流式细胞术

1．乙醇固定 常用75%乙醇。用无钙镁的 PBS 配 制 ， 4 ℃ 冰 箱 中 保 存 。 将 洗 过 的 细 胞 用 0.5ml PBS 悬浮起来，用加样器或吸管把细胞悬 液喷射入5ml 75%冷乙醇中。将容器口密封，4℃ 冰箱贮存，时间不少30min。 2．免疫染色后的固定 对细胞表面抗原进行 免疫标记染色后，如果不能立即进行 FCM 分析， 可用下列方法固定保存： （ 1 ）在细胞免疫标记染色完成细胞洗涤后， 加入3%的甲醛，细胞摇匀后4℃冰箱保存。24h之 内分析，其荧光强度不变。 （ 2 ）用 0.5%的多聚甲醛摇匀固定， 4 ℃冰箱 保存，一周内荧光强度基本不变。
3．双间二氮茚（Hoechst）类染色法 Hoechst33258 及 Hoechst33342 均为 此类染料，特异性与核酸的 A-T 键结合， 但在 pH2.0 的环境条件下优先与 RNA 结合。 测定DNA的染液配制，需先以蒸馏水溶解 后再以PBS稀释成1mmo1/L的浓度，原液 可在冰箱中避光保存，这种染液对乙醇固 定的细胞或死细胞可立即着色，对活细胞 需经20min左右才能达到饱和性着色。
（2）细胞固定：每个试管10 6 细胞，离心， 在试管底部使细胞沉淀形成小球状，并去掉上 清，再将沉淀细胞分散悬浮起来。加入80%的 乙醇（4℃）2ml，一滴一滴的加入并摇动与细 胞混匀，在冰浴中保温30min。 （3）染色：离心10min去掉固定液，并再 悬浮细胞，加入 1.5ml 染液，室温下染 30min， 上机分析。 注意：使用激发波长457nm，发射波长约 大于515nm，使用515 Long Pass滤片。该方 法优点是不需RNA酶处理。
第二节
常用荧光染科
在流式细胞术中使用的荧光染料可分两大类： 一类是染料生物大分子基团，如免疫球蛋白，再 与细胞发生免疫反应，使染料分子间接地连接到 细胞上（表17-1）；另一类是直接与细胞内特异 成分相结合的染料，它们之间有非常好的线性关 系（表17-2）。在实验过程中，应根据仪器的实 际情况，例如激发光源的种类、滤光片的配置以 及本实验室所具有的条件，来选择适合于自己使 用的荧光染料。
（ 1 ） 6 µg/ml 的 Hoechst33342 直接加到培 养的细胞中。在37℃保温2h。 （2）收获细胞并计数细胞的总数。400g离 心5min，去上清。 （3）调整细胞浓度为2×106/ml，上机分析 细胞。 该方法的优点是可以做活细胞的 DNA 分析， 缺点是需经紫外345nm光激发。 注意： Hoechst 33342 的浓度与细胞类型 很有关系，不同类型的细胞其浓度可在 1~6 µg /ml之间调整。
二、DNA与RNA同时染色法 丫啶橙（acridine orange，AO）可与双链和 单链的核酸结合。与双链核酸结合方式是嵌入到 双链之间，发射绿色荧光峰值为530nm。与单链 的核酸凝聚变为复合物，这种复合物发射红色荧 光，最大波长为640nm。 为了分别染 DNA 和 RNA，首先将 RNA 的双链 变性为单链，而 DNA仍保持原双链结构。因此染 色前，细胞经螯合剂 EDTA 处理。螯合剂能够破 坏RNA与核蛋白之间的互相作用，使mRNA的稳 定性丢失，双链全部变为单链。
多数流式细胞仪可以同时收集两种以上不 同波长的荧光信号，检测细胞膜表面或细胞内 荧光分子的数量。散射光检测器则接受细胞散 射偏转后的激光束信号，此信号可反映细胞的 物理化学特性、大小、数量和类型。 前向角散射强度信号与细胞的大小有关。 散射光强度信号则反映细胞内部结构，即流式 细胞仪可以同时收集两个方向散射光的信号。 两种光检测器所产生的信号，经过电子系统的 处理，产生脉冲，并使测量过的细胞在形成微 滴时，带上不同的电荷（充电）。
三、血细胞制备方法 （一）全血溶解技术 通过选择性的溶解红细胞，获得外周血中单个 核细胞和多形核细胞。 1．试剂 氯化铵溶解缓冲液pH7.3。细胞洗涤 缓冲液：不含钙镁的Hanks平衡盐液或1×PBS缓 冲液。 2．方法 （ 1 ）取 0.5~1ml 用肝素或 EDTA 抗疑的外周血， 加入15ml离心管内，加20倍于血体积的氯化铵溶 液混匀，室温下溶解8~l0min（红细胞完全溶解应 为透明红色）。
