细胞传代标准化步骤
vero细胞传代方法
Vero细胞传代方法
一、传代前准备
1.用75%酒精棉球擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
2.正确摆放使用的器械，保证足够的空间，不仅便于操作，而且减少污染。
3.点燃酒精灯，注意火焰不能太小。
4.取出室温保存的培养液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
二、传代步骤：
1.从培养箱内取出细胞，注意取出细胞时不要碰到瓶盖，用酒精棉球擦拭显微
镜的台面，再在镜下观察细胞。
2.打开瓶口：将各个瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
3.倒掉培养瓶中的培养基。
4.加入500ul/小瓶（培养面积___cm2)的胰酶（4度中可存放几个月）,并晃动
瓶子,使液体浸润瓶底。
5.将瓶置入孵箱约2-3分钟。
6.目测观察,见细胞层出现针状小孔，折光增加，弃去胰酶。
7.加入3ml的DMEM培养基稀释,注意更换吸管。
8.吹打15-20次左右,刚开始轻吹5次左右，然后用力吹，使细胞良好地分散
成单个细胞，镜下观察。
孵箱。
9.一传2，作好记号，置37℃，5%CO
2
10.一般2-3天长满。
注意事项：
1.操作过程中不能碰到瓶盖；
2.加培养液前移液管烧后先在培养基内回吸一次；
3.试验结束后用完的移液管要马上用水冲洗干净，再浸泡在洗衣粉溶液内；
4.胰酶消化不开细胞的，可能是胰酶失效或者细胞老化；
5.如果细胞长满不能及时传代就放在室温下第二天传，但是只能放一天；
6.生长液5%-10%血清，维持液2%-5%血清。
小瓶1传2小瓶
中瓶1传4小瓶（或2中瓶）。
细胞传代操作步骤及注意事项
细胞传代操作步骤及注意事项细胞传代培养是细胞培养常规保种方法之一，也是几乎所有细胞生物学实验的基础。
当细胞随着培养时间的延长和细胞不断分裂，细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止，且也会因营养物不足和代谢物积累而不利于细胞生长或发生中毒。
因此，细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释，分种成多瓶，细胞才能继续生长。
这一过程就叫传代。
细胞传代作为一种常规的实验操作，不但可以扩大细胞培养的数量，同时也可以避免细胞因进入平台期乃至衰亡期而大量死亡的窘境。
所以为了让细胞保持在对数生长期，维持细胞旺盛的分裂能力，这时候就需要进行细胞传代。
细胞传代要在严格的无菌条件下进行，并且根据不同细胞采取不同的方法：☑贴壁生长的细胞用消化法传代；☑部分贴壁生长但贴壁不牢固的细胞可以采用直接吹打传代；☑悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心沉淀后再分离传代，或直接用自然沉淀法吸除上清后，再吹打传代。
上次讲了细胞复苏操作，今天来讲讲细胞传代的操作（适用于贴壁细胞的传代培养）！细胞复苏流程图细胞传代流程图01细胞传代前准备➡实验开始前，将15mL离心管、移液管、枪头等实验需要用到的耗材放入无菌超净工作台，紫外线照射30min。
➡将完全培养基、PBS、胰酶预热至37℃。
➡倒置显微镜下观察细胞形态和生长密度，当细胞生长密度达到80%~90%汇合度即可进行传代。
02胰蛋白酶/EDTA消化➡弃去旧培养基，PBS洗去残留的旧培养基，重复洗两次。
注意：贴壁加入到培养皿的边缘，不能直接对着细胞加入PBS，容易把细胞都吹起来。
这一步的目的是为了去掉残余的培养基，残余的培养基会含有血清和一些离子等，不利于接下来的消化。
➡弃去PBS，加入0.25%Trypsin-0.04%EDTA（T25培养瓶加入约1.5mL，T75培养瓶加入约3mL），迅速铺匀，保证充分接触细胞表面（消化时间视具体细胞而定）。
➡显微镜下观察消化情况，约70%~80%细胞收缩变圆后，轻拍培养容器外壁，使细胞脱离培养表面。
细胞传代标准操作流程
细胞传代标准操作流程下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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细胞传代标准操作规程
