基因敲除小鼠的构建
基因敲除模式小鼠的饲养与交配
基因敲除模式小鼠的饲养与交配
首先，基因敲除小鼠的饲养需要提供适当的饲养环境。
小鼠的饲养箱
应设有合适的温度、湿度和光照条件，并保持干净卫生。
此外，提供干燥
而适宜的饮水和高质量的饲料也非常重要。
饲养箱内应使用吸水床或纸巾
等材料作为底材，以提供一定的保暖和舒适性。
其次，基因敲除小鼠的饮食需要特殊考虑。
一些基因敲除小鼠可能会
出现食欲不振或消化问题，因此饲养者应根据实际情况提供适合的饮食。
常用的饮食成分包括高能量饲料、高蛋白饲料等，以满足小鼠的营养需求。
基因敲除小鼠的交配需要注意遵守一定的原则以确保实验的有效性和
数据的可靠性。
一般来说，为了保持基因突变的稳定性，最好采用同基因
型的小鼠进行交配。
如果希望获得特定基因型的后代，可以选择雄性和雌
性基因敲除小鼠进行杂交。
交配时间和交配比例也需要根据具体实验设计
确定，通常可采用经典的一雄多雌的交配模式。
交配后，及时观察并记录
孕鼠的妊娠情况以及出生幼鼠的数量和基因型。
此外，基因敲除小鼠的饲养和交配还需要注意一些伦理和法律规定。
例如，需要合法获得该基因敲除小鼠的授权，并遵守实验动物的使用和保
护规定。
总而言之，基因敲除小鼠的饲养和交配需要提供良好的饲养环境和适
宜的饮食，遵守适当的饲养和交配原则，以及遵守相关的伦理和法律规定。
这些措施的实施将有助于保证实验的有效性和数据的可靠性。
两种基因敲除小鼠的培育
七周重
黑鼠 灰鼠
八周重
黑鼠 灰鼠
九周重
黑鼠 灰鼠
十周重
黑鼠 灰鼠
十一周重
黑鼠 灰鼠
十二周重
黑鼠
3
心电图
4
生理指标
HR
SBP
DBP
MBP
心率
收缩压
舒张压
平均动脉压
C-S
547.1
104.3
67.0
79.2
C-C
448.3
98.4
68.5
78.8
5
项目
血液常规
单位 C-S C-C C57BL/6
WBC
两种基因敲除小鼠的培育
摘要
从美国哈佛大学引进了两种基因敲除小鼠。
这两种品系小鼠的体内分别缺少Cystatin C （胱抑素C ）和 Cathepsin S（组织蛋白 酶 ），简称C-C 和 C-S。在三年的培育过程 中，我们对其生长繁殖、生理生化等一系列 指标作了测定，现将结果汇报如下。
一、材料和方法
#LUC %NEUT %LYMPH
白细胞计数
大未染色细胞计数 中性细胞比率 淋巴细胞比率
10^9/L
10^9/L % %
4.54
0 5.8 .4 76.2
5.89
14.2 81.2
%MONO
%EOS %BASO %LUC RBC HGB HCT MCV MCH MCHC
项目名称 血清总蛋白 血清白蛋白 血清球蛋白
项目代码 TP ALB GLOB
单位 g/L g/L g/L
C-S 50.4 35.1 15.4
C-C 50.8 34.1 16.6
血清白球比
血清丙氨酸氨基转移酶 血清天门冬氨酸氨基转移酶 血清总胆红素 血清碱性磷酸酶 血清甘油三酯 血清总胆固醇 血清肌酸激酶 血清肌酐 尿素 钠
转基因小鼠制备方法
转基因小鼠制备方法一、引言转基因小鼠是指通过基因工程技术将外源基因导入小鼠基因组中，使其表达或缺乏特定基因，从而研究基因功能、疾病模型等方面的动物模型。
转基因小鼠制备方法是实现转基因小鼠研究的重要步骤之一，本文将详细介绍转基因小鼠制备的一般步骤和常用技术。
二、转基因小鼠制备的一般步骤1. 选择目标基因和载体转基因小鼠制备的第一步是选择目标基因和适当的载体。
目标基因可以是外源基因、特定基因的突变体或基因敲除。
载体通常是带有选择标记（如抗生素抗性基因）和目标基因的质粒。
2. DNA构建在DNA构建过程中，首先需要将目标基因和选择标记基因插入到载体的适当位点上。
这可以通过限制性内切酶切割和连接、PCR扩增等方法实现。
构建完成后，需要进行酶切鉴定和测序确认。
3. 体外培养胚胎干细胞（ES细胞）转基因小鼠制备中常用的方法是利用ES细胞技术。
首先，从小鼠胚胎中获得内源性干细胞（ES细胞），并进行体外培养。
然后，将构建好的转基因载体导入ES细胞中，通过抗生素筛选获得带有目标基因的转基因ES细胞克隆。
4. 转基因小鼠制备转基因ES细胞的制备完成后，可以进行转基因小鼠的制备。
