石蜡切片免疫组化操作步骤

石蜡切片免疫组织化学操作流程织获取（本实验室多做脑组织，所以以脑组织为例）一、组动物体重，常用麻醉药350mg/kg1.动物麻醉：所用麻醉药物（水合氯醛水溶剂）剂量为（麻醉浓度越大，动物进入麻醉时间越短，但麻醉致死率10%、6%、7%、物浓度为5%动物麻醉后，；若注射位置正确，约3min进入麻醉状态）相应较高，本人使用7%浓度，将其固定于灌流操作平台，仰卧位；动物灌流手术：以胸骨剑突为起点，沿左右两侧肋下缘剪开老鼠皮肤至腋下，再次以剑 2.突为起点，剪开皮下肌肉层，沿同样方向剪开肌肉至腋下，避免伤到内部脏器，剪破膈膜，沿左右两侧剪断胸骨，用止血钳夹住剑突向上翻转，充分暴露心脏；用弯镊分离心脏表面黏膜；左手持止血钳轻夹起心脏，倾斜一定角度，使心尖方向与升主动脉尽量位于同一直线上，右手持灌流针，沿直线所在所在角度由左心室进针，将灌流针直接插入升主动脉（可挑动灌流针于升主动脉内观察是否正确插入，此方法操作不熟练易插错血；固管或是直接刺穿心脏——或者直接将灌流针插入左心室，但前方法灌流效率较高）定器械（器械松动或是位置变化会严重影响灌流质量，有时会因为器械位置的变动直接将心脏牵扯下来导致灌流失败，应给与充分注意）左右，灌流开始，可见右心耳充盈，用剪刀剪开，便于血液动物灌流：C57小鼠25-30g3.（时50-100ml快速冲洗血液，持续最好不要超过5min流出：吊瓶灌流——以生理盐水多聚甲醛进行灌流，约间过长会导致脑组织降解），待无明显血迹流出后换用4%，固定液较充分的固定组织；注射器灌流——100-150ml，灌流速度不宜过快，约10min缓慢推注。

灌流成功的标志——灌多聚甲醛50ml50ml生理盐水快速推注，后换用4%流开始，可见肝脏颜色迅速变浅，随着灌流进行，肝脏颜色逐渐变为乳黄色或是白色；4%多甲固定液后小鼠全身痉挛抽搐，组织僵硬。

