分子荧光分析法

作用：鉴别荧光物质； 选择适当的荧光测定波长。
激发光谱和荧光光谱类似“镜像对称”关系
荧 光 强 度
300nm
400nm
500nm
硫酸奎宁的激发光谱（虚线）及荧光光谱（实线）
3 溶液荧光光谱的特征
A 斯托克斯位移：Stokes shift
1852年，Stokes首先观察到：溶液荧光光谱中， 荧光波长总是大于激发光波长。
V0
V
V
3
2
V1
T1
V0
S0
V
V
3
2
V1
V0
荧光与磷光产生示意图
发射荧光过程约为 109，1返07回S基态 时，可停留在任一振动能级上，因此，可得几
个非常靠近的荧光峰谱线。
有关概念： ① 振动弛豫：vbrational relexation
物质分子被激发后，其电子可能跃迁到第一电 子激发态或更高的电子激发态的几个振动能级 上，在溶液中，激发态分子通过与溶剂分子碰 撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电子 则返回到同一电子激发态的最低振动能级上， 此过程称为～。
② 内转换：internal conversion
当两电子激发态之间能量相差较小以致其振动 能级有重叠时，受激分子将多余的能量转变为 热能而跃迁至较低电子能级。
③ 荧光发射：
无论分子最初处于哪一个激发单线态，通过内 转换及振动弛豫，均可返回至第一激发单线态 的最低振动能级上，然后再以辐射形式发射光 量子而返回到基态的任一振动能级上，所发射 的光量子即
称荧光。
荧光的波长总比激发光的波长要长?
④ 外转换：external conversion 如果分子在溶液中被激发，激发态分子与溶 剂分子及其它溶质分子之间相互碰撞而失去能 量，以热能形式放出，此过程称为外转换。 通常发生在第一激发单线态或第一激发三线 态的最低振动能级向基态转换的过程中，会降 低荧光或磷光强度。
原因：内转换、振动驰豫达到第一激发单线态 的最低振动能级；激发态分子与溶剂相互作 用；激发态分子返回到基态的各不同振动能 级，进一步损失能量。
B 荧光光谱的形状与激发波长无关：荧光发射 通常发生于第一电子激发态的最低振动能级； 而与激发到哪一个电子激发态无关。
四 分子结构与荧光的关系
物质能否产生荧光，主要取决于物质结构及 环境条件。 1 物质产生荧光的必要条件 ① 物质分子必须有强的紫外-可见吸收。 ② 物质必须具有较高的荧光效率。 荧光效率（fluorescence efficiency）又称荧光 量子产率（fluorescence quantum yield）
迁，π电子共轭程度越大，荧光强度越大，荧 光波长长移。
例：苯、萘、蒽的荧光强度比较。
ex205nm 286nm 356nm
em
278nm 0.11
321nm 404nm
0.29
0.36
B 分子的刚性和共平面性
刚性：指分子自由旋转程度的大小，若分子不 能旋转，则为刚性分子。
共平面性:指共扼π电子的共平面程度。在长共 轭分子中，刚性和共平面性越大，荧光效率 越大，荧光波长长移。
除电子自旋方向改变外，能量亦不相同。
E
基态 激发单线态 激发三线态
3 荧光的产生
荧光的产生过程：
基态吸收辐射 激发单线态 内转换、振动驰豫 第一激发单线态的最低振动能级 发射荧光 基态的各振动能级外转换、振动驰豫 基态的最低振动能级
S
2
V
V
3
2
V1
V0
内转换
S
1
V
V
3
2
体系间跨越
V1
第三类基团：-R、-SO3H等 对荧光的影响不 明显。
五 影响荧光强度的外部因素
1 温度：
温度越高，荧光效率及荧光强度越低。因为 温度升高，分子运动速度加快，分子间碰撞 几率增加，使无辐射跃迁增加，降低了荧光 效率。
2 溶剂：
① 一般情况下，荧光波长随溶剂极性增大而长 移，强度也有所增加。
② 荧光强度随溶剂粘度的减小而减弱。溶剂粘 度减小时，可增加分子间碰撞机会，使无辐 射跃迁增加而使荧光减弱。
发射荧光的光子数
吸收激发光的光子数
=任0.何65物，质蒽的在乙在醇0中～1之=0间.3，0，如菲荧在光乙素醇在中水中 =0.10。
荧光效率低的物质虽有较强的紫外吸收，但 所吸收的能量都以无辐射跃迁形式释放，所 以没有荧光发射。
2 与分子结构的关系
A 长共轭结构：
芳香环或杂环具有长共轭的跃π π*跃
外转换、体系间跨越。
三、激发光谱与发射光谱
1激发光谱：excitaton spectrum
不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长 荧光的相对效率。即固定荧光波长，以荧光 强度（F）为纵坐标，激发波长（λex）为横 坐标作图可得。
2 发射光谱：fluorescence spectrum
即荧光光谱，使激发光的波长和强度保持不 变，通过发射单色器扫描以检测各种波长下 相应的荧光强度，记录荧光强度（F）对发射 波长（λem）的关系曲线。
联苯
c
H 2芴
0.2
1.0
C 取代基：
增加分子的π电子共轭程度的取代基,增强荧 光，并使波长长移； 减弱分子的π电子共轭程度的取代基，使荧光 减弱或熄灭。
属第于一给类电基子团基：团-N，H2增、强-O荧H、光-。OCH3、-CN等，
第二类基团：-COOH、-NO2、-NO、-Cl -Br、 - I等Байду номын сангаас减弱分子的π电子共轭性，使荧光减弱 甚至熄灭。
⑤ 体系间跨越：intersystem crossing
指处于激发态分子的电子发生自旋反转而使 分子的多重性发生变化的过程。如果第一激 发单线态的最低振动能级同激发三线态的最 高振动能级重叠，那么激发态分子的电子发 生自旋反转，分子由激发单线态跨越到激发 三线态，荧光强度减弱或熄灭。
含有重原子如Br2、I2等的分子，体系间跨 越最常见，因为电子的自旋与轨道运动之间 的相互作用较大，有利于电子自反转的发生。 溶液中存在的氧分子等顺磁性物质也容易发 生体系间跨越，从而使荧光减弱。
⑥ 磷光发射： 激发单线态最低振动能级体系间跨越激发
三线态高振动能级 振动驰豫 激发三线态 最低振动能级（存活） 发射磷光 基态 各振动能级振动驰豫、外转换基态最低振动能级
与荧光比较：过程比荧光长（ 104）10S
磷光波长较荧光长?
综上所述的能量释放方式中：
辐射跃迁：荧光、磷光的发射。 无辐射跃迁：振动弛豫、内转换、