细胞传代标准操作规程细胞传代培养标准操作规程一、实验名称：细胞传代培养二、实验目的：传代培养细胞株三、背景知识：随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一方面细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。
此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。
这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。
对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。
细胞“一代”指从细胞接种到分离再培养的一段期间，与细胞世代或倍增不同。
在一代中，细胞倍增3～6次。
细胞传代后，一般经过三个阶段：游离期、指数增生期和停止期。
常用细胞分裂指数表示细胞增殖的旺盛程度，即细胞群的分裂相数／100个细胞。
一般细胞分裂指数介于0.2％～0.5％，肿瘤细胞可达3～5％。
细胞接种2～3天分裂增殖旺盛，是活力最好时期，称指数增生期(对数生长期)，适宜进行各种试验。
四、实验原理：细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代(再培养)。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
五、实验材料和药品：（一）实验药品：DMEM培养基，小牛血清，0.25％胰蛋白酶，PBS缓冲液。
（二）实验仪器和材料：CO2培养箱，倒置显微镜，超净台；培养瓶，弯头吸管，废液缸，离心管；75％酒精棉球，酒精灯，培养细胞六、实验步骤：1．入无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手。
2．倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。
将实验所需培养基置37℃下预热。
3．手在进入超净台前应消毒；超净台台面应整洁，用75％酒精溶液擦净。
4．打开超净台的紫外灯照射台面30min左右，打开抽风机，关闭超净台的紫外灯，清洁空气，除去臭氧。
细胞传代、铺板 、冻存、复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
首先，镜下观察细胞密度，90%以上即可传代培养（为了细胞的稳定，距离上 一次传代至少间隔一天。）。
准备工作：无菌枪头、培养瓶、离心管、废液桶等所需物品，培养基、血清、 PBS、胰酶等试剂类，可根据情况，提前放入生物安全柜，进行紫外灭菌；
细胞传代的步骤（贴壁细胞为例）
培养液量 （ml）
0.1 0.2 0.5 1 2 2 5 10 5 15-30
100%细胞量（105） （约） 1 2.5 5 10 25 20 52 137 50 200
培养板需要加入的细胞量
细胞培养板中加入细胞的数量，需要考虑一下几点： 1. 常规实验的设计：转染siRNA（约30%-50%），转染质粒（约70%-
结合镜下观察，调整浓度。 ❖2. 计数细胞：参考前文中各种规格中100%满时细胞的大概数量，再根据实验的
要求，计算加入的细胞的数量。（使用计数板）
细胞计数板的使用
细胞计数板
0.1ul
干净的盖玻片
细胞计数板的使用
10-20 ul 细胞悬液 注意: 避免有气泡！
数上不数下，数左不数右
计算公式： n/4 x104 （个/ml）
4.其他：轻轻移动他人的细胞，轻轻关闭培养箱的门等
细胞冻存
准备工作：FBS，完全培养基，DMSO，或无血清冻存液，冻存管，冻存盒。 常规的细胞传代步骤，至细胞消化后离心完毕，根据细胞的量以及需要冻存的管
数配制冻存液； 冻存液： 10%DMSO+90%FBS/完全培养基（A），或者无血清冻存液（B）。 冻存程序： A ： 1. 使用冻存盒：可直接放入-80℃冰箱，第二天转移入液氮罐中。
把细胞转移到生物安全柜中，吸去培养基，加入无菌PBS（只要没过即 可），轻轻摇动清洗细胞，尽量弃尽PBS。