换用开颅取脑：根据实验取材位置的不同，分为不同的取脑方式：应注意需要的组织区域，4.避免取脑过程中损坏，多从小脑后方依次向前剥离颅骨，获取脑组织（在颅骨剥开后，应注意脑膜的存在，因为会发生脑膜将皮层割裂损伤的情况）5.脑组织修块：将多余脑组织去除，便于固定充分均匀，应留出试刀或找平的部分多余组织（本人实验中因需要海马组织，故修块时沿大脑皮层后边缘切除多余小脑，人字缝前约2.5-3mm切除前脑部分）6.固定过夜：将修块完成的脑组织，浸泡于4%多聚甲醛中，固定过夜，通常不要超过18小时（固定时间越长，组织抗原损失越严重，呈数量级损失），一般控制在12小时以内为宜二、组织石蜡包埋7.组织梯度脱水透明：将过夜固定的脑组织取出置于包埋窗内，并用铅笔做好相应标记，自来水流水冲洗约10min，去除残留的杂质成分，进行梯度酒精脱水（注意：不同的组织类型，同组织类型不同组织块大小所需的每阶段脱水时间不同，需根据自身需要进行简单摸索；若盲目脱水透明，脱水透明过头，会使组织脆性增加，切片时全为粉末状，无法成形；脱水透明不够，会使组织与蜡块分离，无法获取平整组织切片）本实验中，组织样本为脑组织，组织修块后所进行的脱水流程如下：自来水冲洗完成→50%乙醇 25min→70%乙醇 25min→80%乙醇 25min→90%乙醇 25min→95%乙醇I 10min→95%乙醇II 15min→无水乙醇I 10min→无水乙醇II 15min→二甲苯I 15min→二甲苯II 15min8.组织浸蜡：在进行二甲苯透明开始的时候，将石蜡用沸水融化，置于60度烘箱内备用（此过程中应注意将盛放石蜡的烧杯上口封闭，避免水分溅入；根据组织块的数目准备1 / 4；将透明完成的组织块，尽量沥干合适体积的石蜡液体，以组织块完全浸没其中为宜）号烧杯的石蜡液体内（避免包埋窗内产生气泡，气泡若围绕组多余二甲苯，迅速转入1，依次将所有组织块迅速转入其中，要求组织块要全部浸没在石织块会影响浸蜡过程）蜡中，流程如下：2h2h→3号石蜡→1号石蜡2h2号石蜡在每个阶段的浸蜡过程中，可根据时间安排适量的延长浸蜡时间，但尽量不要减少时间组织块包埋：包埋前，准备沸水备用；清理干净包埋槽备用；包埋开始时，将装有组织9.块的烧杯浸入沸水中，防止在包埋过程中，烧杯中的石蜡凝固，具体操作如下：用镊子夹取包埋槽在酒精灯预温，控制包埋槽的温度不要过高；1）将烧杯内的石蜡倒入包埋槽内，液面高度刚好没过包埋槽两侧平台2）取出浸泡的组织块，用小镊子过火后夹取组织块放置在包埋槽的凹陷处中心部位，3）根据切片要求摆放位置，注意在放置过程中避免组织块下面接触包埋槽底部的位置产生气泡，通常在放置前，可将组织块浸没在凹槽内的石蜡中翻滚，使其各面均匀接触石蜡液体，然后放置在正确的位置（此时假如包埋槽预温过高，则会导致组织块在接触槽底面后异常干燥，在整个蜡块凝固后会在干燥处出现凹洞，不利于石蜡块的长期保存）；将包埋窗轻轻放置在包埋槽的平台上面，尽量保证两侧高度相同，此时槽内之前的4）（避免倒入热的液体石蜡后，石蜡从包石蜡会浸没部分包埋窗的格栏，静置1-2min 埋窗的边缘流出）；静置后，石蜡表面会出现凝固表层，此时再用烧杯中的石蜡填充包埋窗的凹陷处以）5及靠近边缘的条状凹洞，液面稍高于包埋窗边缘（靠近边缘的条状凹洞一定注意填充石蜡，关乎整个蜡块凝固后与包埋窗结合的紧密程度；石蜡凝固后体积会缩小，避免因液面过低导致的后期包埋窗内部支撑不够），可将包埋后的蜡块从包埋槽内分离（注意分离时，应先清理包埋静置至少30min6）槽四周的多余石蜡，露出包埋窗与包埋槽接触的边缘，然后从一个角将蜡块撬离包埋槽）石蜡切片三、减准备工作：蜡块的修整——将组织周边的石蜡在保留操作位置的情况下尽量去除（1-10.石蜡切面与刀片少石蜡块切面与刀片的接触面积，便于受力均匀，易切出完整切片；2-接触接触面积小，会减少刀片接触到蜡块中坚硬杂质的几率，增加刀片的使用寿命；3-长度减少，可增加刀片使用次数，通常情况下至少多使用1次）准备器材：40度恒温水浴（温度控制在40-42之间的恒温状态，此温度可使蜡片较长时间保持切片形态，温度较低切片不易展开，温度较高，切片会在短时间内融化，易造成组织变形）切片刀片、包被载玻片、弯镊、毛刷、铅笔、切片盒冰盒（通常情况不需要，在组织脱水透明严重，切片呈粉末状态时，可用冰块冰敷石蜡切面，在短时间内可改善切片表面状态，能够帮助切出3-5片完整切片，只有在前期处理出问题时才使用进行一定程度挽救）切片大致流程：1）安装刀片；将蜡块固定于切片机上，调整蜡块表面与刀片距离，矫正蜡块表面与刀片切线平行；2）调整切片模式为trim-10um进行表面找平，并观察切片状态，调整蜡块角度，使切片左右对称，同时注意观察目标区域出现位置；3）切片调平，并出现合适目标区域，调整切片模式为sect-5um进行切片，获取所需组2 / 4 织切片样本；将完整合适的切片，夹取至水浴锅内摊平，左手持载玻片，右手持弯镊辅助，将切）4片贴于载玻片中，放置在水浴锅边缘进行干燥并做好相应标记；）将干燥完成切片，按照样本分类放置在一起收于切片盒中备用5切片完成，清理清片机；剩余组织蜡块，需要在切面表面均匀涂抹融化的石蜡，避6）免组织块直接与空气接触（不进行封闭，会使组织块在长期的暴露过程中，含水量发生变化，易于与支撑蜡块分离，造成后续再次切片困难）切片盒中切片，干燥后可在室温下长期放置，推荐切片完成后及时进行后期组织染7）色或组织免疫化学孵育。

