细胞培养工程 01 绪论

无血清悬浮培养 • 重病毒疫苗 • 组人蛋白质表达 • 翻译后修饰
改进搅拌式反应器设计 解决细胞损伤
重组人蛋白质表达（E.coli） • 胰岛素，生长激素，G-CSF，干扰素，淋巴介素-2 • 高分子量基因可能有问题 • 缺乏翻译后修饰，尤其是二硫键 连接与糖基化
大规模无血清悬浮 • 重组人蛋白质表达 • 病毒疫苗
Basic Bioreactor Design van't Riet & Tramper 1991
Bioprocess Engineering Principles Pauline M. Doran 1995
动物细胞培养 基本技术指南 (第5版) 细胞培养工程 南开大学药学院
动物细胞培养过程 张元兴等 2007
TC - tissue culture CC - cell culture Source: Cell Culture Bioprocessing Engineering, 2012
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细胞培养：医药研发应用
• 现代新型药物开发必须依循生物学原理（生理作用机制） ，并尽可能利用（1）相关药物作用靶点（生物大分子， 目前主要是蛋白质如鸦片受体）或（2）载有靶点的工具 细胞为评估对象，减少药物发现的盲目性，提高药物设计 与筛选效率； • 药物作用的细胞模型（具有商业价值） • 减少实验动物的使用 • 使药物筛选微型化、高通量化、自动化，使信息采集 效率大幅提高
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教学计划
1 绪论 细胞结构与生理 4
2
3 4 5 6 7 8
细胞培养基
细胞培养理论 生物反应器 - 传动现象 生物反应器 - 传质现象 细胞培养模式与调控 生物反应器控制理论 发酵工程（或蛋白质纯化） 考试
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4 4 4 4 4 4
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参考书
Cell Culture Bioprocess Engineering Wei-Shou Hu 2012
细胞培养工程
沈炳谦
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课程安排
• 以蛋白质药物基因表达的细胞培养过程为主线： – 课堂教学 – 考虑安排实验操作训练 • 教材：中文教材更新慢，以课件为主，参考书自选一本。 • 考试成绩： – 考勤：10% – 考试方式（二选一，同学表决）：90% • 开卷考试（以课件内容为主） • 自选相关题目演讲
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生物技术发展简史：近代生物技术
• 疫苗工业 – 1796 年：牛痘疫苗 – 1930 年代： • 小鼠脑组织或鸡胚培养繁殖病毒方法 • 黄热病、流脑、乙脑、森林脑炎和斑疹伤寒疫苗 – 1950 年代： • 离体细胞培养物中繁殖病毒的技术； • 小儿麻痹症、麻疹、腮腺炎等新疫苗。
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骨髓灰质炎疫苗
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生物技术发展简史 ：近代生物技术
• 深层发酵技术的广泛应用 – 抗生素工业：链霉素、金霉素、红霉素等 – 氨基酸发酵工业：上世纪五十年代 – 酶制剂工业 – 环境保护技术 • 主要产品 • 医药药品：抗生素、维生素、甾体激素、氨基酸等； • 食品工业：酶制剂、氨基酸、酵母、啤酒等； • 化学工业：醇类、有机酸、农药等。
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骨髓灰质炎疫苗
• 骨髓灰质炎病毒体外繁殖 • 骨髓灰质炎灭活疫苗（Salk – 1948 年 3 月，Weller 在设 vaccine） 法用人胚胎肺细胞培养制 – 1952 年 备水痘病毒的实验中，将 – Vero cell line（猴肾）培养 多余的几个试管接种了骨 – 接种骨髓灰质炎病毒 髓灰质炎病毒； – 福尔马林灭活 – 前者失败，后者为体外制 – 1955 年正式投入预防使用 备病毒成功先例； – 54 年诺贝尔生理医学奖
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动物细胞培养
• 在体外培养动物细胞的专门技术，即在无菌条件下， （1）从机体中取出组织或细胞（原代细胞），或 （2）利用已经建立的动物细胞系（细胞株）， 在模拟机体内生理状态的基本环境条件下，让细胞在培养容 器（培养皿或生物反应器）中生存、生长和繁殖的方法； • 基础研究：细胞培养在现代生物学研究中广泛使用、不可或 缺的实验技术； • 生物产业：大规模商业化生产。
