基因重排检测技术的建立及其在淋巴瘤诊断中的应用(一)

基因重排检测技术的建立及其在淋巴瘤诊断中的应用(一)

作者：朱少君，李艳红，张伟，王旭霞，巩丽，李爱宁,兰淼

【关键词】淋巴瘤Detectionandclinicalsignificanceofgenerearrangementsindiagnosisoflymph omas

【Abstract】AIM:ToestablishawaytodetectthegenerearrangementsofIgHandTCRandtoas sesstheapplicationofthedetectiontechniqueinthediagnosisofmalignantlym phoma.METHODS:Fiftythreecasesofmalignantlymphomaand20casesofreac tivelymphoidhyperplasiawerechosenformakingtissuesections.GenomicDN Awasextracted,andamplifiedviaPCR.Theproductswereresolvedondenaturin gpolyacrylamidegelsandvisualizedthroughsilverstaining.RESULTS:Generearr angementsofIgHandTCRwerenegativein20casesofreactivelymphoidhyperpl asia.Inallof18casesofTcellnonHodgkinslymphoma(TNHL),generearrangeme ntofTCRγwasfoundin12casesandthatofTCRβwasfoundin3cases,andIgHgene rearrangementwasnotfound.IgHgenerearrangementwasfoundin28casesou tof32casesofBcellNHL(BNHL),in2casesofwhichgenerearrangementsofTCRγa ndIgHwerebothfound.TherewasIgHgenerearrangementin3casesofsuspecte dlymphomas.TherewasaremarkabledifferencebetweenNHLgroupandbenig ngroupingenerearrangment(P0.05).CONCLUSION:Thedetectionofgenerearr angementsofIgHandTCRbyPCRcanbeakindofsubsidiarymeanstodiagnoseth

elymphoproliferativedisease.Particularly,theclonalityshowedintheformalinf ixedandparaffinembeddedsamplesmaybeusefulintheretrospectiveresearch es.

【Keywords】lymphoma;generearrangement;polymerasechainreaction;neoplasm

【摘要】目的：建立基于克隆性分析技术的B和T淋巴细胞产生的抗原受体分子基因重排检测技术，探讨B淋巴细胞免疫球蛋白及T淋巴细胞受体基因重排在恶性淋巴瘤临床诊断中的应用.方法：从组织蜡块中切取组织片5~10张，提取基因组DNA，PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显示基因重排结果.结果：20例良性淋巴组织反应性增生病例中,淋巴细胞IgH及TCR基因重排均为阴性；18例T细胞非何杰金氏淋巴瘤中TCRγ基因重排12例,TCRβ基因重排3例，未见有IgH基因重排；32例B细胞性非何杰金氏淋巴瘤标本中有28例IgH基因重排阳性,有2例TCRγ和IgH基因重排均阳性；3例未确诊的疑难病例均为IgH 基因重排；IgH及TCR基因重排检出率在淋巴瘤组与良性组之间，差异有显著意义(P0.05).结论：应用PCR法检测B淋巴细胞IgH和T淋巴细胞TCR基因重排可作为淋巴细胞来源的良、恶性病变的一种辅助诊断手段，且适用于石蜡标本以进行回顾性研究.

【关键词】淋巴瘤；基因重排；聚合酶链反应；肿瘤

0引言

恶性淋巴瘤(malignantlymphoma)是免疫系统的原发性恶性肿瘤,主要发

生于淋巴器官和淋巴组织.根据肿瘤的组织结构及细胞学特征可分为何杰金氏病（Hodgkinsdisease,HD）及非何杰金恶性淋巴瘤（nonHodgkinsmalignantlymphoma,NHL），淋巴瘤的诊断一直是病理诊断中的难点，部分淋巴组织增生性病变单纯通过HE和免疫组化很难明确性质，另外NHL由于种类繁多，分类复杂，给临床病理工作者带来了一定的困难.

淋巴细胞从原始的胚系构型到分化成熟,其抗原受体(Ig和TCR)基因通过基因重排而形成有功能的基因.一个T，B细胞或其克隆性后代，均只含一种独特的分子遗传学标记.一旦某一克隆的淋巴细胞发生恶性变化,即可呈现特异的基因重排〔1〕.因此,对基因重排类型进行检测可用于对淋巴细胞增殖性疾病的诊断.此研究拟应用这一手段，探讨淋巴组织增生性病变的性质，并对该技术在恶性淋巴瘤中的诊断价值进行探讨. 1材料和方法

1.1材料53例恶性淋巴瘤标本均来自第四军医大学唐都医院病理科（1995~2005）.其中男性29例（55%），女性24例（45%）；年龄12~76岁，平均年龄44.2岁.所有标本均为福尔马林固定、石蜡包埋组织.其中B细胞非何杰金淋巴瘤32例，T细胞非何杰金淋巴瘤18例，未能定性的淋巴组织增生性病变3例.20例良性淋巴组织反应性增生病例作为阴性对照.所有淋巴瘤病例均在取PCR模板前经临床病理HE和免疫组化标记（B细胞:CD20,CD79α;T细胞:CD3,CD45RO）证实，以确定为相应病例且所取部位确为病变部位，包含有需检测的部分.3例未能定性的淋

巴组织增生性病变怀疑为BNHL(免疫组化标记CD79α阳性),但诊断仍未明确.

1.2方法

1.2.1石蜡包埋组织DNA的提取每例标本制备厚度为4μm的切片6张，贴于载玻片上，常规烤片、二甲苯脱蜡、乙醇冲洗，切片自然干燥.用无菌双面刀片将组织刮入1.5mL的离心管中，按以前的方法〔2-3〕提取基因组DNA.

1.2.2引物合成引物序列由上海生工生物工程技术公司合成.引物序列为:β球蛋白基因内对照PC03：ACACAACTGTGTTCACTAGC，PC04：CAACTTCATCCACGTTCACC；免疫球蛋白基因重排(IgH)FR3A：ACACGGCTGTGTATTACTGT，LJH：TGAGGAGACGGTGACC，VLJH：GTGACCAGGGTACCTTGGCCCCAG；T细胞受体基因重排(TCRβ链和γ链)Db1:CAAAGCTGTAACATTGTGGGGAC，Jb2:AGCACTGTGAGCCTGGTGCC，TVG:AGGGTTGTGTTGGAATCAGG，TJX:CGTCGACAACAAGTGTTGTTCCAC，Vγ11:TCTGGAGTCTATTACTGTGC，Vγ101:CTCACACTCTCACTTC，Jγ12:CAAGTGTTGTTCCACTGCC，Jp12:GTTACTATGAGCTAGTCC.

1.2.3PCR扩增及循环条件PCR扩增在PT200型热循环仪（MJResearch）上进行.反应体系为25μL，含10mmol/LdNTP（GibcoBRL）2μL，10×缓冲液2.5μL，50mmol/LMgCl20.75μL，TaqDNA聚合酶（GibcoBRL）1U，20pmol/L引物1μL，DNA样品1~5μL.IgH基因采用半巢氏PCR扩增:第一轮引物为FR3A和LJH,95℃预变性3min,然后94℃变性40s,62℃退火