神经干细胞原代取材与培养
大鼠神经干细胞分离和培养的实验研究
一44一重庆医科大学学报2∞8年第33卷增刊l(J oum aI of C h ong qi ng M ed i caI U n．vers i ty2∞8．V o|．33No．s1)基础研究文章编号：0253—3626(2008)sl—0044—04大鼠神经干细胞分离和培养的实验研究何梅-，王学峰，马珊珊：，席志芹(1．重庆医科大学附属第一医院神经内科，重庆400016；2．山西医科大学第一附属医院神经内科，太原030001)【摘要】目的：探索体外培养大鼠神经干细胞(N eur al st e m ceus，N s cs)的方法和实验条件，建立一种较为可靠的神经干细胞培养方法。
方法：分别选取孕14～16ds D胎鼠和新生1d的sD大鼠进行神经干细胞培养，采用单纯机械吹打和机械吹打加酶消化丽种方法进行消化，对培养出的细胞进行神经干细胞、神经元、神经胶质细胞的免疫细胞化学和免疫荧光鉴定。
结果：用2种来源的大鼠培养出的原代细胞，均表达N es t i n，诱导分化后的细胞表达G FA P和M A P-2。
结论：大鼠神经十细胞的原代分离与培养的关键是单细胞悬液的获得，消化液浓度太高或消化时间太长，容易因消化过度致细胞损伤甚至死亡。
胎鼠来源者神经球形成早，数量多。
增殖活力更强，但原代取材过程易被污染。
新生鼠来源者鼠源易获得，组织取材过程操作简单，但神经干细胞成球率低。
【关键词】神经干细胞；细胞培养；免疫荧光；免疫生化【中国图书分类法分类号】R74l【文献标识码】A【收稿日期】2007一08—29St udV on i soI at j on and cul t ur e O f neur aI s t em C e¨s f r O m r at br ai nH E M ei．e￡击0D epdr t m em《N e酣ol ogy，t k F订st A航l谴ed H ospi斌，C hongqi唱M ed记击U n洳er s畸)【A bst ract】O巧ec渤e：To es讪l i s h岫m em od of cul t ur i ng neur al哟m ceus(N s cs)妇n ra t brai n．胁跏ds：E14～16sD吣一br yoni cm￡brai n粕d pos t nat aJ one—da y(P1)r a t br aj n w e r e r es pecti vel y ch ose t o cul t l l r e ne u m l st e m ceU s，an d t’帕diges t ive m et h—ods t}l at s i m pk m e ch肌i ca l di ges t i on a nd m e chan i ca l com bi ned诵t}l che m i c al diges t主on w e r e u8ed t o det e兀ni ne t l l e bes t condi—t ions i n pr i m ar y cuhur e．I m m un∞yt oc hem i st I y and i m m u noⅡu or e sce nc e w er e us ed t0i dent i母N SC s，ne urons a nd neum di al cel l s．R8s饿捃：B o t h t l l e pri m a巧ceu s f r o m t w o dⅢbr ent ki nds0f ra t bm i ns ex pr es sed nes ti n aJ l t i g en粕d t}l e di任br en t i ated cel l s ex—pr e ssedG F A P锄d M AP一2明t i gen．∞似砌6s暮D竹：ne key poi nt of pr i m ar y N SC s cul t ur e w鹊obt ai ni ng t he m on叩l鹊t s u叩ens i on．0ver di gest i on l ed t o c eu i nj u r y ev en de am．N SC s舶m em br yoni c ra t br ai n had bet t er pm l i f er at i on abi l i t y粕d co ul d f0肌ceⅡcl ones ea r l i er粕d m or e t}I an N SC s f南m new b om E a t br ai n，but t11e y w e r e e鹊i er t o be contam i nat ed．0h t ai n i ng new b om m t bm i n锄d i sol ati on N SC s舶m new bom ra t br ai n w er e e鹊i er，b ut N SC s舶m new bom ra t br ai n had w o璐e pm l如m t i on abi l吼【K ey w or ds】N eur al st e m ce ns；ceu cu l t u r e；I m m un onu or esc enc e；I m m uno cyt o che m i st r yN S cs是一种原始的未分化细胞，它有和成熟神经细胞相同的基因，且具有自我增殖和多向分化的潜能，神经干细胞研究是21世纪生命科学研究的重要领域。