细胞传代标准化步骤
细胞传代标准化流程：
穿戴好白大褂和手套，用75%酒精擦手；
1、取出细胞，显微镜下观察细胞形态和密度，确定细胞生长状况，是否需要传代或换液；
2、将培养基（如有需要还有血清和大瓶高糖培养基）、PBS、胰酶培养基等预热及超净台消毒
结束后，将试剂及细胞等喷酒精后移入超净台，将废液缸喷足酒精移入超净台，取酒精棉放入超净台；
3、点燃酒精灯，将瓶口拧松，过火消毒；
4、在确定细胞生长状况良好且没有污染的情况下，将培养皿中的培养基取（大培养皿6ml，中
培养皿3ml）至一个新的15ml离心管中；（一个1ml枪头）
5、用适量PBS清洗细胞表面（大皿5ml，中皿3ml），并弃去PBS；（一个5ml枪头）
6、加入适量胰酶消化细胞（大皿1ml，中皿0.5ml），此时可将细胞置于37°C细胞培养箱内消
化；（C2C12用5min，3T3-L1用1.5min），（一个1ml枪头）
7、待消化完全后，用胰酶6倍体积的完全培养基中止消化，并吹打培养皿皿底，将细胞移入离
心管；（一个5ml枪头）
8、1000rpm，5min离心，离心间隙可以准备好传代的细胞培养皿，并加好培养基；
9、弃上清，口擦酒精，烧口；
10、加适量完全培养基吹打混匀细胞(沿壁轻轻吹打24次左右)，按合适比例进行细胞传代，
在盖上标记好细胞名称、代数及传代日期并放入孵箱。
（一个1ml枪头）
11、将所有试管收至冰箱，将废液缸及废液取出，装至一次性PE手套，废液缸喷酒精清洗
12、用酒精棉仔细擦拭操净台表面，检查显微镜、离心机是否关闭，孵箱是否正常；
13、做试验记录，打开超净台和细胞间紫外，15min后关闭。
细胞培养传代详细方法步骤经验总结
传代
镜下观察细胞生长融合达70-80%，准备传代。
常规开紫外照射超净台20分钟，同时把含10%胎牛血清的MEM培养基、0。
25%胰酶、PBS放置37度培养箱中孵育。
20分钟后开始传代。
1先弃掉旧培养液，加PBS洗一次，
2然后加0。
25%胰酶2ml消化（指25乘25cm大小的培养瓶）细胞，镜下观察细胞，细胞突起回缩，细胞变圆，然后将培养瓶放置37度二氧化碳培养箱中孵育3分钟左右（当然时间是随机的，比如：新配的胰酶作用时间短一些，配制时间长的胰酶作用时间会长一些，当然要不断地镜下观察），待细胞大部分消化下来（大部分细胞呈流沙状脱离瓶壁），
3加4ml含10%胎牛血清的MEM培养基终止消化。
反复吹打瓶壁上残留的细胞，并将已消化下来的细胞吹打均匀，然后吸入离心管中1000转离心1分钟，然后弃掉上清,用手指将离心管中的细胞弹打均匀，
4加新培养基，吹打均匀，
5分至3个新的培养瓶中，补足培养液。
将培养瓶平放，小心移入37度二氧化碳培养箱中培养过夜。
6次日观察。
beas-2b细胞传代步骤
beas-2b细胞传代步骤Beas-2B细胞是一种人类正常气道上皮细胞系，广泛应用于气道疾病的研究中。
要进行Beas-2B细胞的传代，需要经过以下步骤。
步骤一：准备工作在进行细胞传代之前，需要准备一些实验室常用的培养基和试剂，如DMEM/F12培养基、胎牛血清、三春霉素等。
步骤二：细胞解冻从液氮罐中取出存放Beas-2B细胞的冻存管，将其迅速放入37℃的水浴中解冻。
解冻后，将细胞转移到离心管中，并通过离心将细胞沉积在管底。
步骤三：细胞培养将培养基预先加热至37℃，并添加适量的胎牛血清。
将解冻后的细胞转移到含有培养基的离心管中，并用移液器轻轻混合。
将混合后的细胞转移到细胞培养瓶中，放入37℃、5%CO2的培养箱中培养。
步骤四：观察细胞增殖培养的前几天，观察细胞的生长情况。
正常情况下，Beas-2B细胞会开始进行增殖，细胞数量逐渐增多，培养瓶内的细胞会呈现出充实的状态。
步骤五：细胞分离当细胞生长到80%至90%的密度时，即细胞达到对数生长期，可以进行细胞分离。
首先，将培养瓶中的培养基倒掉，并用PBS缓冲液冲洗细胞两次，以去除残留的培养基。
然后，加入适量的胰酶-EDTA 消化液，使细胞与其充分接触，并放入37℃的培养箱中进行消化。
随后，用细胞培养液停止消化反应，并用移液器轻轻吹洗，使细胞从底部离析。
步骤六：细胞传代将分离得到的细胞转移到新的细胞培养瓶中，加入适量的培养基，并放入培养箱中继续培养。