（2）180g离心5min，小心吸出上清，然后
把沉淀的白细胞用细胞洗涤缓冲液洗两次， 80g离心5min。吸出上清，再把细胞悬浮在冷 的缓冲介质中备用。 （二）梯度-密度离心分离法 该方法可离出单个核细胞（淋巴细胞和单 核细胞）。 1．材料 淋巴细胞分离液；PBS缓冲液。 2．方法 （ 1）所用试剂预热到 25 ℃以获得正确的密 度。
当充电微滴通过带有恒定静电压的偏转板时， 带正电荷的细胞微滴在静电场作用下落入左方的细 胞收集器，而带负电荷的细胞微滴落入右方的细胞 收集器，不带电荷的细胞微滴落入中央的容器中， 从而实现细胞分选的目的。这种分类技术能以每秒 高达5000~10000个细胞的速度分类细胞，纯度在 90%~99%之间，细胞活性在通过仪器过程中不受 影响。流式细胞仪仅对悬浮细胞进行分析和测量， 并进行统计学分析，但无法得到细胞的形态学以及 多种动力学功能参数，尤其不能满足细胞的解剖定 位研究。
（2）取5ml外周血用肝素或EDTA抗凝，并加 等体积的PBS稀释混匀。加2ml淋巴细胞分离液 到圆锥形离心管的底部，用吸管取5ml用PBS稀 释的抗凝血小心地放到淋巴细胞分离液液面上， 注意不要使之混合。 （ 3）室温下 400g离心20min，使离心管自行 缓慢停下，不要用力强迫离心停车。丢弃血浆， 用细尖长吸管吸出含有单个核细胞的淡黄色层， 置另一个离心管内。 （4）加10ml PBS 600g离心10min，洗两次。 把细胞在悬浮在2ml的PBS中备用。
第三节
单细胞悬液的制备
流式细胞术所得结果好坏首先取决于 细胞样品处理制备方法的优劣。所以， 要保证细胞在制备过程中和储存期间细 胞表面和细胞内部的成分不被破坏和去 失，特别是要分析的那些成分。
一、单层细胞培养 使用标准培养技术，单层生长的细胞 容易分离。包括使用胰蛋白酶（trypsin）。 单层细胞用 PBS或 Hanks平衡液加 0.25% Trypsin 洗，当细胞变圆时（在倒置显微 镜下观察），倒出 Trypsin 液体后用手拍 打振动培养瓶使细胞脱落，然后加入缓冲 液摇动培养瓶并用细管取出含有细胞的上 清液。再用缓冲液离心洗涤细胞即可。要 注意的是酶消化时间不能过长，以免破坏 细胞（参见细胞培养）。
二、流式细胞仪的工作原理 流式细胞仪要求被检细胞用荧光染料染 色，呈悬浮状态。经染色的细胞通过样品进 入管被压进超声波振荡器喷嘴的中央部，同 时将无细胞的液体经过另一进入管压入喷嘴， 使之形成包围细胞悬液的鞘液（图17-1）。 在鞘液和细胞悬液存在一定压力差的情况下， 中央的细胞悬液和周围鞘液的分层液流快速 通过50µ m的喷嘴圆孔，被喷射出来。当同轴 流动的细胞悬液和鞘液通过激光器发出的氩 离子激光束照射小区时，单行流动的细胞发 射出荧光，荧光检测器接受聚焦后的荧光信 号。
第一节
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基本原理
一、流式细胞仪的主要组件 1．液流系统 包括各种管道、压力调 节开关、液体流动室和超声振荡器喷嘴。 单个细胞悬液在狭窄的管道中流动，由于 细胞受流体力学的作用，极易形成贴边、 堆积,从而造成阻塞。为克服此种现象，利 用流体聚焦的原理，在不同的压力作用下 使鞘液（通常用 PBS）和细胞悬液在喷嘴 内形成层流液束，通过细胞测量区。
（2）染液配制：5mg PI溶于100ml PBS中， 装在棕色瓶中，4℃冰箱保存。 （3）细胞染色：取乙醇固定的 1×106~2×106/ml细胞，经离心去除固定液， 再经无钙镁的PBS洗一次。 （4）RNA酶消化：每106细胞/ml加入500 活性单位RNA酶，37℃保温30min。洗去 RNA酶，再经PBS洗一次，去上清。 （ 5 ）细胞染色： 10 6 细胞加 PI 染液 5 µg/ml， 避光染色至少20min。 （6）流式细胞术分析。
第十七章
流式细胞术