这一步骤通常有两种方法：内源性重组和外源性重组。
内源性重组是将转基因ES细胞注射到小鼠早期胚胎中，使其整合到小鼠的生殖细胞中，从而获得转基因小鼠。
外源性重组是将转基因ES细胞直接注射到小鼠的细胞团中，形成转基因胚胎，再将转基因胚胎移植到雌性小鼠子宫中，使其发育成为转基因小鼠。
5. 转基因小鼠鉴定转基因小鼠制备完成后，需要对其进行鉴定。
通常采用PCR、Southern blotting、Western blotting等分子生物学方法，检测转基因小鼠是否成功表达目标基因。
三、常用技术1. CRISPR/Cas9技术CRISPR/Cas9是一种新兴的基因编辑技术，可以实现高效、精确地对基因组进行编辑。
通过CRISPR/Cas9技术，可以直接在小鼠胚胎中进行基因编辑，从而制备转基因小鼠。
《锌指核酸酶介导的小鼠MSTN基因敲除的研究》范文
《锌指核酸酶介导的小鼠MSTN基因敲除的研究》篇一一、引言基因编辑技术近年来取得了重大突破，其中锌指核酸酶（ZFNs）技术因其高精度和灵活性在基因功能研究、疾病模型构建以及基因治疗等领域得到了广泛应用。
肌肉生长抑制素（Muscle Growth Suppressor，MSTN）基因是调控肌肉生长的关键基因，其敲除能够显著提高动物肌肉生长量。
本研究旨在利用锌指核酸酶技术介导小鼠MSTN基因敲除，以期为肌肉生长相关研究提供新的思路和实验依据。
二、材料与方法1. 材料（1）实验动物：选用健康小鼠作为实验对象。
（2）锌指核酸酶：根据MSTN基因序列设计并构建的ZFNs 系统。
（3）实验试剂与仪器：包括DNA提取试剂、PCR仪、显微镜等。
2. 方法（1）构建锌指核酸酶介导的MSTN基因敲除系统：利用CRISPR/Cas9系统相关原理，设计并构建针对MSTN基因的ZFNs系统。
（2）小鼠基因组DNA提取与ZFNs介导的基因敲除：从小鼠组织中提取基因组DNA，利用ZFNs系统对MSTN基因进行敲除。
（3）敲除效果检测：通过PCR、测序等方法检测MSTN基因敲除效果及对小鼠肌肉生长的影响。
三、实验结果1. ZFNs介导的MSTN基因敲除效率高：通过PCR和测序结果分析，发现ZFNs系统成功介导了MSTN基因的敲除，且敲除效率较高。
2. 敲除MSTN基因对小鼠肌肉生长有显著影响：与对照组相比，MSTN基因敲除后的小鼠肌肉生长量显著增加，表明MSTN 基因在肌肉生长过程中发挥了重要的调控作用。
3. 敲除后小鼠未出现明显的不良反应：通过对小鼠的生长、发育、行为等方面进行观察，未发现明显的不良反应或并发症。
四、讨论本研究利用锌指核酸酶技术成功介导了小鼠MSTN基因的敲除，并证实了MSTN基因在肌肉生长过程中的重要调控作用。
此外，本研究还发现，敲除MSTN基因后的小鼠未出现明显的不良反应，表明该技术具有较高的安全性和可行性。
基因敲除动物模型构建步骤
基因敲除动物模型构建步骤
①. 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
②.ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
③.同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。
④.选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率为10-2 ～10-5 ，植物的概率为10-4 ～10-5 。
因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。
目前常用的方法是正负筛选法(PNS法)，标记基因的特异位点表达法以及PCR 法。
其中应用最多的是PNS法。
⑤.表型研究：通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。
⑥.得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。
全基因敲除小鼠基因型鉴定原理及方法
