 功 能
核酸外切酶活性 3′→5′外切酶活性 5′→3′外切酶活性
3′→5′外外反外外 外 5′ 3 ′
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天然DNA的来源
染色体DNA、病毒和噬菌体DNA、质粒 DNA、线粒体和叶绿体DNA
天然DNA的提取
准备生物材料 裂解细胞 分离和抽提DNA
2020/4/4
苏州科技学院生物系
叶亚新
第三节 限制性核酸内切酶和DNA片断化
限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
EcoRI—Escherichia coli RI HindⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ SacI (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)
2020/4/4
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叶亚新
四．限制酶的特点
1. 识别顺序和酶切位点 １）识别４-8个相连的核苷酸
influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。
3. SV40 限制图谱和转录图谱的绘制
D. Nathans（1971年）用HindII绘制SV40的限制酶谱。
2020/4/4
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叶亚新
二、限制修饰系统的种类
1. I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（host
specificity for DNA restriction modification and specificity） 位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、 SAM（５—腺苷甲硫氨酸）。
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四．限制酶的特点
３）对称性—双对称
EcoRI 5’-G A A T T C-3’
3’-C T T A A G-5’
４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外
５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ
2. 末端种类
１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸
EcoR 1 GAATTC----AATT
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6、限制性内切酶的星号活性
引起星号活性的可能因素
甘油浓度过高 离子强度不合适 阳离子的变化 溶液中PH值的变化
在基因工程操作中，应避免星号反应的出 现
2020/4/4
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二、限制酶的使用方法
叶亚新
三. 限制性内切酶的定义、命名
1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II型限制 酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即细菌种属名、菌系编号、 分离顺序。
例如：HindⅢ 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离
到的第三个限制酶。
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影响限制酶消化DNA的若干因素
DNA的纯度的影响
限制酶作用于纯度不高的DNA时，会进行 不完全酶解（部分酶切）
RNA或其他DNA的污染影响小 蛋白质污染并与DNA结合后，可能降低或终止
酶切反应
解决办法：用酚和氯仿抽提除去蛋白质
是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列．并使每条链的一个磷酸二
酯键断开的内脱氧核糖核酸酶 一 . 限制性内切酶的发现
1. 细菌限制修饰系统的发现 Werner Arber于1962-1968年发现，1968年分离到I型限制酶。
2. 限制酶HindII的发现 H．O．Smith 和Wilox 于1970年首次从流感嗜血杆菌（H.
ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaI
AvaI 5’-CPyCGPuG-3’
CCCGGG; C TCGGG; CCCGAG; CTCGAG
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叶亚新
五. 异源同序酶（isoschizomer， 同裂酶）
1. 定义：能识别相同序列但来源不同的两 种或多种限制 酶 2. 特点：1）识别相同顺序
叶亚新
四．限制酶的特点
３） 平齐末端
SmaI 5’-CCCGGG-3’
5’-CCC GGG-3’
3’-GGGCCC-5’
3’-GGG CCC-5’
４）非互补的粘性末端
ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokI
Fok I 5’-GGATG(Ｎ)9-3’ 5’-GGATG(N)9
3’-CCTAC(Ｎ)13-5’ 3’-CCTAC(N)13
2. II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ. coli中这两种基
因位于质粒上。
3. III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成一
亚单位，限制酶是独立存在的。 上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸
识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。
2020/4/4
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MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC Bam HI GGATCC；PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC
CCGG N’ N’N’N’N’ CCGG
Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’
3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突起 ２）富含ＧＣ
用限制酶消化DNA（酶切）是基因工程 最基本的实验技术
最常用的消化条件： 反应体积：20ul 10xBuffer：2ul DNA浓度：0.5—1.0ul
2020/4/4
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二、限制酶的使用方法
1、影响限制酶消化DNA的若干因素
DNA的纯度的影响 DNA浓度的影响 酶浓度的影响 酶反应条件的影响 双酶消化
Pst I 5’-CTGCAG-3’
5’-CTGCA
G-3’
3’-GACGTC-5’
3’-G
ACGTC-5’
２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸
EcoRI 5’-GAATTC-3’
5’-GOH
PAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’
3’-CTTAAP
HOG-5’
2020/4/4
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2）切割位点的异同
KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstI CCGC GG SacI CCGC GG
2020/4/4制性内切酶的星号活性
在某些反应条件下，限制酶识别顺序的 特异性可能发生变化，结果一种限制酶 酶切同一种DNA片断会产生新的酶切位 点，得到不同的酶切片断，这就是限制 酶的星号活性（star activity）