基因重排检测技术的建立及其在淋巴瘤诊断中的应用(一)
t细胞淋巴瘤tcrγ基因重排特征的分析及检测方法优化
Ｔ细胞淋巴瘤ＴＣＲＴ基Ｎ重排特征分析及检测方法的优化摘要研究背景与目的淋巴瘤在组织和细胞形态学方面与高度反应增生性淋巴组织的鉴别诊断十分困难，容易造成误诊。
淋巴瘤病理诊断是临床病理工作的难题之一。
目前国内主要依靠以形态学为主、免疫组化为辅的诊断手段。
随着分子生物学的发展，从基因水平研究和分析诊断疾病的技术不断出现并且日趋成熟，为淋巴瘤诊断提供了有效工具。
淋巴瘤是由单克隆淋巴细胞增生所致，而反应增生性淋巴组织则来自于多克隆淋巴细胞，这是二者的重要区别。
编码免疫球蛋白（Ｉｇ）或Ｔ细胞受体（ＴＣＲ）的基因经过重排以后，不同克隆之间的重排基因互不相同，因此，基因重排对淋巴瘤的诊断具有特异性价值。
以ＰＣＲ技术为基础的方法以其简便、高效、廉价及适用面广而在淋巴瘤基因重排研究方面越来越受重视。
但不同研究文献中所采用的引物、ＰＣＲ条件、ＰＣＲ产物检测方法等都不尽相同，结果也有差异。
因此，难以找到适于常规临床病理诊断之用的标准程序。
Ｊｕｒｋａｔ细胞是Ｔ细胞淋巴瘤基因重排研究中常用的阳性对照细胞，但有关Ｊｕｒｋａｔ细胞基因重排的详细情况也未见报道。
假基因是Ｉｇ和ＴＣＲ胚系ＤＮＡ中常见的基因，有关假基因参与重排的情况以及在设计引物方面是否应将假基因包括在内也未见有关研究报道。
本实验以ＴＣＲ基因重排为研究对象，通过优化引物选择、ＰＣＲ条件及ＰＣＲ产物的检测方法等，分析Ｔ细胞淋巴瘤基因重排检测的最佳方法。
同时，分析ＴＣＲ基因重排的特点，为进一步研究ＴＣＲ基因重排提供理论和技术支持。
方法１以ＴＣＲｙ基因重排为研究对象，选用通用引物ＴＶＧ、ＶｖＩ及ＴＣＲ７家族特异性引物为工具。
用正交设计实验优化ⅥＩ引物的ＰＣＲ条件。
另选一对ＴＣＲ［ｊ通用引物作为ＴＣＲｙ引物的补充和比较。
２利用ＰＣＲ和测序研究Ｊｕｒｋａｔ细胞基因重排情况，分析ＴＣＲ基因重排的基本特点。
３ＰＣＲ产物检测方法①利用ＴＣＲ通用引物检测淋巴瘤克隆性基因重排阳性率，分别用琼脂糖电泳和ＳＳＣＰ分析ＰＣＲ产物；②将ＰＣＲ产物分别进行直接测序和克隆后测序，分析ＴＣＲ基因重排的特点及探索测序方法在基因重排检测中的应用；⑧分析ＰＣＲ产物中ＤＮＡ的克隆数与ＳＳＣＰ中条带数目的关系。
抗原受体基因重排克隆性分析淋巴瘤辅助诊断技术的发展和应用现状
Ａ Ｇ的种 系（ｅｍｉｅ 或称胚 胎 的（ｍｂ ｏｉ） 型均 由不连 续 的 Ｄ Ａ 片段 组成 ， 括 可变 区（ａｉ ｌ Ｒ ｇｒｌ ） ｎ ｅ ｒ ｎｃ 构 ｙ Ｎ 包 ｖｒ ｂ ａｅ
ｒｇ ｎ ， 、 ｅｉ ｓＶ） 变异 区（ ｉ ｒ ｔ， ） 连 接 区（ｏｎ ｇ Ｊ 和恒定 区（ ｏ ｓ ｎ， ， Ｊ Ｃ 区存在 于 各种 类 型 Ａ Ｇ ｏ ｄｖ ｓｙ Ｄ 、 ｅｉ ｊｉｉ ， ） ｎ ｃｎｔ ｔＣ） Ｖ、、 ａ Ｒ 中， Ｄ 区仅存在 于 ＩＨ 和 Ｔ Ｒ 及 ＾链基 因中。Ａ Ｇ基 因重排是 淋 巴细胞 完成发育分 化成 熟 的正常 生理 而 ｇ Ｃ１ ｙ ３ Ｒ
过 程， 早在 骨髓 淋 巴细胞 分化 阶段 ，Ｒ Ａ Ｇ基 因即发生重 排 ， 形成 Ｖ（ ） 连 续 Ｄ Ａ 片段 （ １ ， 而产生相 应 ＤＪ Ｎ 图 ）从
的抗 原 受体合 成。
基 因 Ｖ、 、 Ｄ Ｊ片段 的数 量愈 多， 产生 的组 合数也愈 多。该 步骤 可 产生许 多不 同的 Ｄ Ａ序 列， Ｎ 从而编 码 出 不 同的蛋 白质 ， 虽然 它们 的差别及 其微 小 ， 却具 有独立特 异性 。基 因重排 过程使种 系 中承载 的相对有 限的 但
李 挺 ， 幼立 祖
（ ． 京 大学 第 一 医 院 病理 科 ， 京 １北 北
Ｃ ｒｅ ｎｖ ｒ ｔ ， Ｓ ｏｎ ｌ Ｕ ｉ ｓ ｙ Ｕ Ａ） ｌ ｅｉ
１０ ３ ；． ｅａｔ ｅｔ ｆ ｅ ａ ｐｔ ｌｇ， ｅＭｅ ｏｉ ｏｐ ａ， ｉ ｄ ａ Ｃ ｌ ｇ ００ ４２ Ｄ ｐｒ ｎ ｍ ｔ ａ ｏｏｙ ｔ ｔ ｄｓ Ｈ ｓｉ ｌＷｅ ｌ ｉ ｌ ｏｌ ｅ ｍ ｏＨ ｏ ｈ ｈ ｈ ｔ ｔ ｌＭｅ ｃ ｅ
遗传 学信息 转变为大量 的基 因片段 ， 而再编码 为 Ｉ和 Ｔ Ｒ分子 的抗原结 合部位 。这 些不连接 片段 的重新 从 ｇ Ｃ 洗牌和连接从 统计学水 平上 阐释 了人体 免疫 系统 发 生的抗 原 受体 的多变性 。据估 计 ， 因重排机 制 可产 生 基
TCR基因重排检测在T细胞淋巴瘤病理诊断中的作用
