毛细管电泳法测定毛发中氨基酸

毛细管电泳电化学检测分离测定毛发中的色氨酸酪氨酸和半胱氨酸

1.试验部分

1.1仪器与试剂

毛细管电泳-电化学检测系统(CE - ED) 为自组装, 包括±30 kV 高压电源(上海原子核研究所) ；三电极工作系统（直径为300μm的碳圆盘电极为检测电极、铂丝为辅助电极、饱和甘汞电极为参比电极）；三维定位调节器（上海联谊光纤激光

器械厂）；BAS LC- 3D 安培检测器(Bioanalytical Systems , USA) ；HW色谱工作

站（上海千谱软件有限公司）；熔融石英毛细管(长70cm，内径25μm，河北永年光导纤维厂)；超声波清洗器；毛细管清洗器（上海医科大学仪器厂）；分析天平色氨酸，酪氨酸，半胱氨酸；头发样品：志愿者提供；其它试剂为分析纯。

1.2标准溶液及样品溶液的制备

标准溶液：色氨酸，半胱氨酸储备液：1.0×10- 3 g/m L，酪氨酸储备液：0.5×10- 3 g/m L，用50mmol/L硼砂－20mmol/L氢氧化钠溶液配置，再用运行缓冲液稀

释至所需浓度。

样品溶液：将头发用石油醚脱脂，干燥后称取50mg置于水解管中，加入3mL6mol/L氢氧化钠（含0.5％可溶性淀粉）；水解管用真空泵抽真空3min，在酒精

喷灯上封管；然后，将封好的水解管置于110o C烘箱中水解20小时。将水解液置于已

加有2.9mL6mol/L盐酸溶液的25mL容量瓶中，用蒸馏水洗涤水解管3～4次，最后用

蒸馏水定容。

1.3 试验方法

毛细管使用前依次用0.1mol/L的NaOH、二次水、缓冲液各冲洗5min、2min、10min。自制碳圆盘电极使用前要用细砂纸打磨，并用超声波清洗2min，使用自组装的CE-ED检测系统，通过三维定位调节器使工作电极与毛细管的出口在同一直线上，并尽可能靠近毛细管的末端，以50mmol/L的硼砂（pH ＝8.98）缓冲液为运行液，采用电动进样，检测池内为0.1mol/L的NaO H溶液，阴极电泳槽为检测端。所有溶液使用前均用0.25μm聚丙烯滤膜过滤。

2 结果与讨论

2.1 3种氨基酸的分子量及等电点的比较

3种氨基酸的分子量：色氨酸（M r=204.11）>酪氨酸（M r=181.09）》半胱氨酸（M r=121.12）；等电点：色氨酸（pI=5.89）> 酪氨酸（pI=5.66）> 半胱氨酸（pI=5.07）；毛细管电泳的分

离机理主要取决于待分离物质的分子大小及其在分离体系中自身所带电荷的多少。3种氨基酸在pH为8.98的缓冲液中均带负电荷，而且所带负电荷量与其等电点成反比，在毛细管中的迁移速率与物质的带负电荷量成正比，与物质的分子量大小成正比。色氨酸与酪氨酸的分子质量和等电点都比较接近，由此可知，色氨酸与酪氨酸的分离将成为难点。

2.2 电泳条件的优化

2.2.1 流体动力学伏安图

图1为色氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的流体动力学伏安图，由图可知，色氨酸、酪氨酸，从0.75 v到0.95v，随氧化电压的变大，峰电流缓慢变大，在氧化电压为1.0时，峰电流迅速变大；而从0.75 v到1.0 v，半胱氨酸的峰电流变化幅度较大。综合灵敏度和稳定性的因素，选择检测电位为1.0v。