脯氨酸含量的测定

植物组织游离脯氨酸含量的测定

(一)实验原理

植物在逆境条件下，游离脯氨酸便会大量积累，且积累指数与植物的抗逆性有

关。因此，脯氨酸可作为植物抗逆性的一项生化指标。

采用磺基水杨酸提取植物体内的游离脯氨酸，不仅大大减少了其他氨基酸的干

扰，快速简便，而且不受样品状态(干或鲜样)限制。在酸性条件下，脯氨酸与茚三酮反应生成稳定的红色缩合物，用甲苯萃取后，此缩合物在波长520 nm处有一最大吸收峰。脯氨酸

浓度的高低在一定范围内与其消光度成正比。

(二)实验材料、仪器设备及试剂

1材料

植物叶片

2仪器设备

分光光度计，恒温水浴锅，漏斗，具塞刻度试管(20 ml)，移液枪(1 ml和5 ml)，

5 ml和1 ml刻度试管，烧杯，吸水纸，玻璃棒，试管架，比色皿等。

3试剂

(1)3 %磺基水杨酸溶液：万分之一电子天平称取 3 g磺基水杨酸，然后将称好药品

溶于100 ml蒸馏水中。

(2)甲苯

(3)2.5 %酸性茚三酮显色液：冰乙酸和 6 mol L-l磷酸以3:2混合，作为溶剂进行配

制，此液在4C下2〜3天有效(此步骤重要)。称取1.25 g茚三酮放入烧杯中用混合液

50 ml放入70C水浴锅中溶解，冷却。

(4)脯氨酸标准溶液：准确称取25 mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250 ml，其浓度为100

ug/ml。再取此液10 ml，用蒸馏水稀释至100 ml，即成10 ug/ml的脯氨酸标准液。

三•实验方法

1标准曲线制作

(1 )取7支具塞刻度试管按表2加入各试剂。混匀后加玻璃球塞，在沸水中加热40 min。

试管号

0 1 2 3 4 5 6

脯氨酸标准溶液

0 0.2 0.4 0.8 1.2 1.6 2

/ml

水/ml 2 1.6 1.2 0.8 0.4 0.2 0

冰乙酸/ml

2 2 2 2 2 2 2

茚三酮显色液

3 3 3 3 3 3 3

/ml

脯氨酸含量/ [1 g 0 2 4 8 12 16 20

(2)取出冷却后向各管加入 5 ml甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯

层以0号管作为对照在波长520 nm下比色。

(3)以消光值为纵坐标，脯氨酸含量为横坐标，绘制标准曲线，求线性回归方程

¥ = 0.0255%-DJ02652

呼=099377

2样品测定

(1)脯氨酸提取：从-80C冰箱中取出样品，放入事先装好液氮的保温桶中。每个样品均取0.2 g左右，分

别置于大试管中，加入 5 ml 3 %磺基水杨酸溶液，管口加盖玻璃球，于沸水浴中浸提10 min。

(2)取出试管，待冷却至室温后，吸取上清液 2 ml，加2 ml冰乙

酸和3 ml显色液，于沸

水浴中加热40 min，下步操作按标准曲线制做方法进行甲苯萃取和比色(向各管加入 5 ml

甲苯充分振荡，以萃取红色物质。静置待分层后吸取甲苯层以0号管作为对照在波长520 nm

下比色)。

(3)结果计算：从标准曲线中查出测定液中脯氨酸浓度

脯氨酸含量的百分数。

脯氨酸[卩g.g -1(干或鲜重)]=(C • V) • (a • W)- 1

式中：C 一提取液中脯氨酸浓度，由标准曲线求得：

V —提取液总体积(ml)

A --- 测定时所吸取得体积(ml)

W----- 样品重(g)

海拔处理编号吸光度

标准曲

线斜率稀释倍数

提取液中脯氨

酸含量C (ug)

提取液总体积V

(ml)

测定时所吸取

的体积a (ml)

样品重(W

脯氨酸含量

ug\g

平均值

2900

CK

1 1 1

1 1 2

1 1 3

1 1 4

PEG

1 2 1

1 2 2

1 2 3

标准曲线

50

脯氨酸含重