全基因敲除小鼠基因型鉴定原理及方法下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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TALEN-小鼠-基因敲除流程
Step2 构建TALEN打靶载体
通过FastTALETM一步连接法完成TALEN载体的构建
上游引物测序结果比对
下游引物测序结果比对
Step3 细胞水平TALEN活性验证
Day1:小鼠3T3细胞铺板 筛选出一对高活性的 TALEN质粒用于后续实验 Day2：Fugene 共转TALEN 左右臂质粒和EIP质粒 ①PCR产物测序结果 查看套峰
Day3:药物筛选 （puromycin, 1μg/ml）
②PCR产物进行TA克隆 测序，计算突变率
Day6:收集剩余细胞, 抽基因组DNA
PCR靶向序列片段， 扩增出500bp左右
在靶位点上下游设计PCR引物，对打靶后的细胞基因组 DNA进行PCR
PCR-F >200bp TALEN-L >200bp
Step5 胚胎注射mRNA
TALEN左右臂 mRNA按1:1 比例混合
注射至一细胞 期受精卵 细胞质中
37℃培养24h 至二细胞期
移至代孕雌鼠 中，至小鼠 出生（3周）
注射浓度 300-500 ng/ul 注射体积：5-15 pl
Step6 F0代突变体小鼠检测
F0代小鼠剪尾， 抽提基因组DNA T7E1酶切鉴定法： 剪小鼠的尾巴或脚趾 提取基因组DNA PCR靶向基因序列 PCR扩增靶基因位点 PCR产物于94℃失活、50-60℃退火 T7E1酶切鉴定PCR 产物，进行初步筛选
注：图中第一排WT为原始序列，---表示缺失，红色为插入或置换。
Step4 体外转录生成mRNA
TALEN质粒线性化
根据载体所带启动子选择 相应试剂盒进行体外转录
mRNA浓度、纯度检测
原核启动子：sp6或T7 mRNA转录后的大小检测： 若片段大于1.5kb可用琼脂糖凝胶电泳检测；若片段较小，建议用聚 丙烯酰胺凝胶电泳检测。
《锌指核酸酶介导的小鼠MSTN基因敲除的研究》范文
《锌指核酸酶介导的小鼠MSTN基因敲除的研究》篇一一、引言随着基因编辑技术的发展，锌指核酸酶（ZFNs）作为一种重要的基因编辑工具，在生物医学领域得到了广泛的应用。
其中，对小鼠肌肉生长抑制素（Muscle Growth Suppressor，MSTN）基因的敲除研究，对于了解肌肉生长机制、改良动物育种以及疾病治疗等方面具有重要意义。
本文旨在探讨锌指核酸酶介导的小鼠MSTN基因敲除的原理、方法及其实验结果。
二、材料与方法1. 材料本实验所需材料包括小鼠胚胎干细胞、锌指核酸酶、基因敲除载体、相关试剂等。
所有材料均经过严格的质量控制，确保实验的准确性。
2. 方法（1）构建锌指核酸酶介导的MSTN基因敲除载体；（2）将敲除载体转入小鼠胚胎干细胞；（3）筛选出阳性克隆，并进行扩增；（4）将扩增后的胚胎干细胞注入小鼠体内，获得基因敲除小鼠；（5）对基因敲除小鼠进行表型分析、基因型鉴定及功能验证。
三、实验结果1. 基因敲除载体的构建与鉴定通过PCR、酶切及测序等方法，成功构建了锌指核酸酶介导的MSTN基因敲除载体，并经过严格的鉴定，确保其正确性。
2. 胚胎干细胞的转染与筛选将构建好的敲除载体转入小鼠胚胎干细胞，经过筛选，成功获得阳性克隆。
扩增后，得到大量可用于后续实验的胚胎干细胞。
3. 基因敲除小鼠的获得与鉴定将扩增后的胚胎干细胞注入小鼠体内，经过一段时间的生长发育，成功获得基因敲除小鼠。
通过PCR、Southern Blot等方法，对基因敲除小鼠进行基因型鉴定，确认MSTN基因已被成功敲除。
4. 表型分析与功能验证对基因敲除小鼠进行表型分析，发现其肌肉生长明显增强。
通过与野生型小鼠进行比较，进一步验证了MSTN基因在肌肉生长中的重要作用。
此外，还对基因敲除小鼠进行了其他相关功能的验证，为后续研究提供了有力支持。
四、讨论本研究利用锌指核酸酶介导的方法，成功实现了小鼠MSTN 基因的敲除。
通过对基因敲除小鼠的表型分析和功能验证，证实了MSTN基因在肌肉生长中的重要作用。
小鼠基因筛选实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景基因是生物体内控制遗传信息传递的基本单位，基因突变是生物进化的重要驱动力。