干细胞移植治疗神经系统疾病的实验操作指南
干细胞移植治疗神经系统疾病的实验操作指南概述：干细胞移植作为一种新兴的治疗方式，对于神经系统疾病的治疗具有巨大的潜力。
本文将为您提供干细胞移植治疗神经系统疾病的实验操作指南，以帮助您了解该技术的操作步骤和注意事项，为相关研究提供指导。
一、干细胞准备1. 来源选择：根据实验需要，选择适合的干细胞来源，如胚胎干细胞、成体干细胞或诱导多能干细胞。
2. 培养条件：根据所选干细胞类型的特点，准备相应的培养基和培养条件。
3. 提取和扩增：按照已有的干细胞培养方法，提取和扩增所需数量的干细胞。
二、移植方案设计1. 移植时间：根据疾病模型和实验需要，确定最佳的移植时间点。
2. 移植部位：根据神经系统疾病类型和病变区域，选择合适的移植部位。
3. 移植剂量：根据实验目的和前期研究，确定合适的干细胞移植剂量。
4. 移植方式：根据实验需要和疾病特点，选择适当的移植方式，如直接注射、脑室内注射或手术植入等。
三、手术操作1. 麻醉准备：根据动物模型和实验需要，选择适当的麻醉方法，确保动物在手术过程中处于稳定的麻醉状态。
2. 手术切口：根据移植部位和手术需要，准备合适的手术切口，并遵循无菌操作的要求。
3. 移植导向：使用显微镜或其他可视化工具，将干细胞准确地引导到目标区域，并避免伤及正常组织。
4. 封闭切口：根据手术切口的大小和位置，选择适当的封闭方法，确保切口愈合。
四、术后处理1. 注意观察：术后及时观察动物的行为、体重、食欲等指标，记录观察结果。
2. 抗感染处理：根据手术切口和动物情况，合理选用抗生素和抗炎药物，预防感染和减轻炎症反应。
3. 长期随访：根据实验需要，进行长期的随访观察，记录干细胞移植后的治疗效果和动物的生存情况。
五、实验数据分析1. 数据收集：按照实验设计和操作步骤，及时收集相关数据，如神经功能评估、病理检测等。
2. 数据分析：根据实验目的和数据特点，选择合适的统计方法和数据分析工具，对实验结果进行科学、客观的分析。
新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及分化研究
新生大鼠海马神经干细胞的分离培养及分化研究苗宗宁;吴卫江;钱寒光;赵基栋【摘要】研究新生大鼠海马区脑组织中神经干细胞体外培养方法，为治疗神经系统疾病寻找合适的细胞来源。
取新生SD大鼠的海马区脑组织，采用accutase结合机械分离法获取神经干细胞，在含有B－27、碱性成纤维生长因子和表皮生长因子的DMEM／F12无血清培养液中培养；Accutase酶消化后传代培养，取第3代细胞行抗巢蛋白免疫荧光染色鉴定并以含10％胎牛血清培养液诱导分化，神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白免疫荧光染色检测NSCs向神经元及胶质细胞分化的能力。
分离的新生大鼠海马区脑组织中细胞，在无血清培养液中形成大量的神经球，部分神经球出现融合及贴壁分化现象，细胞呈典型NSCs 形态。
经巢蛋白染色鉴定，大部分为阳性细胞。
神经细胞球经含有胎牛血清培养液培养后，可分化为神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白表达阳性的细胞。
从新生大鼠海马组织分离培养的NSCs具有自我更新和增殖能力，在含胎牛血清培养液中具有向神经元和神经胶质细胞分化的潜能。
%To establish the method of culture neural stem cells in the hippocampus of neonatal rats in vitro in order to find a suit-able cell source for the treatment of nervous system diseases.NSCs were isolated use accutase and mechanical separation method from hippocampus area of neonatal SD rat.The cells were cultured in completely medium and medium components include DMEM/F12 ser-um-free medium,B27,basic fibroblast growth factor and epidermal growth factor.Anti nestin immunofluorescence staining were used to identify the third generation cell after accutase enzyme digestion andsubculture.Culture medium containing 10%fetal bovine serum were usedto induce NSCs,NF-200 and GFAP immunofluorescence staining were used to identify the differentiation of NSCs to neu-rons and glial cell.In the hippocampus of neonatal rats,a large number of nerve cells