细胞传代后，可以观察到细胞数量的进一步增加，培养瓶内的细胞再次呈现出充实的状态。
细胞传代的关键是控制好细胞的分离程度和传代次数。
过度分离会导致细胞死亡，而过多的传代次数则可能引起细胞老化。
因此，在进行细胞分离和传代时，需要根据实际情况来进行调整，以保证细胞的生长和稳定。
总结起来，Beas-2B细胞的传代步骤包括准备工作、细胞解冻、细胞培养、观察细胞增殖、细胞分离和细胞传代。
通过合理的控制和操作，可以成功地进行Beas-2B细胞的传代，并为后续的实验研究提供可靠的细胞资源。
MSC细胞传代培养标准操作流程(2)
间充质干细胞传代培养标准操作流程1 目的和范围：1.1 目的：规范间充质干细胞培养操作流程，保证间充质干细胞传代产品制备的稳定性、均一性。
1.2 范围：适用于本实验室细胞培养技术人员间充质干细胞传代培养的全过程。
2 文件：2.1 间充质干细胞传代培养标准操作流程。
3 记录：3.1 间充质干细胞传代培养记录。
3.2溶液配制记录。
3.3清场记录。
4 试剂与耗材：4.1试剂：75%酒精、生理盐水、DMEM培养基（低糖）、Ultroser G(血清替代物)、干细胞冻存液、0.25%胰蛋白酶（含EDTA）。
4.2 仪器设备：超净工作台、CO2培养箱、倒置显微镜、镊子、1ml移液枪、水浴锅、离心机、细胞计数仪、电动移液枪、试管架。
4.3耗材：50ml离心管、T175培养瓶、T25培养瓶、2ml冻存管、1ml枪头、10ml移液管、封口膜、无菌纱布。
5工作程序：5.1实验前准备：5.1.1 洁净区及超净工作台紫外照射≥30min，风机开启≥5min。
5.1.2 耗材准备：将已灭菌且在有效期内的器械放入传递窗内紫外照射≥30min后，去包布，经酒精擦拭后放入超净工作台备用。
5.1.3 将DMEM培养基、生理盐水、Ultroser G(血清替代物)、0.25%胰蛋白酶提前30min从冰箱取出待用。
5.1.4 将DMEM培养基、生理盐水、Ultroser G(血清替代物)、0.25%胰蛋白酶用酒精擦拭后放入超净工作台，以便恢复至室温。
5.1.5 将50ml离心管、T175培养瓶、T25培养瓶、2ml冻存管、1ml枪头、10ml移液管经酒精擦拭后放入超净工作台备用。
5.2溶液配制：5.2.1配制要求：实验室所有试剂配制应在超净工作台内，按照试剂说明书或按照实验室细胞培养要求配制试剂。
5.2.2Ultroser G(血清替代物)溶液配制：取一瓶Ultroser G(血清替代物)粉剂，用一次性注射器加入20ml超纯水（无菌）使其溶解约10-15min，再用0.2um一次性过滤器过滤备用。
单层培养细胞的一般传代步骤
单层培养细胞的一般传代步骤以单层培养细胞的一般传代步骤为标题，写一篇文章：单层培养细胞是一种常见的细胞培养方法，广泛应用于生物医学研究、药物筛选等领域。
在进行单层培养细胞的传代过程中，需要严格掌握一系列步骤，以确保细胞的健康生长和稳定传代。
下面将介绍一般的单层培养细胞传代步骤。
1. 准备培养基和培养物品在开始传代之前，首先要准备好培养基和培养所需的物品。
常用的培养基有DMEM、RPMI-1640等，可以根据细胞类型的要求选择适当的培养基。
此外，还需要培养皿、培养瓶、离心管、移液管等常规的培养物品。
2. 检查细胞的状态在进行传代之前，需要检查细胞的状态，确保其处于健康的生长状态。
观察细胞的形态、颜色和密度，如果细胞呈现正常的形态，生长密度适中，没有明显的污染或细胞死亡现象，可以进行传代。
3. 贴壁培养皿预处理将需要进行传代的细胞培养皿或培养瓶提前预处理，首先用70%乙醇擦拭外表面，然后放入超净工作台中进行紫外线消毒。
消毒完毕后，将培养皿或培养瓶放入培养箱中预热。
4. 用无菌PBS洗涤细胞将细胞培养皿或培养瓶中的培养基倒掉，用预先加热的无菌PBS （磷酸盐缓冲液）轻轻洗涤细胞两次，使细胞与培养基分离。
5. 加入胰酶或胰酶-EDTA消化细胞将无菌PBS洗涤掉后，加入适量的胰酶（如胰酶-EDTA）消化细胞。
消化时间和消化液的浓度需要根据细胞类型和特性进行调整，一般为数分钟至十几分钟。
消化过程中，应保持细胞在恒温培养箱中。
6. 停止消化并制备细胞悬液消化时间到达后，加入适量的培养基停止消化。
用移液管轻轻吹尘或轻轻拍打培养皿或培养瓶的外壁，使细胞悬液均匀混合。