为了研究特定基因的功能，我们采用小鼠作为模型生物，通过基因筛选实验，旨在鉴定和验证与特定表型相关的基因。
二、实验目的1. 构建小鼠基因文库。
2. 通过分子生物学技术筛选与特定表型相关的基因。
3. 验证筛选得到的基因的功能。
三、实验材料1. 实验动物：C57BL/6小鼠。
2. 工具酶：限制性内切酶、DNA连接酶、Taq DNA聚合酶等。
3. 试剂：PCR引物、DNA标记物、DNA探针、克隆载体等。
4. 仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、显微镜等。
四、实验方法1. 构建小鼠基因文库（1）提取小鼠基因组DNA。
（2）使用限制性内切酶切割基因组DNA，获得特定长度的DNA片段。
（3）将切割后的DNA片段连接到克隆载体上，构建小鼠基因文库。
2. 基因筛选（1）根据已知表型，设计特异性引物，用于PCR扩增目的基因。
（2）对小鼠基因文库进行PCR扩增，筛选出与特定表型相关的基因片段。
（3）将筛选得到的基因片段进行测序，确定其序列。
3. 基因功能验证（1）将筛选得到的基因片段克隆到表达载体中，构建重组表达载体。
（2）将重组表达载体转化大肠杆菌，获得表达目的蛋白的菌株。
（3）通过免疫印迹、免疫荧光等技术检测目的蛋白的表达和活性。
五、实验结果1. 成功构建了小鼠基因文库，文库容量达到预期目标。
2. 通过PCR扩增，成功筛选出与特定表型相关的基因片段。
3. 对筛选得到的基因片段进行测序，确定其序列。
4. 通过基因功能验证，成功表达了目的蛋白，并验证了其功能。
六、实验讨论1. 基因筛选实验中，PCR扩增和DNA测序是关键步骤，需要严格控制实验条件，确保结果的准确性。
2. 在基因功能验证过程中，需要选择合适的表达系统和检测方法，以确保目的蛋白的正确表达和活性。
3. 本研究筛选得到的基因可能与特定表型相关，但其具体功能还需进一步研究。
《锌指核酸酶介导的小鼠MSTN基因敲除的研究》范文
《锌指核酸酶介导的小鼠MSTN基因敲除的研究》篇一一、引言随着基因编辑技术的发展，锌指核酸酶（ZFNs）作为一种精准的基因编辑工具，在基因敲除、基因修复等研究领域得到了广泛应用。
肌腱生长因子（MSTN）是一种重要的负性调节因子，对肌肉发育、细胞生长等方面起着重要的调控作用。
本研究以小鼠为研究对象，采用锌指核酸酶技术，成功敲除了小鼠MSTN基因，并对其进行了深入的研究。
二、材料与方法1. 材料本实验选用C57BL/6小鼠作为实验对象，实验所使用的锌指核酸酶由本实验室构建。
2. 方法（1）构建锌指核酸酶表达载体：根据小鼠MSTN基因序列设计锌指核酸酶，并构建表达载体。
（2）显微注射：将锌指核酸酶表达载体显微注射到小鼠受精卵中，使锌指核酸酶在受精卵中表达。
（3）筛选阳性小鼠：通过PCR等方法筛选出MSTN基因被成功敲除的小鼠。
（4）实验分组与处理：将小鼠分为实验组和对照组，实验组进行MSTN基因敲除处理，对照组不进行处理。
（5）样本采集与检测：分别采集实验组和对照组小鼠的肌肉、血液等样本，进行相关指标的检测和分析。
三、实验结果1. 锌指核酸酶的表达与活性检测通过PCR等方法检测锌指核酸酶的表达情况，结果表明锌指核酸酶表达成功且具有较高的活性。
通过显微注射将锌指核酸酶导入小鼠受精卵中，锌指核酸酶能够在受精卵中高效地结合到MSTN基因上，并引起基因敲除。
2. MSTN基因敲除效率及效果分析通过PCR等方法筛选出MSTN基因被成功敲除的小鼠，结果表明MSTN基因敲除效率较高，且敲除效果稳定可靠。
通过对实验组和对照组小鼠的肌肉、血液等样本进行检测和分析，发现实验组小鼠的肌肉量和肌肉生长速度均显著高于对照组小鼠。
此外，实验组小鼠的体重也明显增加。
3. 敲除MSTN基因对小鼠其他生理指标的影响分析除了肌肉量和体重外，我们还对实验组和对照组小鼠的其他生理指标进行了检测和分析。
结果表明，敲除MSTN基因对小鼠的生长发育、免疫功能等方面没有明显的不良影响。
cre-loxp基因敲除系统
背景介绍
1981 年Evans 等首次在体 外分离和培养ES，成功建 立了小鼠胚胎干细胞系
1985 年Smithies最早在哺乳动 物细胞中发现并实现了同源重 组
