植物抗旱生理指标测定原理及方法

植物抗旱生理指标测定原理及方法

生命科学学院

杨歌

指标测定：

一、可溶性糖（蒽酮法）

二、脯氨酸

三、丙二醛

四、叶绿素

五、蛋白（考马斯亮蓝法）

六、超氧化物歧化酶（SOD）

七、过氧化物酶（POD）

八、谷胱甘肽（GSH）

九、电导率

一、可溶性糖含量的测定

1.蒽酮法

1.1原理

糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在可见光吸收峰位620nm。

测定对象：几乎可以测定所有的碳水化合物，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应，所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量）。

1.2 步骤

试剂：(1)浓硫酸；

(2)蒽酮乙酸乙酯试剂：蒽酮------------1g

加乙酸乙酯至----50ml

实验步骤：

（1）称取样品0.1g，置于研钵中，加4ml ddH2O研磨成匀浆，8ml ddH2O洗涤研钵。

（2）100°C沸水浴10min，冰上冷却。

（3）4000rpm离心10min。

（4）取上清5ml转移至100ml容量瓶定容。

（5）1ml提取液+ 1ml ddH2O+0.5ml蒽酮+5ml浓硫酸，轻轻混合均匀，100°C沸水浴10min，冰上冷却。

（6）620nm处测吸光值。

1.3 计算方法

可溶性糖含量% = C*V/(W*10^6)*100%

V为植物样品稀释后的体积（ml）------100ml

C为提取液的含糖量（μg/ml）--------根据标准曲线计算

W为植物组织鲜重量（g）-------------0.1g 问题及质疑：

1.目标糖含量：

标准曲线是用葡萄糖位标准制作的，而蒽酮法是测总糖的量，包括己糖、戊糖，浓硫酸将淀粉、纤维素水解成的单糖，将总糖得出的OD值代入由单一糖做出的标准曲线，有一定误差存在。注：查看所有文献的标准曲线都是用葡萄糖制作。

2.误差分析：

（1）不同糖类与蒽酮试剂反应的显色程度不同。果糖最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖最浅造成误差。

（2）蒽酮试剂溶解度较低，非常容易析出，在反应时加入糖的水溶液中，出现浑浊现象，影响反应进行。（3）介于以上原因，将上清5ml转移至100ml容量瓶定容，稀释程度过大，当糖含量少的时候，大的误差可能会掩盖真实的糖含量。造成品数据没有实际意义。

方案修改意见：

1.首先，做五到六组空白，测试

分光光度计误差程度。

2.增加平行组数，由三组增加至

五组，减少每个样品测试次

数。

3.改变测试样品定容量，由

100ml变为50ml。

二、脯氨酸含量的测定

1.茚三酮法

1.1原理

在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，但在逆境（干旱、低温、高温、盐渍等）及植物衰老时，植物体内游离脯氨酸含量可增加10-100倍，并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。

用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。

1.2步骤

试剂：（1）25%茚三酮：茚三酮------------0.625g

冰乙酸------------15ml

6mol/L磷酸--------10ml

70°C水浴助溶；

（2）6mol/L磷酸：85%磷酸稀释至原体积的2.3倍；

（3）3%磺基水杨酸：磺基水杨酸------3g

加蒸馏水至------100ml

实验步骤：

（1）称取0.1g样品放入研钵，加5ml 3%磺基水杨酸研磨成匀浆，100°C沸水浴15min；

（2）冰上冷却，4000rpm离心10min；

（3）提取液2ml+冰醋酸2ml+25%茚三酮2ml混合均匀，100°C 沸水浴30min，冰上冷却；

（4）加4ml甲苯混合均匀，震荡30s，静置30min；

（5）以甲苯为空白对照，再520nm下测定吸光值。

1.3计算方法

脯氨酸含量（μg/gFW）＝ X * 提取液总量（ml）/

样品鲜重（g）*测定时提取液用量（ml）*10^6

公式中：X-----从标准曲线中查得的脯氨酸含量（μg）

提取液总量---------------------------5ml

测定时提取液用量---------------------2ml

问题及质疑：

1.酸性体系下，脯氨酸与茚三酮加热反应后的最终产物为红色，再实验过程中，仅有少数时候能发现红色产物。原因有待确定。

2.经查看文献资料，反应步骤已经是优化的，没有问题。甲苯萃取脯氨酸与茚三酮的反应产物，消除了多余未反应的茚三酮，磺基水杨酸，提取液中其他杂质（如色素）以及PH变化的干扰。

3.根据茚三酮与脯氨酸的缩合反应分析：

（1）反应体系的PH控制很重要，保持酸性环境，否则，反应产物的最大吸光值并不在520nm。

（2）极限干旱材料或者重脱水材料的脯氨酸含量大，材料干重比新鲜材料多数倍，加相同量的茚三酮，反应程度应该有所不同。而脯氨酸含量少的样本，容易受到各种因素的干扰。