were formed in the serum free medium,and some of the neural spheres appeared fused and adherent differentiation.The cells showed typical NSCs morphology.The expressions of nestin staining showed that most cells were positive.Nerve cell spheres could differentiate into neurons and glial fibers acidic protein expression positive cells after cultured with medium containing fetal bovine serum.The NSCs isolated from the hippocampus of neonatal rats has the ability of self-renewal and proliferation,which has the potential to differentiate into neurons and glial cells in the serum containing fetal bovine serum.【期刊名称】《生物医学工程研究》【年(卷),期】2016(035)004【总页数】6页(P303-308)【关键词】海马;神经干细胞;分离培养;细胞分化;新生大鼠【作者】苗宗宁;吴卫江;钱寒光;赵基栋【作者单位】江苏无锡市第三人民医院，江苏无锡214041;江苏无锡市第三人民医院，江苏无锡214041;江苏无锡市第三人民医院，江苏无锡214041;江苏无锡市第三人民医院，江苏无锡214041【正文语种】中文【中图分类】R3181 引言神经干细胞（neural stem cells，NSCs）是一类起源于神经外胚层，具有自我更新能力并在一定条件下分化为神经元和胶质细胞的多潜能干细胞［1-3］。
人类神经干细胞的长期培养和传代_cropped
〃神经干细胞基础研究〃人类神经干细胞的长期培养和传代杨立业 刘相名 惠国桢 赵文娟 费俭 郭礼和【摘要】 目的 探讨人类神经干细胞的体外培养条件及其传代的方法 。
方法 采用机械方法从胎脑中分离神经细胞 , 应用 N2 培养基进行培养 , bFG F 和 EG F 刺激细胞扩增 ; 传统方法和对神经球切 割的方法进行传代培养 ; 应用免疫组织化学染色对培养的细胞及其分化的细胞进行鉴定 。
结果 从胎脑当中成功培养出人类的神经干细胞 , 培养条件下呈悬浮状态生长 , 形成神经球 , 绝大多数的细胞表 达波形蛋白和 Musashil 两种神经干细胞的标志物 ; 这种细胞可分化为神经元和星型胶质细胞 , 早期的 培养有少量的少突胶质细胞 ; 在这种培养条件下 , 神经干细胞生长速度较慢 , 而采用切割神经球的方 法保持了细胞间的联系 , 神经干细胞可获得较大的扩增速度 。
结论 在体外的培养条件下 , 可从胎脑 组织中培养出神经干细胞 , 它可做为中枢神经系统疾病移植治疗的潜在细胞来源 。
【关键词】 神经干细胞 人类 培养T he long 2term culture and p a ssa ging of human neural stem cells Y ANG Liye , L I U Xiangming , HUI G uozhen , et al . Department o f Neurosurgery , the First H ospital o f suihow Univ ersity , S u zhou 215007 , C hina【Abstract 】 O b jectiv e T o explore the cu lture cond itions for hu man neural stem cells and to investig ate th epassag ing method. M ethods The cells from the embry onic hu man cortex w ere mechanically dissociated. N2 med i 2 u m w as ad apted to cu lture the cells , bFG F and EG F w ere added to expand the cells , The cells w ere id entified b y im 2 munocytochemistry. R esults Neural stem cells from embry onic hu mans have b een su ccessf u lly cu ltured. Th ey formed typical neurosp heres in suspension , and the m ajorities of the cells expressed vimentin and Musashil , w hich w ere the markers for neural stem cells. The cu ltured cell cou ld d ifferentiated into neurons and astrocy