同源重组
Homologus Recombination
同源重组是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同 一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合 。在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片 段设计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞 后外源的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组
三、Cre工具鼠的构建
DNA显微原核注射，是指将外源DNA通 过显微注射的方法注射到受精卵的原 核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的 基因组中，并稳定遗传给后代。
诱导性组织特异性Cre工具鼠的载体构建
MHC (cardiac-specific a-myosin heavy chain) Mer (mutated murine estrogen receptor ligand-binding domain amino
MerCreMer融合蛋白
该系统将雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)的 配体结合区(ligand-binding domain,LBD)和Cre 重组酶进行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌 合重组酶的表达被置于特异启动子的调节之下 ，从而使其在特定组织和器官或者特定发育阶 段产生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥 Cre重组酶的活性，因为雌激素受体结合区的 存在使其不能进入核内与loxP位点相结合。只 有加入雌激素后才能使其进入核内发挥作用。
基因敲除机理 （续）
Offspring: 25% homozygous knockout after 2 generation
小鼠大脑基因实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景随着神经科学研究的深入，理解大脑的基因调控机制对于揭示神经疾病的发生机理和开发新的治疗方法具有重要意义。
本研究旨在通过基因编辑技术，探究特定基因在小鼠大脑发育和功能中的作用，为相关疾病的预防和治疗提供新的思路。
二、实验目的1. 利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除小鼠大脑中特定基因。
2. 观察基因敲除对小鼠大脑发育、行为和认知功能的影响。
3. 分析敲除基因对小鼠大脑中相关通路和基因表达的影响。
三、实验材料与方法1. 实验材料- 小鼠胚胎干细胞（ES细胞）- CRISPR/Cas9系统- 实验小鼠（C57BL/6小鼠）- 实验试剂：DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶、PCR引物等2. 实验方法（1）基因编辑1. 设计靶向特定基因的CRISPR/Cas9系统，包括sgRNA和Cas9蛋白。
2. 将sgRNA和Cas9蛋白导入小鼠ES细胞，进行基因编辑。
3. 对编辑后的ES细胞进行筛选，获得基因敲除的细胞系。
4. 将基因敲除的细胞系注射到C57BL/6小鼠的受精卵中，获得基因敲除的小鼠。
（2）小鼠行为和认知功能测试1. 观察基因敲除小鼠的生长发育、行为和运动能力。
2. 对小鼠进行认知功能测试，包括Morris水迷宫实验、Y迷宫实验等。
（3）基因表达分析1. 提取小鼠大脑样本，进行RNA提取和cDNA合成。
2. 利用PCR、RT-qPCR等方法检测敲除基因的表达水平。
3. 对小鼠大脑样本进行蛋白质组学分析，检测相关蛋白的表达水平。
四、实验结果1. 基因敲除成功敲除了小鼠大脑中特定基因，并通过PCR、RT-qPCR等方法验证了基因敲除的效果。