7. 细胞计数和配种取适量的细胞悬液，利用细胞计数板或细胞计数仪对细胞数目进行计数。
根据细胞密度的要求，将细胞悬液与新的培养基按比例配制，然后将混合好的细胞悬液均匀地加入新的培养皿或培养瓶中。
8. 培养细胞将加入细胞悬液的新培养皿或培养瓶放入恒温培养箱中，继续培养。
细胞传代铺板冻存复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项
细胞传代铺板冻存复苏等细胞培养相关操作步骤和注意事项细胞传代：细胞传代是指将已经培养得到的细胞进行继代，以维持细胞的健康生长和增殖。
具体步骤如下：1.预备培养基和消化液：准备需要的培养基和细胞消化液，将培养基预暖在37摄氏度保温箱中。
2.消化细胞：将已经生长到80-90%的细胞培养皿放到细胞消化液中消化，消化时间根据细胞的种类和生长状态而定。
消化完成后，在显微镜下观察，确保细胞基本脱落。
3.细胞计数与离心：将细胞消化液转移到离心管，进行细胞计数。
根据所需细胞数量计算所需消化液的体积，并用预暖的培养基配置所需的细胞悬液。
离心细胞消化液以去除细胞消化的消化液。
4.铺板：将计算好的细胞悬液转移到铺板中，轻轻摇晃铺板使细胞均匀分布。
放置在培养箱中，培养条件根据细胞类型而定。
注意事项：-消化时间不宜过长，否则细胞会受到过度损伤。
-细胞计数时要使用显微镜和相关计数仪器，确保准确性。
-铺板时要轻轻摇晃铺板以均匀分布细胞，避免气泡产生。
冻存：冻存是将细胞保存在低温条件下，以备日后使用。
具体步骤如下：1.细胞准备：选择处于对称生长期的细胞进行冻存。
对细胞进行消化并离心，将细胞沉淀取出至干燥的离心管。
2.冻存液准备：根据细胞的特性和保存要求选择合适的冻存液，如含有二甲基亚砜（DMSO）和甘油的培养基。
将冻存液预暖。
3.冻存管装填：将已洗净的冻存管放入液氮中预冷，稍微干燥后将细胞沉淀均匀加入冻存管中。
用塑料冻存盖或冷却后的金属冻存夹紧。
4.冷冻：将装有细胞的冻存管放入-80摄氏度的深冷冰箱中，预冻24小时到48小时。
等冷冻固化后将管子迁移到液氮冷冻罐中。
注意事项：-使用合适的冻存液，避免对细胞造成过度伤害。
-在严格消毒和无菌条件下进行冻存操作。
-细胞冷冻时，必须迅速并且均匀降温，以避免冷冻诱导的细胞损伤。
复苏：复苏是指冻存的细胞被解冻、恢复生长和增殖的过程。
具体步骤如下：1.细胞解冻：将冻存的细胞管迅速取出，直接放入37摄氏度的水浴中，轻轻摇动直至融化。
单层培养细胞的一般传代步骤
单层培养细胞的一般传代步骤引言：单层培养细胞是生物学实验中常用的一种方法，用于研究细胞的生理功能、病理机制以及药物筛选等。
传代是维持细胞活性的重要步骤之一。
本文将介绍单层培养细胞的一般传代步骤，帮助读者了解如何正确进行细胞的传代工作。
一、准备工作在进行细胞传代之前，需要做好以下准备工作：1. 清洗培养皿：使用含有酒精的消毒液对培养皿进行清洗，确保无菌。
2. 准备培养基：根据细胞类型的不同，选择适当的培养基，并添加适量的血清和抗生素。
3. 预热培养基：将培养基倒入培养皿中，放入恒温培养箱预热至37摄氏度。
二、收获细胞1. 培养皿检查：检查培养皿中细胞的生长情况，确保细胞达到传代的要求。
2. 倒出培养液：将培养皿中的培养液倒掉，注意避免将细胞吸出。
3. 洗涤细胞：加入足够的无菌生理盐水或PBS缓冲液，轻轻摇晃培养皿，使细胞悬浮于液体中。
4. 吸取细胞：使用吸管或移液器吸取细胞悬浮液，并转移到新的培养皿中。
三、传代细胞1. 稀释细胞：根据细胞密度和传代比例，将细胞悬浮液稀释至适当浓度。
2. 播种细胞：将稀释后的细胞悬浮液均匀地滴在预热的培养基上，确保细胞均匀分布。
3. 培养细胞：将培养皿放入恒温培养箱中，维持适宜的温度、湿度和二氧化碳浓度，细胞继续生长。
4. 观察细胞：每天观察细胞的生长情况，注意观察细胞数量、形态和健康状况。
5. 细胞分裂：当细胞达到合适的密度时，进行下一次传代，重复以上步骤。
四、细胞培养的注意事项1. 操作无菌：在进行细胞培养的每一步骤中，都要保持无菌操作，避免细胞被细菌或真菌污染。
2. 避免细胞过度生长：细胞过度生长会导致细胞凋亡或突变，因此要根据细胞类型和实验需求，合理控制细胞的传代次数。
3. 注意细胞状态：观察细胞形态和生长情况，及时发现细胞异常或污染情况，以便进行相应的处理。
