85 细菌内毒素检查法usp37

<85>细菌内毒素试验USP37

装置

将用于验证过程的所有玻璃器皿和热稳定性材料置于干热灭菌箱中以除去热原。最小灭菌时间和温度一般为30min,250°。若需使用塑料器皿，例如微孔板或自动加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素且对试验无干扰的器械。【注：在本章中，“管”的意思包括其他任何反应容器，如微量滴定管】

试剂及试液

阿米巴溶解产物（鲎试剂）——鲎试剂是一种由寄生于鲎（中国鲎或美洲鲎）中的阿米巴虫的溶解产物（白血细胞）获得的冻干产品。该试剂符合有关法规要求。【注：鲎试剂会对一些除内毒素外的β-葡葡聚糖起反应。可利用鲎试剂不与葡聚糖反应，通过移除阿米巴溶解产物中会与葡聚糖反应的G因子或抑制阿米巴溶解产物的G因子反应系统和用于存在葡聚糖的内毒素试验。】

细菌内毒素检查用水（BET）——用注射用水或其他不与鲎试剂反应的在灵敏限度内的水。

溶菌液供试液——在缓慢搅拌下，阿米巴溶解产物（鲎试剂）溶于BET检查用水或鲎试剂生产商建议的缓冲液中，根据生产需要贮存重组的鲎试剂，冷藏或冷冻。

溶液的制备：

标准内毒素储备液——标准内毒素储备液是根据包装上的说明书，制剂标签上标准内毒素储备液的储存和制备，用现行的WHO国际标准校准过的USP内毒素标准品制备的。内毒素用EU表示。【注：1EU=1IU】

内毒素标准液——将内毒素储备液混合均匀，再用细菌内毒素检查用水对其作适当的系列稀释。尽快使用稀释液，以避免因吸附而失去活性。

供试液——供试溶液是通过用细菌内毒素检查用水溶解、稀释药物制备。某些物质或制剂可能在其他水溶液中被更适当地溶解、稀释。如有必要，调节待测溶液的pH值，使鲎试剂和样品的混合物pH在由鲎试剂生产者定的pH范围内。通常使用于pH范围在6.0-8.0的产品。pH的调节可以用鲎试剂生产者推荐的酸、碱或适当的缓冲液。酸和碱可以在已去除内毒素的容器中用浓缩液或固体和细菌内毒素检查用水制备。缓冲剂必须进行验证无内毒素和干扰因子。

最大有效稀释液（MVD）测定

最大有效稀释液是指内毒素限度待测样品的允许的最大范围的稀释液。用下列公式测定MVD：

MVD = (内毒素限度×供试液浓度)/（λ）

内毒素限度——注射药品的内毒素限度取决于剂量，等于K/M2，其中K是每千克体重内毒素的阈值热剂量；M是每千克体重产品的最大推荐剂量。当进行间隔频繁注射和连续输液时，M是指每小时给药的最大总剂量。在药典中，注射药品的内毒素限度规定为EU/mL, EU/mg, EU/单位生物活性，等。

供试液浓溶液——

mg/mL内毒素规定为重量（EU/mg）的情况下；Units/mL内毒素规定为重量（EU/单位生物活性）的情况下；mL/mL内毒素规定为重量（EU/mL）的情况下。

λ凝胶法（EU/mL）或者用于浊度法和显色法标准曲线的最低浓度的标示灵敏度。

凝胶法

凝胶法系通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或量化内毒素的方法。在标准条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度。为确保实验的精确和有效性，按下面的准备实验中描述做鲎试剂的标示灵敏度和干扰因子确认的实验。

准备实验

鲎试剂标示灵敏度的确认实验使用前用至少4个鲎试剂确认标示灵敏度λ，单位为EU/mL。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度确认试验。至少用USP细菌内毒素RS和BET 水制备4个不同浓度（相当于2λ，λ，0.5λ,0.25λ）标准液。

取装有等容量（如0.1ml）鲎试剂溶液的试管，加入0.1ml不同浓度的内毒素标准溶液混合。如果使用冻干鲎试剂单个测试量的小瓶或安瓿，可直接加入上述溶液。将反应混合液按照生产商说明培养一个恒定周期（通常为37±1℃下60±2分钟），避免震动。为测试凝胶的完整性，将试管从恒温器中依次取出，缓缓倒转180℃，若管内形成凝胶，并且倒置时，不从管壁滑脱者为阳性；未形成完整凝胶者为阴性。最低浓度标准溶液在所有平行试验中均显示阴性该试验才有效。

反应终点是指系列递减的使鲎试剂凝结的标准内毒素浓度最小浓度。通过四个平行试验反应终点浓度的对数平均值，再取平均值真数，计算反应终点的几何平均值，如下式：

终点浓度的几何平均值=antilog（∑℮/f）

∑℮为系列反应终点浓度对数的总和，f为重复试验试管数。反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的测定值（EU/ml）。当这个值在0.5λ~2λ之间，标示灵敏度确认，并可用于内毒素检查。

凝胶法干扰因子试验按表1制备溶液A, B,C,D，在抑制/增强试验中使用的供试品溶液应为未检出内毒素且不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按上述鲎试剂灵敏度复核试验步骤操作。B和C溶液反应终点浓度的几何平均值按鲎试剂灵敏度确认试验公式计算。

溶液内毒素浓度/

加入内毒素

的溶液稀释液稀释倍数内毒素的初

始浓度

平行试验次

数

A a

B b

C c

D d 未加入/供试

品溶液

2λ/供试品

溶液

2λ/细菌内

毒素检查用

水

未附加/细菌

——

供试品溶液

细菌内毒素

检查用水

——

——

1

2

4

8

1

2

4

8

——

——

2λ

1λ

0.5λ

0.25λ

2λ

1λ

0.5λ

0.25λ

——

4

4

4

4

4

2

2

2

2

2