2. 小鼠行为和认知功能与野生型小鼠相比，基因敲除小鼠在Morris水迷宫实验中表现出明显的空间学习障碍，提示该基因可能参与小鼠的认知功能。
3. 基因表达分析敲除基因后，小鼠大脑中相关通路和基因表达发生了显著变化。
具体表现为：1. 神经递质合成酶的表达水平降低。
条件性敲除小鼠
条件性敲除小鼠定义：条件性基因敲除小鼠（也叫Flox小鼠）是指在目的基因中含有成对的loxp位点的小鼠，与Cre工具小鼠交配后可在特定的组织或细胞中敲除目的基因。
CKO如何实现？重组酶系统（如：Cre-loxP）介导的位点特异性重组技术。
Cre是重组酶（38kDa），可识别34bp 长的DNA 序列loxP。
loxP 两侧各13bp 构成回文结构，中间8bp为非回文结构，因此loxp具有方向性。
（当DNA 分子上存在两个同向loxP 序列时，Cre可将两个loxP 序列之间的DNA 片段切出并环化，同时将loxP 两侧的序列进行连接；当DNA 分子上存在两个方向相反的loxP 序列时，Cre 可导致loxP 之间的序列发生反转。
）CKO敲除的是什么？条件性基因敲除的靶基因中必须带有可以被Cre 重组酶识别的loxP 序列，这种基因称为floxed gene。
带有floxed 靶基因的小鼠称为flox 小鼠。
在这种小鼠中，通常采用DNA 同源重组方法，在拟敲除基因片段的两侧分别放置一个同向的loxP 位点。
loxP 位点的存在应不影响该基因的功能，故选择对照为flox/flox小鼠CKO敲除何时何地发生？除了flox 小鼠以外，重组酶系统介导的条件性基因敲除还需要另一类重要的基因工程小鼠的参与——Cre 工具鼠。
Cre 工具鼠中，将Cre 重组酶的编码序列置于特定的基因启动子下，Cre 的表达特性决定了靶基因何时何地发生敲除。
Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的敲除就发生在哪种组织细胞；Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率；使用诱导型Cre 重组酶可以通过给予诱导剂，决定在特定的发育时期或疾病发生阶段，定时地进行基因敲除。
（范衡宇老师课件）实验时，将flox 小鼠和Cre 工具鼠进行交配，最后获得flox 纯合且Cre 杂合的小鼠。
在这类小鼠中，凡是表达Cre 的细胞，两个loxP 之间的序列被切除，从而实现组织特异性基因敲除。
基因敲除小鼠的方法
基因敲除小鼠的方法
1. CRISPR/Cas9基因编辑技术，CRISPR/Cas9技术是一种高效的基因编辑工具，可以用来精确地敲除小鼠基因。
首先，科学家设计合成一段RNA序列，使其与目标基因序列相匹配，然后将这段RNA和Cas9蛋白复合体导入小鼠胚胎内。
复合体会通过识别并切割目标基因，导致基因敲除。
2. 胚胎干细胞技术，另一种常见的基因敲除小鼠方法是利用胚胎干细胞。
科学家可以将设计好的基因敲除载体导入小鼠胚胎干细胞中，使其发生基因敲除。
然后，这些修改过的干细胞可以被植入小鼠胚胎内，从而产生基因敲除小鼠。
3. 遗传改造小鼠技术，除了CRISPR/Cas9和胚胎干细胞技术，科学家还可以利用遗传改造技术来实现基因敲除。
这种方法涉及到选择性育种和杂交，通过选择性地交配和繁殖，最终得到具有特定基因敲除的小鼠品系。
总的来说，基因敲除小鼠的方法主要包括CRISPR/Cas9基因编辑技术、胚胎干细胞技术和遗传改造小鼠技术。
这些方法都是在实验室条件下进行的，需要经过严格的实验设计和操作流程，以确保
基因敲除的准确性和有效性。
同时，这些方法也为科学家提供了强大的工具，用于研究基因在生物体内的功能和作用机制。
ApoE基因敲除小鼠模型特点及原理介绍
ApoE基因敲除小鼠模型特点及原理介绍
展开全文
ApoE小鼠品系名：C57BL/6
ApoE小鼠毛色：黑色
ApoE小鼠基因名：Apoe， apolipoprotein E
ApoE小鼠染色体：7号
ApoE小鼠打靶技术：同源重组
ApoE小鼠基因型：ApoE（-/-）
ApoE小鼠表型特征：ApoE基因剔除小鼠模型表现出异常高血脂症状，随着月龄增加将出现大量类似动脉粥样硬化前期的损伤。