4. 避免细胞冻存：细胞传代过程中，尽量避免频繁的细胞冻存，以免对细胞产生不良影响。
5. 定期更换培养基：培养基中的营养物质和生长因子会逐渐耗尽，因此要定期更换新鲜的培养基，以提供足够的营养物质。
细胞传代培养的步骤
1.准备试剂和培养基：确保DMEM或其他基础培养基、胰酶、完全培养液（含
血清和必要的添加剂）以及PBS等试剂准备就绪。
2.观察细胞状态：在显微镜下检查细胞密度、生长状态和健康状况。
如果细胞
长满至80%~90%，且看起来健康、有活力，则可以进行传代。
3.消化细胞：向培养瓶中加入适量的胰酶溶液，使细胞被充分覆盖。
消化时间
根据细胞类型和培养条件有所不同，通常为1至3分钟。
4.终止消化：加入完全培养液终止消化过程。
这有助于将细胞从消化液中悬浮
起来。
5.离心处理细胞：将细胞悬液在1500至1000 rpm下离心，以收集细胞。
6.调整细胞悬液：弃去上清液，用新鲜培养液重悬细胞。
7.计数和接种细胞：使用细胞计数板对细胞进行计数，并根据所需密度调整细
胞悬液体积。
8.接种细胞：将细胞悬液加入新的培养瓶中，每个瓶中的细胞数量应适当，以
避免过密或过稀。
9.培养和观察：将培养瓶放入培养箱中，定期观察细胞生长和状态，确保它们
健康且生长良好。
细胞传代培养标准操作规程
细胞传代培养（消化法）标准操作规程一、原理细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大,就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
二、材料和试剂1. 无菌磷酸生理缓冲液（PBS）2。
胰酶-EDTA溶液(0。
05%胰酶-0.53mM EDTA-4Na）: 以10ml分装于15 ml 无菌离心管中，保存于–20℃，使用前放在37℃水槽回温。
3. 新鲜培养基4。
无菌吸管/离心管/培养瓶三、操作步骤1。
传代前准备(1）预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。
(2）用75％酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
（3）正确摆放使用的器械：保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。
(4）点燃酒精灯：注意火焰不能太小。
(5)准备好将要使用的消毒后的空培养瓶.（6）取出预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
（7）从培养箱内取出细胞：注意取出细胞时要旋紧瓶盖，用酒精棉球擦拭显微镜的台面，再在镜下观察细胞。
(8）打开瓶口：将各瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒.2。
胰蛋白酶消化（1）加入消化液：小心吸出旧培养液,用PBS清洗（冲洗）,加入适量消化液（胰蛋白酶液)，注意消化液的量以盖住细胞最好，最佳消化温度是37℃。
（2）显微镜下观察细胞：倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度。
（3)吸弃消化液加入培养液：弃去胰蛋白酶液，注意更换吸管，加入新鲜的培养液.3. 吹打分散细胞(1）吹打制悬：用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。
（2)吸细胞悬液入离心管：将细胞悬液吸入10ml离心管中.（3）平衡离心：平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心6—8分钟。
动物细胞传代的主要操作步骤
动物细胞传代的主要操作步骤动物细胞传代是一种将动物细胞无限延续繁殖的技术，它在生物研究和医学应用中具有重要的作用。
通过动物细胞传代技术，可以通过一种或多种手段实现细胞不断增殖，从而获得足够数量的细胞来进行进一步的实验和应用。
动物细胞传代的主要操作步骤包括细胞接种、细胞培养和细胞分裂等，下面将详细介绍这些步骤。
首先是细胞接种。
在进行细胞传代之前，需要将细胞接种到培养皿或培养瓶中。