tes. The neural stem cells mu ltiplied very slowly und er the cu lture cond itions , how ever the best expansion w as achieved w hen the neu 2 rosp heres w ere d isected into several parts and the cell link w as conserved when passag ing. Conclusio ns Hu man neural stem cells cou ld b e cu ltured from embry onic brains. They cou ld form the ty pical neurosp heres in suspension in vitr o , w hich may b e potential source for transplan tation in treating C NS disord ers in hu man s.【 K ey w ords 】 Neural stem cell Hu man Cu ltureco ΠBR L ) ; bFG F (碱性成纤维细胞生长因子) 、EG F(表 皮 生 长 因 子) 、多 聚 鸟 氨 酸 、层 粘 连 蛋 白 、肝素 、胰岛素 、腐胺 、转铁蛋白 、硒化钠和孕激素 ;抗波形蛋白单克隆抗体 (B D Bi osciences , 1 ∶100) ; 抗 Musashil 抗 体 ( 由 日 本 大 阪 大 学 Okano 教 授 惠 赠 , 1 ∶200 ) ; 抗 G FAP ( Dako , 1 ∶100 ) ; 抗 NF神经干细胞在体外有持续的增殖能力 , 是将来 移植细胞较为理想的来源 。
神经干细胞提取与培养方法的比较研究
网络出版时间：２０１８－４－１２９：１３ 网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｋｎｓ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／３４．１０８６．Ｒ．２０１８０４１１．１０３３．０５４．ｈｔｍｌ◇实验方法学◇神经干细胞提取与培养方法的比较研究吴 增１，李 媛１，靳晓飞２，周晓红２，高维娟２（１．承德医学院病理生理学教研室，河北承德 ０６７０００；２．河北中医学院河北省心脑血管病中医药防治重点实验室，河北石家庄 ０５０２００）收稿日期：２０１７－１２－２４，修回日期：２０１８－０１－２０基金项目：河北省政府资助临床医学优秀人才培养和基础课题研究项目（［２０１７］４６号 ２）；河北省中医药管理局科研计划项目（Ｎｏ２０１５００７）；河北省教育厅科研计划资助项目（ＮｏＺＤ２０１６１０１）；河北省博士学位点科研能力建设项目（Ｎｏ１７９６７７１１４Ｄ）；河北省硕士研究生创新资助项目（ＮｏＣＸＺＺＳＳ２０１７１３６）作者简介：吴 增（１９８９－），男，硕士生，研究方向：缺血性脑血管病的发生机制及中医药防治，Ｅ ｍａｉｌ：１５０３０７８６０８０＠１６３．ｃｏｍ；高维娟（１９６６－），女，博士，教授，博士生导师，研究方向：缺血性脑血管病的发生机制及中医药防治，通讯作者，Ｅ ｍａｉｌ：ｇｗｊ６０８８＠１６３．ｃｏｍｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－１９７８．２０１８．０５．０２７文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０１８）０５－０７２９－０６中国图书分类号：Ｒ ３３２；Ｒ３２２．８１；Ｒ３２９．２４；Ｒ９７７．６摘要：目的 探讨神经干细胞（ｎｅｕｒａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＮＳＣｓ）提取、培养的最佳方法，为ＮＳＣｓ的基础研究提供技术参考。
方法 对ＮＳＣｓ的不同提取、培养方法进行比较：提取胎鼠与乳鼠的大脑皮质、采用不同类型培养基、不同接种密度、不同培养方法、不同换液方法、不同传代方法，观察ＮＳＣｓ的成球率和ＮＳＣｓ未分化状态的稳定性。
神经干细胞培养方法
与神经干细胞诱导分化的细胞因子有
IL-1 1等。
1.白细胞介素类
,如IL-1、IL-7、IL-9及
2.神经营养因子对神经干细胞分化到终 末细胞的整个过程均有影响 ,如果将培养的神经 干细胞置于脑源性神经营养因子作用下 ,大量的神 经干细胞可以表现出分化神经元的特性。
3. 生长因子类 ,如上皮生长因子、神经生长因子及碱性成纤 维细胞 生长因子等也影响神经干细胞的分化。 T3 ---少突细胞细胞 睫状神经营养因子---星形胶质细胞分化 血小板源性神经营养因子----神经元 BFGF EGF -----保持未分化状态。 神经干细胞对不同种类、不同浓度的因子以及多种因子联合应用作用各 不相同 ,在神经干细胞发育分化的不同阶段 ,相同因子的作用也不同。
材料与方法
材料：
– 采用新生当天24h内的Wistar大鼠皮层、中脑。 – 神经干细胞培养基：DMEM/F12，B27、 bFGF, EGF。 – 抗Nestin 单克隆抗体和 SABC试剂盒为晶美 公司代理CHEMICON产品。 – 抗NSE、抗GFAP。抗CNPase – AO、PI荧光染料为Sigama产品。