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细胞培养：基础研究应用
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细胞培养：基础研究应用
• 简化环境条件，排除体内实验复杂影响因素，便于应用生 物、物理、化学等外界因素，探索和揭示细胞生命活动的 基本规律； • 便于应用各种技术和方法，研究和观察细胞结构与功能的 变化； • 通常采用小型培养容器（如培养皿，96 孔板等），培养基 一般含有动物血清（如小牛血清，5-20%），细胞贴壁， 静止培养。
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生物技术发展简史：近代生物技术
• 青霉素生产工艺的技术革命： – 深层发酵技术：5,000 L，搅拌式发酵罐； – 放线菌菌种诱变、选育； – 发酵（培养）过程优化； – 提炼技术及其设备等方面； – 产品产量和质量都大幅度提高，生产效率明显提高， 成本显著下降； – 促进发酵工程技术成为近代生物制药工业的基础技术。
Fra Baidu bibliotek
Enders
Weller
Robbins
Jonas Salk（1914 – 1995）
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主要人类病毒疫苗
Disease
Poliomyelitis Measles Mumps Rubella Smallpox (vaccinia) Smallpox (vaccinia) Yellow fever Influenza Influenza Rabies Adenovirus Japanese B encephalitis Venezuelan equine cephalomyelitis Eastern equine Western equine Russian spring-summer encephalitis
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大规模细胞培养技术
• 目前生物制品商业化生产的最重要工业技术，使众多疾病 得到前所未有的治疗 – 蛋白药物：抗体，血液蛋白，细胞因子，疫苗 – 病毒：疫苗，基因治疗载体 • 细胞治疗与再生医学等新兴治疗直接受益 – 干细胞与组织工程 • 原代细胞体外扩增与分化 • 组织工程部件体外构建 – 细胞治疗： • 免疫治疗等
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后现代药学发展理念
• 生命科学的快速发展，推动了以化学为主体的传统药学研 究模式向以生命科学与化学相结合的新模式转变； • 以分子生物学和细胞生物学为代表的现代生物学基础研究 与生物技术实践虽然只有短短几十年，对新药（包括大分 子药物和细胞）的发现、研究、生产、质量管理和药品临 床应用等方面均产生了重要影响； • 以现代生物技术手段生产的蛋白质多肽类药物在临床上的 成功应用，使医药生物技术成为生物技术领域发展最快、 效益最高、最有发展前景的应用领域； • 动物细胞培养工程是衔接现代生物学理论、新发现与化学 工程原理，并应用于复杂蛋白质药物研发、生产和新型细 胞治疗技术的关键环节和重要技术手段。
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生物技术发展简史：近代生物技术
• 青霉素 – 1928 年 Fleming 发现青霉素，放线菌次级代谢产物； – 1939 年 Florey & Chain：提取纯化、临床试验； – 1941 年，英美联合开发青霉素生产工艺，用于 WWII 伤员感染治疗 • 1943 年，生产 1 公斤 20% 含量青霉素 – 表面培养法 – 80,000 个 1 L 摇瓶 – 劳动力消耗巨大（清洗、装料、灭菌、接种、 培养、出料等操作）
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细胞培养工程
• 细胞培养工程是以动物细胞为对象，研究在体外培养环 境中细胞生长与产物合成的关系（动力学），并利用化 学工程原理指导优化生物反应器的搅拌、通氧、反应器 操作模式以及培养环境控制，关乎产物质量（大分子药 物质量标准远比小分子复杂）、生产效率、生产成本； • 细胞培养工程是应用大规模细胞培养技术从事生产过程 工艺开发和过程放大的重要工程理论。大规模生产过程 （上千升或更大）将细胞至于完全不同的生长环境，细 胞在可控的生长环境中（生物反应器）经历机械搅拌、 通氧并对环境做出生理调整。如何控制细胞生长环境以 满足细胞生理需求、达到最高生产效率，需要化学工程 原理与细胞生理的紧密结合。