TCR Gene Rearrangement in the Pathologic Diagnosisof T-cell LymphomaDissertation Submitted toNorth China University of Science and Technology in partial fulfillment of the requirementfor the degree ofMaster of MedicinebyJia Wen(Pathology and Pathophysiology)Supervisor:Ph.D Ma XiaobingJune,2015独创性说明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。
尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得华北理工大学以外其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。
与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。
论文作者签名：日期：2015年6月10日关于论文使用授权的说明本人完全了解华北理工大学有关保留、使用学位论文的规定，即：已获学位的研究生必须按学校规定提交学位论文，学校有权保留、送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以将学位论文的全部或部分内容采用影印、缩印或编入有关数据库进行公开、检索和交流。
作者及导师同意论文公开及网上交流的时间：□自授予学位之日起；□自年月日起。
作者签名：导师签名：签字日期：2015年6月10日签字日期：2015年6月10日√摘要摘要目的探讨T细胞抗原受体（T cell receptor，TCR）基因重排在T细胞淋巴瘤中的特异性及其在病理诊断中的价值。
由于淋巴瘤在临床病理诊断中难度较大，仅凭HE和免疫组织化学特点得出的结论易造成误诊和漏诊。
在恶性淋巴瘤的分类中，T细胞淋巴瘤是一种临床上相对少见且异质性较高的肿瘤，准确做出诊断给病人的治疗和预后带来不可或缺的价值。
基因重排在淋巴瘤中的应用
基因重排在淋巴瘤中的应用好啦，今天咱们来聊一聊“基因重排”在淋巴瘤中的应用。
别被这几个词吓着了，听起来像是高大上的医学术语，但其实也没那么复杂。
想象一下，你拿起一块拼图，突然发现里面的几片图案不对劲了。
是的，基因重排就像是拼图里的那几片被换了位置，它们原本应该在一起的部分，被打乱了。
说到淋巴瘤，大家可能听说过一些，但不一定知道它是怎么回事。
淋巴瘤其实是一种癌症，它影响的是我们的淋巴系统。
我们身体的淋巴就像是一个高速公路网，帮助我们清除垃圾，保持身体健康。
当这个系统出了问题，细胞就开始不听话，变得疯狂生长，进而导致癌症。
你可能会问，基因重排在其中有什么作用？好，我们来细细讲讲。
基因重排其实是淋巴细胞在发育过程中自然发生的一种现象。
就像你去做衣服的剪裁，裁剪一块布料时，常常需要把布料拼接在一起，搞得又快又精确，才能做出合身的衣服。
而这些基因重排，就是在细胞制作“抗体”的过程中，不小心把一些基因片段给弄错了。
通常，这些错误不会导致大问题，但在某些情况下，这些“错误”会导致细胞发生变异，甚至发展成癌症。
所以基因重排不仅仅是个小小的错误，它可能会“助长”淋巴瘤的生长。
我们怎么样才能利用这些“基因小错”来帮我们诊断和治疗淋巴瘤呢？科学家早就发现了，基因重排在淋巴瘤中的出现往往是“特定”的，它像是一个密码，能帮助医生识别淋巴瘤的种类。
就好像你解一个谜题，如果你能抓住那个关键线索，后面的一切都能迎刃而解。
通过对这些基因重排的分析，医生能更好地判断癌症的类型、分期，甚至对症下药。
就像是给病人量身定做一个治疗计划，精准治疗，比那种笼统的“按常规来”效果要好得多。
说到这里，可能有些人会觉得，咦，基因重排这么神奇，难道它就是治愈淋巴瘤的“秘密武器”吗？答案并没有那么简单。
虽然基因重排可以帮助医生进行精准诊断，但它本身并不能直接治愈淋巴瘤。
它就像是我们手中的一张地图，能够让医生找到问题的根源，指导后续的治疗方向。
治疗的方法，还是得靠那些经典的手段：化疗、放疗，或者免疫疗法。
T细胞性淋巴瘤诊断中TCR基因重排检测的应用
T细胞性淋巴瘤诊断中TCR基因重排检测的应用潘鑫艳;杨长绍;黎贵芸;杨举伦;王丽【摘要】目的：探讨T细胞受体( T cell receptors, TCR)基因重排检测对T细胞性淋巴瘤诊断的价值。
方法收集T细胞性淋巴瘤30例和淋巴反应性增生组织30例,提取DNA,应用BIOMED-2引物系统中的56条引物进行PCR扩增,核酸分子异源双链凝胶电泳分析结果。