石蜡切片免疫组化四、选取合适的组织切片（需要根据实验目的选取，如本实验中需要观察不同分组内海马部11.位相应位置病理改变，则切片选取时需满足左右海马结构形态大致相当，不同分组间切（目的在于烘烤2h海马的大小及在脑部大致位置相当），置于切片架放于60度烘箱内，融化载玻片上的石蜡）切片脱蜡、梯度复水：烘烤完成后，将切片迅速置于备好的二甲苯玻璃缸内（一定要用12.玻璃缸盛放二甲苯）进行脱蜡复水，具体流程如下：5min95%乙醇I 5min→无水乙醇II 5min →二甲苯I 10min→二甲苯II 10min→无水乙醇5minX3 →蒸馏水→50%乙醇5min→80%乙醇5min →70%乙醇5min5min→90%乙醇建议在梯度酒精过程中不要省略梯度，因为梯度跨越较大时易导致脱片备用微波抗原修复：准备枸橼酸盐缓冲液，调至pH 6.013.（放复水完成的切片放入沸腾的缓冲液中将缓冲液装入组化盒内，微波加热至沸腾状态，，将组化盒再次放入微置过程速度要缓慢，防止因温度变化较大导致的组织片子脱落）95度以上且不沸腾波炉内，间断性微波加热修复，具体要求：保持修复液温度具体操作：20min，持续时间90s，此间调整火力为80%1）组化盒放入微波炉内，关好炉门，静置（能够保证循环时间够即可），暂12~17s2）静置完成，打开开始按钮，微波加热计时，以微波炉工作时间为准计时，此间不打开微波炉门停加热，静置计时90s 加热过程）静置完成，重复步骤2 3 10-15过程次，修复完成）重复2、34 修复完成后，将组化盒从微波炉内取出（防止烫手），室温放置，自然冷却至室温14.缓冲液的组化盒内冷却完成后，将组化架从修复缓冲液中轻轻取出，置入另一装有PBS15.，以组化盒内液面震荡摆动为宜，太快易使片子脱落）摇床震荡清洗（摇床速度不能太快，清洗5minX316.（一）免疫荧光染色1）用组画笔沿组织片周边，划线圈住组织所在区域，划线距离组织5mm左右（太远会浪费抗体，太近易造成边缘效应）2）将切片置于孵育盒内（盒内加入适量水分保持湿度），5% BSA均匀滴加于组织切片上，分布于整个圈住区域，避光孵育1h3）孵育完成后，将切片重新置于切片架上，用PBS于组化盒内振洗5minX34）一抗稀释液或者PBS稀释一抗至工作浓度，将一抗滴加在切片上，用200ul枪头将抗体均匀涂布至整个圈住区域，将切片放置于孵育盒，盖好盖子置4度孵育过夜；5）孵育时间到后，将孵育盒拿出置室温复温30min，PBS振洗5minX36）PBS稀释荧光二抗至合适浓度（通常1:200），将二抗滴加在组织片上，放在孵育盒避光3 / 45minX3振洗1h，避光PBS孵育避hoechst稀释至工作浓度），DAPI或染核（本实验室常用hoechst，1:10007）用hoechst5minX3 振洗，避光PBS光染核15min ）甘油或是抗淬灭封片剂，避光封片；8（建议封片后及时进行成像处理，天最长不要超过3直接成像拍照，或放置在4度保存，9）因为放置时间越长，荧光淬灭越严重）注意：整个染色过程中，组织切片均应保持湿润，否则会大大增加成像背景，降低图片质量。

（二）免疫组织化学染色1）将切片放置在孵育盒内，3% H2O2 均匀滴加于切片，避光孵育15min（去除内源性过氧化物酶，减少非特异性显色）2）孵育完成后，PBS振洗5minX33）用组画笔沿组织片周边，划线圈住组织所在区域，划线距离组织5mm左右（太远会浪费抗体，太近易造成边缘效应）4）将切片置于孵育盒内（盒内加入适量水分保持湿度），5% BSA均匀滴加于组织切片上，分布于整个圈住区域，避光孵育1h5）孵育完成后，将切片重新置于切片架上，用PBS于组化盒内振洗5minX36）一抗稀释液或者PBS稀释一抗至工作浓度，将一抗滴加在切片上，用200ul枪头将抗体均匀涂布至整个圈住区域，将切片放置于孵育盒，盖好盖子置4度孵育过夜；7）孵育时间到后，将孵育盒拿出置室温复温30min，PBS振洗5minX38）滴加相应抗性二抗（实验室使用的为中山金桥试剂盒），室温孵育1h9）配置合适体积的DAB显色液（中山金桥试剂盒），二抗孵育完成后，PBS润洗5minX3，将DAB 显色液滴加在切片上，于显微镜下观察样本的显色情况，显色深度合适后，将切片置入备好的自来水中，终止显色过程，记录所需要显色时间，控制同一批样本的显色时间一致；10）显色完成后，将切片置于苏木素染液中染核（染色时间根据苏木素染液配制时间长短决定，新鲜配制的染液，染色1-2min即可，染液时间较长，则需要延长染色时间；染色液配制依次最长使用时限不超过6个月，一般在三个月时，染色效果便开始明显下降）11）染色完成后，将切片置入自来水中洗去多余染液，后将切片置于组化架上于1%盐酸酒精溶液分化5-10s（分化时间太长会导致染核着色全部脱落）12）分化完成，自来水洗去多余分化液，用0.2%氨水做返蓝处理6-8s（此过程一定要注意操作轻柔，极易脱片）13）自来水洗去多余氨水，进行脱水透明处理95%乙醇I 5min→95%乙醇II 5min→二甲苯I 5min→二甲苯II 5min14）透明完成，用中性树脂封片（封片过程不能使切片干燥，干燥后直接碎裂）15）尽量过夜后再行成像观察（此时树脂凝固完全）4 / 4。