展望
• 目前神经干细胞的来源、分离、培养及鉴 定还有许多工作要做, • 神经干细胞诱导、分化及迁移机制有待进 一步研究。 • 通过细胞培养技术及基因组的研究，进一 步认识神经干细胞的本质和控制分化基因
展望
• 通过调控靶基因 ,可以从神经干细胞诱导产 生特定的分化细胞来满足各种需要。横向 分化的发现对神经干细胞的研究和应用具 有重要意义 • 人们可望从自体中分离诱导出神经干细胞 , 有可能解决神经干细胞的来源问题。总之 , 神经干细胞的应用将有广阔的前景。
实验方法：
1 神经干细胞分离和传代 2 单细胞克隆及传代：单细胞克隆采用有限稀释法 （具体方法参考文献Reynolds） 3 神经干细胞克隆球的诱导分化和免疫细胞化学鉴 定：
人胚脑组织干细胞的分离、培养与鉴定
人胚脑组织干细胞的分离、培养与鉴定神经干细胞（neural stem cells, NSCs）是一种具有自我更新及广泛分化潜能的细胞，它处于分化的非终末状态，可通过对称或不对称分裂出新的干细胞或分化潜能逐渐变小的子细胞，终于产生中枢神经系统的三种主要细胞，即神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
采纳无血清培养和单细胞克隆法可从人胚脑皮层中分别得到具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞，并采纳免疫荧光染色对其举行鉴定。
【材料】 1．组织来源胚龄10周自然流产的人胚胎。
2．培养用试剂（1）无钙镁PBS (CMF-PBS )。
(2）消化液：0.25%和0.02% EDTA混合消化液。
3．培养基配方和制备（1)人胚脑组织干细胞培养液：DMEM/F12 (1：1)无血清培养基，含有2% B27,20ng/ml表皮细胞生长因子（epidermalgrowth factor, EGF) ,20ng/ml bFGF。
(2）人胚脑组织干细胞诱导培养液：添加20％的DMEM/Fl2 (1：1)。
4．试验器材眼科直剪、眼科直镊、眼科弯镊、玻璃平皿、200目尼龙滤网、50ml和15ml离心管、手术刀片。
【办法】 1．取材无菌条件下分别出胚胎大脑皮质组织，剥除脑膜及表面血管，在PBS液中漂洗3次。
在含有DMEM/F12的培养液中，用眼科剪将其充分剪碎。
2．消化用0.25%和0.02% EDTA混合消化液消化细胞团5分钟，吸管将细胞团打散，加入含10% FBS的培养液终止反应。
3．分别细胞将细胞悬液移入离心管中，1000r/min离心5分钟，弃上清液。
用巴斯德吸管反复吹打组织碎块至彻低散开，离心洗涤后吹打制成细胞悬液，经100目不锈钢滤网过滤，制成单细胞悬液。
4．接种与培养细胞计数，将细胞以2x106/ml密度接种至培养板上。
置37℃,5% C02饱和湿度的孵箱中培养。
直至NSCs增殖形成神经球后再换液。
首次传代后每3天半量换液。
小鼠成年性神经干细胞的分离和纯化
小鼠成年性神经干细胞的分离和纯化神经干细胞被认为是一类具有自我更新和多潜能分化亚群的细胞，能够产生成熟神经元和神经胶质细胞。
而小鼠成年性神经干细胞的分离和纯化一直是神经科学研究的一个重要课题。
小鼠成年性神经干细胞的分离和纯化的方法主要有两种：体外培养和体内标记。
其中，体外培养法是常用的方法之一，其主要步骤包括：从小鼠脑组织中分离出神经干细胞，将其在低黏附培养条件下培养，用培养基逐渐去除非神经干细胞，提纯出纯正的神经干细胞。
具体来说，小鼠脑组织的分离和消化可以通过切片法或酶消化法完成。
其中酶消化法可用的酶有多种，如胰酶、玉米胚芽酶等。
一般来说，使用Papain是最常见的方法，其消化时间和浓度的选择需要根据组织的类型和实验的要求而定。
随后将细胞分离并筛选，即可获得含有神经干细胞的原代培养物。
接下来，体外培养条件的优化是保证培养成功率的重要因素。
小鼠成年性神经干细胞体外培养中所用的培养基主要包括DMEM-F12培养基和N2培养基或B27培养基的组合。
在培养基添入bFGF (20 ng/ml)和EGF (20 ng/ml)的情况下，小鼠成年性神经干细胞可以存活并自我更新。
同时，将细胞培养在低黏附板上也是培养成功的关键，此时细胞间的物理纽带松弛，可以最大化地模拟细胞在体内的状态。
培养过程中，需要使用划痕法或免疫染色法来鉴定纯度。
对于划痕法，将涂片中的单元格划成斜线，如果发现小鼠成年性神经干细胞在划痕的两侧增殖，则表示培养纯度高。
而免疫染色法则通过检测神经生长因子受体（NGFR）或神经元标记Nestin蛋白，来判断细胞的类型和纯度。
除了体外培养法，体内标记法也是一种可行的小鼠成年性神经干细胞分离的方法。
体内标记法主要是将神经干细胞标记为一种特定的融合蛋白，以便在体内将其分离出来。
目前常用的体内标记法是将神经干细胞瞬间转染为GFP或复合物蛋白的方法，这些蛋白可以较准确地表达在神经干细胞的表面，并带有一个标记蛋白。
神经干细胞原代培养及GABA能神经元的诱导分化
剂盒 均 购 自武汉博 士德 公 司 ； 余 试 剂 为 国产 分 析 其 纯 。所用 荧 光显 微 镜 及成 像 系 统 为 ＮｋｎＥｉｓ８ ｉ ｉｏ ｌ ｅ０ ｐ
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免疫荧光染色可见 Ｎ Ｅ、Ａ Ａ阳性细 胞。加 了分化液 的实 Ｓ ＧＢ
