双歧杆菌的培养

双歧杆菌的培养和分离
双歧杆菌是专性厌氧菌，对氧气非常敏感，因此，双歧杆菌的分离、培养及活菌计数的关键是提供无氧和低氧化还原电势的培养环境。

双歧杆菌的最适生长温度37℃~41℃，最低生长温度25℃~28℃，最高43℃~45℃。

初始最适pH 6.5~7.0，在pH4.5~5.0或pH 8.0~8.5不生长。

其细胞呈现多样形态，有短杆较规则形、纤细杆状具有尖细末端形、球形、长杆弯曲形、分枝或分叉形、棍棒状或匙形。

单个或链状、V形、栅栏状排列，或聚集成星状。

革兰氏阳性，不抗酸，不形成芽孢，不运动。

双歧杆菌的菌落光滑、凸圆、边缘完整、乳脂至白色、闪光并具有柔软的质地。

双歧杆菌是人体内的正常生理性细菌，定殖于肠道内，是肠道的优势菌群，占婴儿消化道菌丛的92%。

该菌与人体终生相伴，其数量的多少与人体健康密切相关，是目前公认的一类对机体健康有促进作用的代表性有益菌。

该菌可以在肠粘膜表面形成一个生理性屏障，从而抵御伤寒沙门氏菌、致泻性大肠杆菌，痢疾致贺氏菌等病原菌的侵袭，保持机体肠道内正常的微生态平衡；能激活巨噬细胞的活性，增强机体细胞的免疫力；能合成B族维生素、烟酸和叶酸等多种维生素；能控制内毒素血症和防治便秘，预防贫血和佝偻病；可降低亚硝胺等致癌物前体的形成，有防癌和抗癌作用；能拮抗自由基、羟自由基及脂质过氧化，具有抗衰老功能。

双歧杆菌的培养方法很多，如厌氧箱法、厌氧袋法、厌氧罐法。

本实验介绍的是一种简便的试管培养法——亨盖特厌氧滚管技术该技术的优点是：预还原培养基制好后，可随时取用进行试验；任何时间观察或检查试管内的菌都不会干扰厌氧条件。

近年来兴起的一种新的RAPD等分子生物学技术对双歧杆菌进行基因指纹图谱的构建，分析不同双歧杆菌种间存在的同源性和多态性；RAPD技术也可用于双歧杆菌菌种鉴定及分型。

一般来讲，我们都应用适合鉴定所有厌氧菌的方法，主要包括双歧杆菌特定酶的检测、乙酸、乳酸等有机酸的测定、糖发酵试验和其他相关指标等。

一、实验方法
1、铜柱系统除氧
2、预还原培养基及稀释液的制备
制作预还原培养基及稀释液时，先将配置好的培养基和稀释液煮沸驱氧，而后用半定量加样器趁热分装到螺口厌氧试管中，一般琼脂培养基装4.5～5.0mL，稀释液装9mL，并插入通N2气的长针头以排除O2。

此时可以清楚的看到培养基内加入的氧化还原指示剂—刃天青由蓝到红最后变成无色，说明试管内已成为无氧状态，然后盖上螺口的丁烯胶塞及螺盖，灭菌备用。

3、分离
（1）编号
取五支无菌水试管，分别用记号笔标明10-1、10-2……10-5。

（2）稀释
在无菌条件下，用无菌注射器吸取1mL混合均匀的液体样品，加入装有预还原生理盐水的厌氧试管中，用震荡器将其混合均匀，制成10-1稀释液。

用无菌注
射器吸取1mL10-1稀释液至另一装有9mL生理盐水的厌氧试管中，制成10-2稀释液。

依此进行10倍系列稀释，至10-7，制成不同样品稀释液。

通常选10-5、10-6、10-7三个稀释度进行滚管计数。

（3）滚管分离
1）滚管
将无氧无菌的琼脂培养基在沸水浴中溶化，置46-50℃恒温的水浴中，待用，用无菌注射器吸取10-4、10-5、10-6三个稀释度各0 .1mL，分别注入待用的试管中，然后将其平放于盛有冰水的瓷盘中迅速滚动，带菌的溶化琼脂在试管内壁会即刻形成凝固层。

2）分离
生成的菌落需挑取出来，镜检其形态及纯度。

如尚未获得纯培养物，需再次稀释滚管，并再次挑取菌落，直至获得纯培养物为止。

待挑取的单菌落预先在放大镜下观察确定，做好标记。

然后将培养基试管固定于适当的支架上，打开试管胶塞，同时迅速将气流适当、火焰灭过菌的氮气长针头插入管内。

同时，另一液体厌氧管去掉胶塞插入另一灭过菌的通气针头。

将准备好的弯头毛细管小心插入固体培养基内，找准待挑菌落，轻轻吸取，转移至液体试管内，加塞。

37℃培养。

培养24h或待培养液混浊后检查已分离培养物的纯度。