接种之前，需要准备培养基和细胞悬液。
培养基是一种含有适宜的营养物质和生长因子的液体或凝胶，可以提供细胞生长所需的营养和环境。
细胞悬液则是从细胞培养物中提取的含有细胞的溶液。
在接种过程中，需要注意消毒操作，避免细菌和其他微生物的污染。
接种时，将细胞悬液均匀地分布在培养皿或培养瓶的表面上，然后放入培养箱中进行培养。
接下来是细胞培养。
细胞培养是指将细胞放置在适宜的培养基中，提供适宜的生长条件，使细胞能够不断增殖和生长的过程。
在培养过程中，需要注意培养基的配制和更换、培养箱的温度和湿度控制、培养皿的清洁和消毒等。
培养基的配制需要根据细胞类型的不同进行调整，通常包括无菌的培养基、生长因子和血清等。
培养箱的温度和湿度需要根据细胞类型的要求进行调整，一般维持在37摄氏度和5%CO2的条件下，以提供细胞所需的温度和气体环境。
培养皿的清洁和消毒需要严格控制，以避免细菌和其他微生物的污染。
最后是细胞分裂。
细胞分裂是指细胞增殖的过程，通过细胞在有限的时间内不断分裂，从而形成足够数量的细胞。
细胞分裂的速度和方式取决于细胞类型和培养条件。
一般情况下，细胞分裂可以分为有丝分裂和无丝分裂两种类型。
有丝分裂是指细胞进行有线型染色体分离、细胞质分裂等一系列有丝分裂过程的过程。
无丝分裂是指细胞在没有可见的有线型染色体和细胞质分裂的情况下进行分裂的过程。
动物细胞传代技术的应用广泛，包括细胞生物学研究、药物筛选、疾病模型制备等。
在细胞生物学研究中，动物细胞传代技术可以用来研究细胞的生命周期、分化和转化等现象。
vero细胞传代方法
Vero细胞传代方法
一、传代前准备
1.用75%酒精棉球擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。
2.正确摆放使用的器械，保证足够的空间，不仅便于操作，而且减少污染。
3.点燃酒精灯，注意火焰不能太小。
4.取出室温保存的培养液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。
二、传代步骤：
1.从培养箱内取出细胞，注意取出细胞时不要碰到瓶盖，用酒精棉球擦拭显微
镜的台面，再在镜下观察细胞。
2.打开瓶口：将各个瓶口一一打开，同时要在酒精灯上烧口消毒。
3.倒掉培养瓶中的培养基。
4.加入500ul/小瓶（培养面积___cm2)的胰酶（4度中可存放几个月）,并晃动
瓶子,使液体浸润瓶底。
5.将瓶置入孵箱约2-3分钟。
6.目测观察,见细胞层出现针状小孔，折光增加，弃去胰酶。
7.加入3ml的DMEM培养基稀释,注意更换吸管。
8.吹打15-20次左右,刚开始轻吹5次左右，然后用力吹，使细胞良好地分散
成单个细胞，镜下观察。
孵箱。
9.一传2，作好记号，置37℃，5%CO
2
10.一般2-3天长满。
注意事项：
1.操作过程中不能碰到瓶盖；
2.加培养液前移液管烧后先在培养基内回吸一次；
3.试验结束后用完的移液管要马上用水冲洗干净，再浸泡在洗衣粉溶液内；
4.胰酶消化不开细胞的，可能是胰酶失效或者细胞老化；
5.如果细胞长满不能及时传代就放在室温下第二天传，但是只能放一天；
6.生长液5%-10%血清，维持液2%-5%血清。
小瓶1传2小瓶
中瓶1传4小瓶（或2中瓶）。
细胞传代培养
1细胞传代准备工作1.1细胞传代所需培养液及试剂需提前放置于生物安全柜内预热至室温备用。
1.2细胞传代材料，滴管、移液管、培养器皿、计数板、橡皮乳头。
2细胞传代步骤2.1人无菌室之前用肥皂洗手，用75％酒精擦拭消毒双手。
2.2细胞传代前先在倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数观察。
2.3打开超净工作台的紫外灯照射台面30 min左右，关闭超净工作台的紫外灯，打开抽风机清洁空气，除去臭氧。
2.4超净工作台面应整洁，用75％酒精溶液擦净。
2.5贴壁细胞的传代2.5.1贴壁细胞用滴管或移液管吸去培养器皿中的旧培养液。
2.5.2酌情可用2～3 mL 0.02%EDTA溶液洗去残留的旧培养基。
2.5.3以25ml培养瓶为例，向瓶内加入1ml消化液（胰蛋白酶或与EDTA混合液）轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面。