验 组 Ｇ Ｂ 阳性 细 胞 分 化 率 为 （ ０２ － ．２ ％ ， 对 照 组 ＡＡ ３． ５４２ １ ） 而 分 化 率 为 （ ．４４１ ３ ％ 。结 论 １１ ．９） － 主题 词 成 功 从 新 生 大 鼠 脑 组 织
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摘要
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探讨神经 干细胞 （ Ｓ ） Ｎ Ｃ 的原代培 养及 ＾ 氨基 ｙ 一 取 出生 １
目的
由安 徽 医 科 大 学 实 验 动 物 中心 提 供 。 Ｄ Ｍ／ １ ＭＥ Ｆ ２ 培 养基 、２ 表皮 生长 因子 （ ｐｄ ｒ ａ ｇｏ ｔ ｆ ｔ ， Ｂ ７、 ｅ ｉ ｍ ｌ ｒｗｈ ａ ｏ ｅ ｃｒ
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神经干细胞原代提取 nature 文献
神经干细胞原代提取 nature 文献
《神经干细胞原代提取的研究进展》
神经干细胞是一种具有自我更新和分化为神经细胞的潜能的细胞，对于研究神经系统的发育和功能以及治疗神经系统疾病具有重要意义。
神经干细胞的原代提取是神经干细胞研究的重要步骤之一，其质量和纯度直接影响着后续实验的结果和应用的效果。
近年来，关于神经干细胞原代提取的研究取得了一系列重要进展。
科学家们通过不断探索和创新，发展了一系列高效、简便的原代提取方法。
这些方法包括离体组织消化、细胞筛选和富集等多种技术手段，能够在保证细胞质量的同时提高提取效率。
除此之外，研究者们还通过分子生物学和细胞生物学手段，对神经干细胞的特征和生物学功能进行深入研究，为神经干细胞的原代提取提供了更为精准和高效的方法和标准。
然而，尽管神经干细胞原代提取技术已经取得了显著进展，但仍然存在一些挑战和难点。
比如，如何保证提取细胞的稳定性和活力、如何解决提取后的细胞质量下降等问题仍需进一步深入研究和解决。
总的来说，神经干细胞原代提取的研究进展为神经系统研究和治疗神经系统疾病提供了更为可靠和有效的神经干细胞资源，同时也为神经干细胞的应用和转化研究奠定了坚实基础。
随着技术的不断创新和进步，相信神经干细胞原代提取的技术将会不断完善，为神经系统疾病的治疗和康复做出更为重要的贡献。
神经干细胞培养与鉴定
．1神经干细胞的原代培养1)在无菌工作台上取24小时新生SD大鼠4只，乙醚气体麻醉后(也可无需麻醉)，用酒精消毒皮肤。
2)无菌工作台中，用带有无菌手套的左手拿握住消毒后的新生大鼠，充分暴露头部，右手使用已灭菌后的眼科剪打开新生大鼠脑部，按无菌操作规则断头取脑，PBS漂洗3次后，用D．Hanks液漂洗1次，在解剖显微镜下切取前脑侧脑室周围脑组织(含海马)，仔细剔除脑膜和血管等结缔组织后，放入D．Hanks液中冲洗。
．3)在无菌工作台上，用眼科剪将脑组织剪碎至大约0．5mm2的小块，用吸管反复轻柔吹打成细胞悬液。
收集细胞悬液后先后在100目和200目铜网上过滤，从而获得单细胞悬液。
4)细胞计数：用O．4％台盼蓝与细胞悬液按比例均匀混合，血球计数板在显微镜下计数台盼蓝呈阴性的活细胞，小细胞团按单个细胞计数。
5)细胞计数后，放入50ml一次性培养瓶中培养(4～5)x105个活离的细胞(已经凋亡或者其它细胞)无需胰蛋白酶消化液消化剥离，培养期间密切观察细胞生长情况。
(无血清条件培养液有能刺激NSC分裂增殖的细胞因子，所以只有NSC能存活)．2神经干细胞的传代大鼠脑NSC在培养2．-一3d成云雾状，不规则的球形细胞团，4---，6d后成为悬浮生长的神经球。
将悬浮细胞液吸出，采用1000r／min离心5min，弃上清，加入无血清条件培养基，仍用细口径直吸管吹打为单细胞悬液，将细胞重悬，调整细胞浓度为(4～5)×105／ml，依照原条件继续培养。
同时取出部分细胞用于NSC的鉴定。
Nestin免疫组化检测步骤：1)将分离出的部分NSC浓悬液，1000 r／min离心5 min，弃上清；2)加入2ml配制好的4％多聚甲醛，室温固定15---，20分钟；3)PBS浸洗3min 2次，去上清；4)Triton液破膜10 min；5)PBS浸洗3min洗3次，离心去上清，用残留的一滴PBS重悬细胞，将细胞滴在涂有O．1％多聚赖氨酸处理过载玻片上。
神经干细胞培养方法
神经干细胞培养方法
嘿，朋友们！今天咱就来讲讲神经干细胞培养这档子事儿。
你想想啊，神经干细胞就像是一群小小的神奇种子，有着长成参天大树的潜力呢！培养它们呀，就像是在照顾一群宝贝。
首先呢，得给它们准备一个舒舒服服的“家”，这就好比咱自己住得舒服才能心情好不是？这个“家”就是培养皿啦，要干净、无菌，给它们提供一个安全的环境。
然后呢，就是给它们准备“食物”啦。
这“食物”可讲究了，得有各种营养成分，让这些小宝贝们能茁壮成长。
这就像我们人得吃各种好吃的才有劲一样。
还有啊，温度也很重要哦！不能太冷也不能太热，要刚刚好，不然它们可不乐意待着啦。
在培养的过程中，咱可得时刻关注着它们。
就像照顾小孩子一样，看看它们长得好不好呀，有没有啥问题呀。
要是发现有不对劲的地方，那可得赶紧想办法解决。
你说这神经干细胞培养难不难？其实也不难，只要咱用心，就像对待自己最宝贝的东西一样，肯定能把它们照顾好。
想想看，要是咱能把这些小宝贝培养得好好的，那以后能为医学做出多大的贡献呀！说不定就能帮助那些有神经系统疾病的人重新恢复健康呢，这多了不起呀！