ApoE基因敲除小鼠简介:
ApoE基因敲除小鼠是通过同源重组技术制备的具有3号外显子纯合缺失的小鼠模型。
该小鼠模型表现出异常高血脂症状，在3月龄时即出现动脉脂肪堆积。
随着月龄增加将出现大量类似动脉粥样硬化前期的损伤。
17月龄时小鼠脑内将出现脂瘤性纤维瘤，同时还有脂质小球和泡沫细胞。
最新研究还发现该基因剔除小鼠的学习记忆能力出现障碍（赛业可提供ApoE小鼠）。
ApoE基因是目前国内外研究的热点之一，ApoE与CHD、高脂血症、脑梗塞、AD及慢性乙型肝炎等疾病相关。
ApoE基因敲除小鼠是研究该基因与多种相关疾病的重要模型。
基因敲除小鼠的实验流程
基因敲除小鼠的实验流程1.设计基因敲除小鼠实验方案在开始实验之前，需要明确研究目的，确定需要敲除的基因，并设计相应的实验方案。
一般可以使用 CRISPR-Cas9 系统来实现基因敲除，在设计基因敲除实验方案时，需要选择合适的 sgRNA 序列，以及设计恰当的引物用于检测突变。
2.获得基因敲除小鼠的胚胎干细胞为了实现基因敲除，需要获得基因敲除小鼠的胚胎干细胞。
一种常用的方法是利用胚胎干细胞对外源DNA的高度易感性，将敲除基因的质粒DNA转染到小鼠胚胎干细胞中。
3.筛选敲除基因的胚胎干细胞株系将转染了敲除基因的胚胎干细胞以悬浮培养的方式进行培养，培养一段时间后，利用一定的筛选条件来筛选出含有敲除基因的胚胎干细胞株系。
筛选条件可包括对抗生素的使用或筛选标记基因的表达。
4.制备敲除基因小鼠的固定胚胎干细胞系通过体外培养，将敲除基因的胚胎干细胞系定植在培养皿上，培养数代以后，将其冻存，以备后续的实验使用。
5.实施敲除基因小鼠的胚胎干细胞基因改造将固定的胚胎干细胞系重新激活，转染 Cas9 和 sgRNA，利用CRISPR-Cas9 系统使这些细胞具有敲除基因的突变。
6.识别敲除基因的胚胎干细胞阳性克隆株对转染了 Cas9 和 sgRNA 的胚胎干细胞进行筛选，通过 PCR、Western blot、Southern blot等技术方法识别出敲除了目标基因的阳性克隆株。
7.将敲除基因的胚胎干细胞注入小鼠的早期胚胎取出已受精的小鼠卵母细胞，利用显微操作将敲除基因的胚胎干细胞注入到小鼠的早期胚胎中。
利用体外受精或者通过体内或体外的胚胎移植方式将基因敲除干细胞注入受体小鼠。
8.制备基因敲除小鼠的嵌合小鼠将已注入敲除基因的胚胎干细胞的受体小鼠进行嵌合以产生基因敲除小鼠。
嵌合可以通过体内或体外的胚胎移植方式进行。
9.筛选识别基因敲除小鼠对产生的嵌合小鼠进行筛选，确认敲除基因是否成功。
可以通过 PCR、Western blot、Southern blot等技术方法对小鼠体细胞或组织进行分析。
基因敲除鼠的构建方法
基因敲除鼠的构建方法
基因敲除鼠是一种重要的遗传工具，它们能够帮助科学家们研究基因在生物学过程中的作用。
基因敲除鼠构建方法主要包括以下步骤： 1. 设计基因敲除鼠的目标基因序列，选择合适的外显子或内含
子进行靶向敲除。
2. 制备CRISPR/Cas9系统，包括Cas9蛋白、sgRNA以及质粒载体等。
3. 将CRISPR/Cas9系统导入到鼠胚胎干细胞中，使用
CRISPR/Cas9系统导致目标基因的敲除。
4. 鉴定敲除鼠胚胎干细胞中基因敲除的效率，通过PCR、Western blot等方法验证敲除效果。
5. 将基因敲除鼠胚胎干细胞注入到新生小鼠的内脏器官进行移植，培养出基因敲除小鼠。
基因敲除鼠的构建方法是一项复杂的工程，需要科学家们对基因编辑技术的熟练掌握和实验经验。
通过基因敲除鼠的研究，科学家们能够更加深入地了解基因在生物体内的作用，为疾病治疗和新药研发提供更为有效的手段。
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髓系特异性Spi1基因敲除小鼠的构建和基因鉴定
髓系特异性Spi1基因敲除小鼠的构建和基因鉴定吴旭铭;王卉卉;朱向玲;周园园;王安琪;张慧茹;刘崇;涂佳杰【期刊名称】《安徽医科大学学报》【年(卷),期】2024(59)3【摘要】目的构建髓系特异性Spi1基因敲除小鼠并分析其基因型,为疾病病理机制及药物靶点研究提供动物模型基础。