2.5.4在倒置显微镜下观察，当细胞收回突起变圆或细胞间隙增大后，应立即终至消化。
2.5.5吸除或倒掉消化液，加入少量的含血清的新鲜培养液，终至消化。
2.5.6用弯头滴管，吸取瓶内培养液，反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散，形成细胞悬液。
2.5.7计数，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养液(7～10ml／大瓶，3～5 mL ／小瓶)制成细胞悬液，然后分装到新培养瓶中。
盖上瓶盖，适度拧紧后再稍回转，以利于CO2气体的进入，将培养瓶放回CO2培养箱。
2.6半悬浮细胞及悬浮细胞培养的传代2.6.1半悬浮细胞先用滴管将细胞轻轻吹下来，把细胞悬浮液加入离心管离心（800～1000rpm, 5min），倒掉上清液。
2.6.2把细胞沉淀制成悬液，计数，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养液移到培养器皿中培养。
2.6.3悬浮细胞直接用滴管或移液管吸入离心管离心（800～1000rpm, 5min），倒掉上清液。
2.6.4把细胞沉淀制成悬液，计数，再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养液移到培养器皿中培养。
细胞传代
细胞传代
贴壁细胞的传代：
1、从CO2培养箱中取出细胞，至超净台下。
2、将含有10％---15％血清的培养基用滴管吸去。
3、用PBS缓冲液冲洗细胞两遍，将残留在培养瓶内壁上的培养液洗去。
4、加入2ml左右的胰酶，使贴壁细胞转化为悬浮细胞。
（待加入胰酶后，在显微镜下观察细胞形态。
当大部分细胞从长条行的贴壁细胞转化为圆形的悬浮细胞时。
移至超净台下吸去胰酶。
）
5、用手拍打细胞培养瓶，可观察到细胞从培养瓶内壁上滑下。
6、用新鲜的培养液吹壁，使细胞均匀的分布在培养液中。
7、吹匀后将培养瓶中的培养液吸去一部分（目的是使细胞密度降低。
）再加入一部分新鲜的培养基，使细胞悬液体积大致为5ml。
放回CO2培养箱中培养。
悬浮细胞传代培养：
1、将细胞从CO2培养箱中移至超净台下。
2、吹匀后将培养瓶中的培养液吸去一部分（目的是使细胞密度降低。
）再加入一部分新鲜的培养基，使细胞悬液体积大约为5ml。
放回CO2培养箱中培养。
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细胞传代标准化步骤 Last revised by LE LE in 2021
细胞传代标准化流程：
穿戴好白大褂和手套，用75%酒精擦手；
1、取出细胞，显微镜下观察细胞形态和密度，确定细胞生长状况，是否需要传代或换液；
2、将培养基（如有需要还有血清和大瓶高糖培养基）、PBS、胰酶培养基等预热及超净台消毒
结束后，将试剂及细胞等喷酒精后移入超净台，将废液缸喷足酒精移入超净台，取酒精棉放入超净台；
3、点燃酒精灯，将瓶口拧松，过火消毒；
4、在确定细胞生长状况良好且没有污染的情况下，将培养皿中的培养基取（大培养皿6ml，
中培养皿3ml）至一个新的15ml离心管中；（一个1ml枪头）
5、用适量PBS清洗细胞表面（大皿5ml，中皿3ml），并弃去PBS；（一个5ml枪头）
6、加入适量胰酶消化细胞（大皿1ml，中皿0.5ml），此时可将细胞置于37°C细胞培养箱内
消化；（C2C12用5min，3T3-L1用1.5min），（一个1ml枪头）
7、待消化完全后，用胰酶6倍体积的完全培养基中止消化，并吹打培养皿皿底，将细胞移入
离心管；（一个5ml枪头）
8、1000rpm，5min离心，离心间隙可以准备好传代的细胞培养皿，并加好培养基；
9、弃上清，口擦酒精，烧口；
10、加适量完全培养基吹打混匀细胞(沿壁轻轻吹打24次左右)，按合适比例进行细胞传
代，在盖上标记好细胞名称、代数及传代日期并放入孵箱。
（一个1ml枪头）
11、将所有试管收至冰箱，将废液缸及废液取出，装至一次性PE手套，废液缸喷酒精清洗
12、用酒精棉仔细擦拭操净台表面，检查显微镜、离心机是否关闭，孵箱是否正常；
13、做试验记录，打开超净台和细胞间紫外，15min后关闭。