所以呀，大家别害怕，大胆去尝试培养这些神奇的神经干细胞吧！只要咱细心、耐心，肯定能收获满满的惊喜呢！这可不是开玩笑的哟，等你真正去做了，就知道其中的乐趣和意义啦！。
神经干细胞的培养
神经干细胞的培养一、神经干细胞的分离和传代无菌条件下取新生SD大鼠(出生48h内)脑组织，D-Hanks液充分漂洗后，在解剖显微镜下剥离脑膜，准确分离海马，用眼科剪将海马剪碎后，再转移到DMEM/F12(1:1)加B27 和bFGF(20ng/ml)的无血清培养基，吸管吹打机械分离制作单细胞悬液，台盼蓝染色后细胞计数，调整细胞浓度为5×104~5个/ml，置于24孔培养板中培养，每孔加入细胞悬液500μl。
待神经球形成后再次机械分离克隆制作单细胞悬液，仍以5×104个/ml的细胞浓度置于24孔培养板中培养，每孔加入细胞悬液500μl。
此后每7d机械分离克隆传代1次，方法同前。
二、BrdU标记将BrdU溶于无血清培养基，过滤除菌后加入神经球形成后再次机械分离克隆制作的单细胞悬液中(BrdU终浓度为5μmol/L)，培养7d待新的神经球形成后，将神经球转移到预先涂布有多聚赖氨酸的培养板中，贴壁2h行BrdU免疫细胞化学染色。
三、神经干细胞的诱导分化选取部分上述传代后形成的次代神经球种植于预先涂布有多聚赖氨酸的24孔培养板中，并加入有血清培养基(含10％胎牛血清的DMEM/F12)，一部分神经球于贴壁2h后行Nestin免疫细胞化学染色，另一部分神经球继续培养，观察其生长分化情况。
另将一部分次代神经球机械分离制成单细胞悬液后加入有血清培养基贴壁培养，7d后分别行Tuj1 、GFAP 、Galc 免疫细胞化学染色。
四、条件培养液的制备取1g鸡胚的后肢骨骼肌组织，加入9mlD-Hanks液中冰浴匀浆15min，离心获得上清液，过滤除菌后，加两倍体积DMEM/F12培养基制成条件培养液备用。
五、神经干细胞的定向诱导分化将一部分次代神经球机械分离制成单细胞悬液后分别加入条件培养液和有血清培养基(含10％胎牛血清的DMEM/F12)中对照贴壁培养，7d后均行ChA T免疫细胞化学染色。
六、免疫细胞化学染色培养细胞用4％多聚甲醛固定30min后，PBS充分漂洗，然后按ABC法分别行鼠抗Nestin，鼠抗Tuj1，兔抗GFAP，鼠抗Galc，鼠抗Brdu免疫细胞化学染色，用DAB和H2O2作为呈色剂，阳性着色为棕黄色。
原代细胞的培养
原代细胞的培养原代细胞的培养不知道遭到多少研究生及博士生吐槽，其真实情况是，一边在超净工作台上哭，一边手上还在不停地提取原代细胞。
相比较细胞系细胞而言，原代细胞的培养周期长、成本高、摸索困难。
从大鼠的筛选分笼到母鼠受精怀孕，从孕育周期的看护到胎鼠的出生降临，从胎鼠脑组织的提取到神经细胞的培养，到最后的药物对原代细胞的作用机制研究。
这种复杂和辛苦的原代培养过程，其实也是最能反应药物在实验小白鼠上作用机制和效果最真实的反应。
1、大鼠的筛选和分笼首先是一个大笼子里放6只大鼠（5雌性，1雄性），每隔两天喂水和繁殖饲料，一星期给大鼠换一次垫料（给大鼠换垫料是体力活）。
舒适的空间和环境能让大鼠更好地繁殖，产下更多的胎鼠用于科学研究。
2、原代细胞的提取及培养原代细胞的提取一般是将胎鼠先用纯净水冲洗干净，在放进超净工作台处理。
先将胎鼠放入75%酒精消毒1min,再用手术剪刀将胎鼠的脑组织提取出来，放入遇冷的D-Hank's液中。
用手术剪刀将皮层的脑组织剪碎，加入等体积的0.25%胰酶进行消化，置于二氧化碳培养箱37℃培养。
（1）新生大鼠原代海马组织中神经干细胞的培养取新生24h内新生大鼠，75%乙醇浸泡消毒5min，用剪刀将头颅取下，剥离颅骨，暴露皮质下海马组织，于冰上快速取出组织放在遇冷的DMEM/F12或者PBS缓冲液中清洗，吸出置于15mLEP中，加入ACCUTASE1.5-2.0mL置于培养箱中，37℃、5%CO2混匀消化10min，取出混匀吹打组织块，1000r.5min-1离心，加入培养基重悬细胞过200目细胞筛（70μm），置于37℃、5%CO2培养箱中悬浮培养。
通过Nestin染色鉴定星形胶质细胞以确保纯度。
（2）大脑皮层原代星形胶质细胞培养细胞制备和培养从1 日龄新生Sprague-Dawley 大鼠的大脑皮层制备原代星形胶质细胞。
简而言之，分离大脑皮质并用0.25% 胰蛋白酶在37°C下消化15 分钟，然后通过70 μm 细胞过滤器过滤。
神经干细胞的培养鉴定及分化
神经干细胞的培养鉴定及分化The manuscript was revised on the evening of 2021神经干细胞的培养鉴定及分化朱琼1，皋月娟2，高顺记1，陈重1，刘政1，徐亚丽1(1解放军第三军医大学第二附属医院超声科，重庆市 400037；2解放军第三○二医院超声科，北京市 100039)引用本文：朱琼，皋月娟，高顺记，陈重，刘政，徐亚丽. 神经干细胞的培养鉴定及分化[J].中国组织工程研究，2017，21(17):2708-2713.DOI:ORCID: 0000-0002-1810-5009(朱琼)文章快速阅读：文题释义：神经干细胞：是具有自我更新和多向分化潜能的原始细胞，主要存在于侧脑室下区和海马齿状回颗粒下层，不仅能分化为多种类型的神经细胞替代缺失神经组织，同时能产生多种细胞因子，如脑源性神经营养因子、神经生长因子及胶质源性神经营养因子等，并促进突触发生，调节其可塑性，且能重建部分环路和功能，是神经元替代治疗的理想靶细胞。