方法根据CRISPR/Cas9技术原理和Cre/LoxP系统,设计并构建sgRNA和Donor载体,以第2号外显子(Exon 2)所在的转录本为敲除区域,在Exon 2两侧各放置同向Loxp元件;将Cas9蛋白、sgRNA和Donor载体混合显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中,移植受精卵到假孕的C57BL/6J母鼠的子宫中,19~20 d后获得F0代。
将阳性F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配,得到稳定的F1代Spi1^(flox/+)小鼠。
F1代Spi1^(flox/+)小鼠雌雄自交得到Spi1^(flox/flox)小鼠。
Spi1^(flox/flox)与Lyz2-Cre^(+)小鼠交配得到Spi1^(flox/+)/Lyz2-Cre^(+)小鼠,再将其与Spi1^(flox/flox)交配,得到的Spi1^(flox/flox)/Lyz2-Cre^(+)小鼠为髓系特异性Spi1基因敲除(KO)小鼠;Spi1^(flox/flox)/Lyz2-Cre^(-)小鼠作为野生型(WT)小鼠。
提取WT和KO小鼠DNA,PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型;Western blot检测WT和KO小鼠免疫细胞中脾病灶形成病毒前病毒整合癌基因-1/富含嘌呤盒1(PU.1)表达。
结果PCR鉴定结果显示,采用flox引物鉴定时仅扩增出220 bp条带的小鼠,即基因型为Spi1^(flox/flox)纯合子,采用Lyz2-Cre引物鉴定时扩增出700 bp的小鼠,基因型为Lyz2-Cre^(+);Western blot结果显示,与WT组比较,KO组小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)和腹腔原位巨噬细胞(PM)中的PU.1不表达(P<0.01);T细胞中KO小鼠PU.1表达水平与WT小鼠差异无统计学意义;PCR和Western blot结果均表明髓系特异性Spi1 KO小鼠构建成功。
基因敲除小鼠原理
基因敲除小鼠原理基因敲除是一种常用的遗传工程技术，它通过人为地改变生物体的基因组，使得某个特定基因在生物体中失去功能。
基因敲除技术在动物模型研究中得到了广泛的应用，特别是在小鼠模型的构建中发挥着重要作用。
下面将介绍基因敲除小鼠的原理及其应用。
基因敲除小鼠原理。
基因敲除小鼠是指通过基因工程技术，将小鼠的某个特定基因进行改变，使得该基因在小鼠体内失去功能。
基因敲除小鼠的构建通常分为以下几个步骤：1. 选择目标基因，首先需要选择需要敲除的目标基因，通常选择与某种疾病或生理过程相关的基因作为目标。
2. 构建敲除载体，将目标基因的敲除载体导入到小鼠的胚胎干细胞中，使得目标基因在胚胎干细胞中发生敲除。
3. 胚胎干细胞筛选，经过敲除载体导入后，对胚胎干细胞进行筛选，筛选出发生了基因敲除的干细胞。
4. 小鼠胚胎的移植，将发生了基因敲除的胚胎干细胞移植到受精小鼠卵母细胞内，通过体外培育和移植到母体小鼠子宫内，使得基因敲除小鼠的胚胎发育成熟。
5. 基因敲除小鼠的鉴定，对出生的小鼠进行基因型分析，确认是否成功构建了基因敲除小鼠模型。
基因敲除小鼠的应用。
基因敲除小鼠模型在生物医学研究中有着广泛的应用，主要包括以下几个方面：1. 功能基因研究，通过敲除特定基因，可以研究该基因在生物体内的功能及其对生物体生理过程的影响，为相关疾病的研究提供重要的实验模型。
2. 疾病模型构建，基因敲除小鼠模型可用于构建各种疾病模型，如肿瘤模型、免疫缺陷病模型等，用于研究疾病的发病机制及寻找治疗方法。
3. 药物筛选，基因敲除小鼠模型可用于药物的筛选和评价，通过观察敲除某个基因后对药物疗效的影响，为新药的研发提供重要参考。
4. 基因治疗研究，基因敲除小鼠模型可用于基因治疗的研究，通过敲除某个致病基因或导入正常基因，探索基因治疗的可行性及疗效。
总结。
基因敲除小鼠模型是一种重要的生物医学研究工具，通过对特定基因的敲除，可以研究该基因在生物体内的功能及其对生理过程的影响，为相关疾病的研究提供重要的实验模型。