神经干细胞原代取材与培养

神经原代干细胞的取材及培养

长期以来，人们认为中枢神经系统成熟的神经元很难或不能在进行分裂和增殖，属于终末分化细胞。因而中枢神经系统的损伤、变性导致的神经元丢失及缺损难以修复，神经功能的重建被视为几乎不可能。神经干细胞在体外分离培养和增殖的成功，为中枢神经系统再生和功能重建提供了新的可能途径。

一、神经干细胞

神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新并能提供大量脑组织细胞的细胞群，具有自我更新能力和多向分化潜能，对损伤和疾病具有反应能力。原代培养的单细胞在24h内自动聚集成团，这是神经干细胞在体外培养过程中的一个重要特征。

神经干细胞具有的特点有：①有增殖能力。②有自我维持和自我更新能力，对称分裂后形成的两个子细胞为干细胞，不对称分裂后形成的两个子细胞中的一个为干细胞，另一个为祖细胞，祖细胞在特定条件下可分化为多种神经细胞。③具有多向分化潜能，在不同因子下，可以分化成不同类型的神经细胞，损伤或疾病可以刺激神经干细胞分化。总之，自我更新能力和多向分化潜能是神经干细胞的两个基本特征。

二、实验步骤：神经干细胞原代取材及培养

1.原代取材

（1）脱颈处死2周龄孕鼠，孕鼠腹部以75%酒精消毒后，手术剪打开腹腔，取出子宫，剪开子宫，取出胎鼠，置于含冰冷PBS液的10cm培养皿中。

（2）将胎鼠断头，用眼科剪分离颅骨及硬脑膜，取出脑组织，在显微镜下充分取出脑膜和血管组织。

（3）将脑组织用PBS清洗三次，剪成1mm3大小的组织块，至于含DMEM/F12的离心管中，吸管轻吹打10次，静置离心管1~2min，取细胞悬液。重复2-3次。

（4）细胞悬液以700r/min离心6min,吸除上清，获得细胞沉淀。用(DMEM/F12+1%N2+2%B27+bFGF20mg/ml+EFG20mg/ml)重悬后，过200目筛网，并计数。（5）按5×105/ml密度接种，置于37℃，5%CO2培养。2天后隔天换液。通常一周左右，神经球长出。

2.传代培养

（1）在光镜下观察细胞球中心已出现灰黑色区域时进行传代，将培养基转移至15ml离心中，800r/min离心5min，弃上清。

（2）加入0.125%胰酶+0.02%EDTA消化2-3min，加入胰酶抑制剂终止消化，轻轻吹打神经球至至细胞悬液，800r/min离心5min，弃上清。

（3）加入适量干细胞培养液Neurobasal +1%N2+2%B27+20ng/ml bFGF，20ng/ml EGF（添加谷氨酰胺），调整细胞浓度为5×105/ml，置于37℃，5%CO2继续传代培养。

三、神经干细胞培养影响因素影响

（1）供体年龄

实验研究显示，胚胎鼠大脑皮质中的神经干数量明显高于新生鼠，且胎龄为12~15d左右的鼠胚胎体内的神经干的分化能力最强。

（2）分离方法对神经干细胞纯度及活力的影响

常用的细胞分离方法有机械分离法和酶消化分离法。机械分离法的缺点是吹力度和次数不易掌控，且机械切割作用会使细胞活性降低；酶消化法缺点是消化的时间不易掌握，并且用于分离神经干细胞的消化酶对细胞具有潜在的损害作用。

（3）接种密度对神经干影响

神经干细胞的适宜接种浓度一般可用1×108/L~1×109/L，接种细胞密度过小，细胞不成球，不利于细胞增殖；接种细胞密度过大，第一次传代后很快出现死亡、特大、散乱、单细胞数迅速增多。采用半量换液的方法可以最大程度地使细胞生存环境保持稳定,有利于细胞生长（4）传代培养时机的影响

神经干细胞经过原代培养后中，细胞数量大量增殖，必将导致大部分神经干细胞因缺乏营养而死亡，因此及时进行传代是防止其死亡的关键，有文献报道一般选用原代培养5~7 d时进行，既可避免细胞过度增殖而死亡, 又保持细胞增殖的活性。

（5）避免细胞污染。加强无菌操作意识，做好实验室、实验器械等的消毒工作。

四、注意事项

1.为维持取材过程中的细胞活性，在取材整个过程中应都在冰上进行并且在剥离脑膜和血管组织中要在含有10%FBS高糖培养基中，因为胎鼠神经干代谢旺盛，长时间在无糖环境对神经干造成损伤。

2.在取材过程中，不要取一个皮层，剥离一个脑膜血管，而是快速将所有胎鼠皮层取下来，放到高糖培养基中。

3.剥离脑膜及血管应全部分离干净，否则在制作单细胞悬液时，会被迫加大吹打力量和次数，造成细胞损伤。

4.在培养过程中，为防止细胞贴壁分化，隔天轻轻晃动培养基。