细胞分化：指同一来源的细胞逐渐由全能到多能，最后到单能，从而产生形态功能不同的细胞群的过程，其本质是基因组在时间和空间上的选择性表达。
如神经干细胞能分化为多种类型神经细胞：星形胶质细胞、小胶质细胞及神经元。
同时该过程受局部微环境调节，多种理化因素都能诱导全能细胞产生分化，如血清诱导神经干细胞分化。
摘要背景：神经干细胞在神经损伤修复和退行性疾病中有广泛的应用前景，体外培养鉴定及促神经元诱导分化是后续研究的基础。
目的：采用悬浮神经球培养法分离培养神经干细胞并对其鉴定，了解生物学特性。
方法：采用悬浮神经球培养法从C57BL/6胎鼠大脑半球分离培养神经干细胞，观察形态特征及超微结构，CCK-8法绘制生长曲线，流式细胞仪检测细胞周期，免疫荧光法检测特异性标志蛋白Nestin的表达；用体积分数为1%和10%的血清诱导分化后，免疫荧光法检测GFAP、βⅢ-tubulin和MBP的表达。
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神经原代干细胞的取材及培养
长期以来，人们认为中枢神经系统成熟的神经元很难或不能在进行分裂和增殖，属于终末分化细胞。
因而中枢神经系统的损伤、变性导致的神经元丢失及缺损难以修复，神经功能的重建被视为几乎不可能。
神经干细胞在体外分离培养和增殖的成功，为中枢神经系统再生和功能重建提供了新的可能途径。
一、神经干细胞
神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新并能提供大量脑组织细胞的细胞群，具有自我更新能力和多向分化潜能，对损伤和疾病具有反应能力。
原代培养的单细胞在24h内自动聚集成团，这是神经干细胞在体外培养过程中的一个重要特征。
神经干细胞具有的特点有：①有增殖能力。
②有自我维持和自我更新能力，对称分裂后形成的两个子细胞为干细胞，不对称分裂后形成的两个子细胞中的一个为干细胞，另一个为祖细胞，祖细胞在特定条件下可分化为多种神经细胞。
③具有多向分化潜能，在不同因子下，可以分化成不同类型的神经细胞，损伤或疾病可以刺激神经干细胞分化。
总之，自我更新能力和多向分化潜能是神经干细胞的两个基本特征。
二、实验步骤：神经干细胞原代取材及培养
1.原代取材
（1）脱颈处死2周龄孕鼠，孕鼠腹部以75%酒精消毒后，手术剪打开腹腔，取出子宫，剪开子宫，取出胎鼠，置于含冰冷PBS液的10cm培养皿中。
（2）将胎鼠断头，用眼科剪分离颅骨及硬脑膜，取出脑组织，在显微镜下充分取出脑膜和血管组织。
（3）将脑组织用PBS清洗三次，剪成1mm3大小的组织块，至于含DMEM/F12的离心管中，吸管轻吹打10次，静置离心管1~2min，取细胞悬液。
重复2-3次。
（4）细胞悬液以700r/min离心6min,吸除上清，获得细胞沉淀。
用(DMEM/F12+1%N2+2%B27+bFGF20mg/ml+EFG20mg/ml)重悬后，过200目筛网，并计数。
（5）按5×105/ml密度接种，置于37℃，5%CO2培养。
2天后隔天换液。
通常一周左右，神经球长出。
2.传代培养
（1）在光镜下观察细胞球中心已出现灰黑色区域时进行传代，将培养基转移至15ml离心中，800r/min离心5min，弃上清。
（2）加入0.125%胰酶+0.02%EDTA消化2-3min，加入胰酶抑制剂终止消化，轻轻吹打神经球至至细胞悬液，800r/min离心5min，弃上清。
（3）加入适量干细胞培养液Neurobasal +1%N2+2%B27+20ng/ml bFGF，20ng/ml EGF（添加谷氨酰胺），调整细胞浓度为5×105/ml，置于37℃，5%CO2继续传代培养。
三、神经干细胞培养影响因素影响
（1）供体年龄
实验研究显示，胚胎鼠大脑皮质中的神经干数量明显高于新生鼠，且胎龄为12~15d左右的鼠胚胎体内的神经干的分化能力最强。
（2）分离方法对神经干细胞纯度及活力的影响
常用的细胞分离方法有机械分离法和酶消化分离法。
机械分离法的缺点是吹力度和次数不易掌控，且机械切割作用会使细胞活性降低；酶消化法缺点是消化的时间不易掌握，并且用于分离神经干细胞的消化酶对细胞具有潜在的损害作用。
（3）接种密度对神经干影响
神经干细胞的适宜接种浓度一般可用1×108/L~1×109/L，接种细胞密度过小，细胞不成球，不利于细胞增殖；接种细胞密度过大，第一次传代后很快出现死亡、特大、散乱、单细胞数迅速增多。
采用半量换液的方法可以最大程度地使细胞生存环境保持稳定,有利于细胞生长（4）传代培养时机的影响
神经干细胞经过原代培养后中，细胞数量大量增殖，必将导致大部分神经干细胞因缺乏营养而死亡，因此及时进行传代是防止其死亡的关键，有文献报道一般选用原代培养5~7 d时进行，既可避免细胞过度增殖而死亡, 又保持细胞增殖的活性。
（5）避免细胞污染。
加强无菌操作意识，做好实验室、实验器械等的消毒工作。
四、注意事项
1.为维持取材过程中的细胞活性，在取材整个过程中应都在冰上进行并且在剥离脑膜和血管组织中要在含有10%FBS高糖培养基中，因为胎鼠神经干代谢旺盛，长时间在无糖环境对神经干造成损伤。
2.在取材过程中，不要取一个皮层，剥离一个脑膜血管，而是快速将所有胎鼠皮层取下来，放到高糖培养基中。
3.剥离脑膜及血管应全部分离干净，否则在制作单细胞悬液时，会被迫加大吹打力量和次数，造成细胞损伤。
4.在培养过程中，为防止细胞贴壁分化，隔天轻轻晃动培养基。