流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)

流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)

一、开机程序：

1.检查鞘液桶和废液桶。确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位

置，可以连续工作3个小时左右）、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足

够空间容纳本批标本排弃的废液。如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中

气压。

2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印

机。

3.气压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以

排除管路中气泡。

二、运行FACSComp软件、检查仪器状况

1.制备三色标准微球样本。一般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加入

1滴质控小微球，也可以根据实际情况调节浓度。

2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。选择所需校

正内容，如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。

3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过

程中是否需要清洗样品。

4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。功能键设置在“RUN”。

5.仪器自动检查，并做电压、补偿等设置。

6.FACSComp软件运行完毕，显示结果通过测试。

7.做Set up。

8.打印校正结果，退出FACSComp程序。

备注：在质控过程中，如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，一定要用“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。在使用仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。

三、样品分析软件：CellQuest Pro

1.软件，选择“联机”。

Acq Connect

（1）在弹出的界面中的选择数据存储路径（Directory 菜单）；

（2） 对实验样本进行命名；

（3） 对实验通道进行预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。

备注：如果界面被关闭，重新调出步骤：

2.

调出质控模板。

3. 画图 选择画图工具（一般选择散点图），Inspect 界面会自动弹出，对几够选中图形），将 改为 ,更改横纵

备注：第一个散点图横坐标为FSC ，纵坐标为SSC 。

（1） 一般获取10000

个细胞。 （2）调出电压、阈值和补偿等界面。

（3）将所有补偿调为0。 （4）将非52的阈值调为0。 （5）FSC 和SSC 一般用线性（Lin ）,激光通道（FL1-FL4）一般用对数（Log ）。

（6）调出细胞计数器：

4. 上阴性对照

将阴性对照管混匀，上机，功能键设置在“RUN ”,散点图出现细胞

信号，第一个图：让细胞信号出现在自己看上去舒服的区域；其他

三个散点图，要将细胞信号调整到阴性区域，即左下角区域。通过Wind Show Cyto Instrume Op BD 图BD Instrume 选择调用

Op Set （一Do

Anal Acquire>

Acq Acquisi

从工具栏Cytometer Compl Thre Acq Cou

移动通道电压来实现。

获取实验数据：暂停刚才实验 注意：

5. RUN ”,如果细胞信号出现在双阳区域，说明有细胞信号露到相邻通道中，要将细胞信号调节到单一通道中。

通过移动通道补偿来实现，想要细胞信号向哪个通道移动，就用散

点图中的另一个通道去减，即想要移动的那个通道作为减数。如在

FL1和FL2两个通道组成的散点图中，细胞信号出现在双阳区域，要

将细胞信号移动到FL1通道，就要调节FL2-FL1对应的补偿，直到

细胞信号只出现在FL1通道中，这样可以消除漏到FL2通道中的信

号。

备注：FL1-FITC ，FL2-PE ，FL3-PerCP ，FL4-APC 。

根据实验要求选择流速，按设置顺序上样。

6. 点击“Acquire ”命令，仪器开始获取数据，并自动将数据文件保存

到规定的目录下。

7.

样本获取完毕，功能键设置在“STANDBY ”，并选择“脱机”命令。 8.

点击“Quit ”命令，退出CellQuest 软件。 9. 关机：（1）1% 次氯酸，高速（Hi ）“RUN ” 5-10 min ，Acquire 如

果细胞计算器中不显示有细胞则表示管道已经干净。

（2）用双蒸水高速（Hi ）“RUN ” 5-10 min ，Standby 5 min ，关

机。

四、DNA 倍性分析实验：

一、仪器情况检测，DNA 倍性分析的质控用CellQuest Pro 软件进行。

1.Pro 软件，选择“联机”。

做质控时，需要画三个图，第一个是散

Pau Ab Acq

Acq Connect

Four

点图，横坐标是FSC，纵坐标是SSC；第二个是散点图，横坐标是FL2-Width，纵坐标是FL2-Area；第三个是直方图，横坐标是FL2-Area，纵坐标是Counter。做DNA倍性实验时一般使用PI染色，所以选择用第二通道（FL2）。DNA倍性分析不需要调节补偿。因为属于单色实验，所以把电压界面前的勾去掉。将信号接收方式“Log”改为“Lin”，DDM Pram 改为“FL2”。阈值使用FL2，而不是FSC。

去掉细胞群中粘连体，上样本，利用第二个图，调节FL2-A和FL2-W电压，使细胞群信号显示在横纵坐标200位置，通常血细胞中单细胞成45℃，粘连体体积会比单细胞大，大概在横坐标400位置。保存质控。

二、DNA倍性分析用ModFit LT软件进行。

（1）打开ModFit LT软件，调出样品检测结果，

（2）选择面积（FL2-A），选定X轴：FL2-W，Y轴：FL2-A。

（3）可以点击Auto选项，进行结果自动分析，也可以选择Manuale，人工分析。