流式细胞术（flow cytometry，FCM）是对细 胞或细胞颗粒进行定量分析和细胞分类研究的技术。 流式细胞仪（flow cytometer）又称为荧光激活细 胞分类器（fluorescent activated cell sorter， FACS），是流体喷射术、激光光学技术、电子计 算机技术和显微荧光光度术相结合的高科技产品。 应用流式细胞术可对单细胞逐个地进行高速准确的 定量分析和分类，每秒测定达数千到数万个细胞， 且有高度的重复性。这种高速信息的测量分析和高 纯度分类的新技术，为细胞生物学提供了一种强有 力的研究手段。
一、DNA染色方法 1．碘化丙啶（PI）染色法 主要用于不固定的细胞核或固定细胞核的 DNA 分析。其特点是可用 488nm 波长光激发， G0/G1峰的CV值较低。优点是操作简单，可得 到较低的 CV 值。缺点是需经 RNA 酶消化处理。 （1）RNA酶：用1.12%枸橼酸钠溶液稀释 成 5000U/ml，并在 75 ℃下热处理 30min，使 其中的DNA酶失活。然后等分成若干份并冷冻 贮存。
二、组织 从新鲜组织制备单个细胞悬液，有的 比较容易，例如淋巴结组织用注射器反复 抽吸几次即可得到足够量的细胞；有的就 比较困难，常要用机械分散和酶消化相结 合的方法处理，如肝、睾丸用酶消化处理 很容易得到单个细胞。但睾丸生殖细胞胞 质之间桥接引起相邻细胞溶解，形成人为 的称为合胞体的多核假象。很难与DNA含 量和体积上相似的单个细胞区分开。神经 细胞的处理参见细胞培养。
第四节
细胞的荧光标记
流式细胞术对细胞的分析一是分析 细胞产生的散射光信号；二是分析细胞 所产生的荧光信号。细胞的荧光是由一 些能够定量的荧光染料与细胞内的特有 成分结合，或经抗原抗体反应使荧光染 料与细胞间接结合，经激光照射产生的。 本节主要介绍荧光染料直接与细胞内部 特有成分结合定量分析的荧光标记方法， 如DNA、RNA、蛋白等。
2．光学系统 光学系统包括激发光源、各种 光学滤片和各种光信号探测器。激光光源通常是采 用激光器或汞灯等。激发光束激发细胞所携带的荧 光物质产生荧光，通过光电转换器和光电倍增管把 微弱的信号变成电的信号，光信号通过不同的滤片 把不同波长的光信号分开，把干扰光滤掉。 3．电子系统 电子系统包括各种放大器、模 数转换电路、高压电源和各种分析处理辅助系统， 还包括把不同细胞分离开来的逻辑控制系统。 4．计算机系统 把从细胞获取的数据记录储 存起来，利用各种不同的软件对数据进行分析加工 处理，把结果以图、表的形式输出。
2．应用抗生素染色法 常用的抗生素有普卡霉素（ mithramycin, MI）；色霉素（ chromomycin A3，CH）；橄 榄霉素（ olivomycin，OL），三者结构相似， 均为 DNA 螺旋结构高特异结合荧光染料，不与 RNA结合，三者都优先与G-C键结合，其中MI的 应用最广泛。 （ 1 ）染液： 25 µg/ml MI，25% ethanol， 20mmol/L MgC12。
四、石蜡标本制备单细胞悬液 （1）修块：切去多余的坏死组织和基质组织。 切5片50µ m厚蜡片标本放在一个10ml的试管里。 （2）脱蜡：加入5ml二甲苯，10min×3次。 （3）水化：100%乙醇5~10min×2次；95%乙 醇 5~l0min×2 次； 70%乙醇 5~10min×2 次； 50% 乙醇5~10min×2次；蒸流水洗5min×3次，丢弃蒸 流水。 （6）消化：加入5ml 0.5%胃蛋白酶消化液（生 理盐水配制）37℃保温30~50min，每隔10min振荡 一次。用镊子或玻璃棒取出未消化完的组织，并加 等量生理盐水终止酶的作用。经50µ m尼龙网过滤。
五、细胞固定 固定的目的是使细胞或组织硬化足以 承受包埋和切片的处理。固定也使得细胞 膜变得通透，使染料能够进入，获得最佳 染色效果、并通过抑制微生物作用和自溶 保护细胞样品。作为流式细胞术，细胞以 悬浮状态使用，常用的固定剂有乙醇、甲 醇、甲醛和戊二醛等。 DNA 定量分析细胞 多用乙醇固定，免疫表型分析常用甲醛和 多聚甲醛等固定以保护细胞膜表面的特异 标志物。