Source of vaccine
TC (human diploid cell line, monkey kidney TC (chicken embryo) TC (chicken embryo) TC (duck embryo, rabbit or human diploid) Lymph from calf or sheep (glycerolated, lyophilized) Chorioallantois, TC (lyophilized) TC and eggs (17D strain) Highly purified subunit forms of chicken embryo allantoic fluid (formalinized UV irradiated) CC (MDCK, Vero) Duck embryo, rabbit or human diploid CC (Human diploid cells) Mouse brain (formalinized), CC Guinea pig heart cell culture Chicken embryo cell culture Chicken embryo cell culture Mouse brain (formalinize)
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生物技术发展简史 ：近代生物技术
• 生物分离（下游过程）技术与设备 – 离子交换技术 – 凝胶色谱技术 – 膜分离技术 – 亲和色谱技术 • 1952年获诺贝尔化学奖（分溶层析法）
Archer John Porter Martin
Richard Laurence Millington Synge
• 骨髓灰质炎病毒 – 阳性 mRNA 病毒 – 7,500 核甘酸，编码唯一（壳）蛋白质 – 直径 30 纳米 – 结构最简单病毒 • 骨髓灰质炎（小儿麻痹症） – 病毒从口腔进入，感染肠道黏膜上皮细胞 并繁殖，经血液进入大脑或脊髓 – 感染源为病患粪便和口鼻分泌物 – 儿童较成年人更易感，导致终生残废
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大规模细胞培养技术的发展脉络
生化制药 • 脏器药物提取 • 胰岛素，白蛋白等 组织与细胞培养 • 病毒疫苗 • 细胞天然分泌物 • 有血清贴壁培养 微生物发酵 • 厌氧发酵技术 • WWI，有机溶剂（炸药干燥）
多种反应器设计 无血清培养基研发
深层发酵技术（搅拌，通氧） • WWII，开启抗生素、氨基酸、维 生素、酶等新工业
细胞培养工程 元英进 2012
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• http://www.sigmaaldric h.com/chinamainland/zh/lifescience/cellculture/learningcenter/cell-culturemanual.html
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绪
论
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• 根据中华人民共和国药典，药品分三类 1. 中药 2. 化学药 3. 生物制药（目前主要是蛋白质药物、疫苗等） • 美国 FDA 将药品也分三类为 1. 小分子药物（化学药） 2. 大分子药物（蛋白质药物、疫苗等） 3. 细胞药物（干细胞、组织工程、免疫治疗等） 2. & 3. 皆为生物药
无细胞（Cell free）蛋白质表达 • E.coli 胞浆 • 加入伴侣蛋白可以二硫键连接
生物制药历史回顾
• 生物技术发展简史 • 疫苗 • 生化制药（脏器药物）
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生物技术发展简史：传统生物技术
• 人类传统酿造技术有数千年历史，但直到显微镜的发明， 人类才获知微生物的存在，并进一步获知 “酵素”（酶） 的存在； • 工业微生物：19 世纪末到 20 世纪 30 年代，微生物发酵生 产初级代谢产品，如乳酸、乙醇、丙醇、丁醇、柠檬酸 （WWI 用于炸药干燥）及淀粉酶（蛋白质）等。
Viral condition
Live attenuated, inactivated Live attenuated Live attenuated Live attenuated Live vaccinia Vaccinia Live attenuated Inactivated Attenuated Inactivated Live attenuated Inactivated Live attenuated Inactivated Inactivated Inactivated