结果30例T细胞性淋巴瘤标本中TCRβ、TCRγ、TCRδ的检出率分别为83．3%(25/30)、93．3%(28/30)、13．3%(4/30),三者联合检测的检出率为96．7%(29/30),30例淋巴反应性增生组织中均未检测出TCR 基因重排。
结论利用BIOMED-2引物系统检测TCR 基因重排可作为T细胞性淋巴瘤的辅助诊断工具。
%Purpose To discuss the TCR gene rearrangements in the diagnosis of T-cell lymphomas. Methods Formalin-fixed and paraffin-embedded samples including 30 cases of T-cell lymphomas and 30 cases of reactive lymphoid hyperplasia were chosen for ex-tracting genomic DNA and PCR amplification using 56 BIOMED-2 primers. PCR products were analyzed by heteroduplex and polyacryl-amide gel electrophoresis. Results In all 30 cases of T-cell lymphomas, 25 cases (83. 3%) showed TCRβ gene monoclonal rear-ran gements, 28 cases (93. 3%) of TCRγ gene monoclonal rearrangements, 4 cases (13. 3%) of TCRδ gene monoclonal rearrange-ments. 29 cases (96. 7%) with TCRβ+TCRγ+TCRδ gene monoclonal rearrangements were detected. but no clonal TCR gene rear-rangements were found in 30 cases of reactive lymphoid hyperplasia. Conclusions The detection of TCR gene rearrangements using BIOMED-2 primers is a useful assistant method for the diagnosis of T-cell lymphomas.【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2015(000)004【总页数】4页(P400-403)【关键词】T细胞性淋巴瘤;基因重排;BIOMED-2;TCR基因【作者】潘鑫艳;杨长绍;黎贵芸;杨举伦;王丽【作者单位】成都军区昆明总医院病理科，昆明 650032;成都军区昆明总医院病理科，昆明 650032;成都军区昆明总医院病理科，昆明 650032;成都军区昆明总医院病理科，昆明 650032;成都军区昆明总医院病理科，昆明 650032【正文语种】中文【中图分类】R733.4非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma，NHL)包括B细胞性淋巴瘤(B-cell lymphoma)和T细胞性淋巴瘤(T-cell lymphoma)，因T细胞性淋巴瘤种类繁多，分类复杂，病理诊断较难。
基因组重测序技术及其应用
基因组重测序技术及其应用随着科技的快速发展，基因组重测序技术逐渐走进我们的生活，这项技术可以通过高通量方法获取DNA序列信息，对于基因组学研究、医学诊断和疾病防治等领域都具有重要价值。
本文将从技术原理、数据分析和应用领域等方面介绍基因组重测序技术及其应用。
一、基因组重测序技术的原理基因组重测序技术是一种将目标DNA样本分解为小片段、进行高通量测序的技术。
传统测序方法需要使用琼脂糖凝胶或者聚丙烯酰胺凝胶等凝胶材料对DNA进行分离和分析，而基因组重测序技术则可以同时处理数百万个小DNA片段。
该技术主要分为两种：全基因组重测序，即对整个基因组进行测序；和外显子组重测序，即只对外显子区域进行测序。
其中，外显子组重测序通常用于检测某些突变位点和基因变异，具有高度的实用性。
二、数据分析基因组重测序技术会产生大量的数据，其中包含了数百万条片段的序列信息。
因此，在进行数据分析时需要进行预处理、比对、拼接和注释等多个步骤。
在预处理中，需要去除低质量序列、提取有用的信息等。
比对步骤则是将测序数据与参考基因组相对比，找到测序数据中的对应片段。
拼接步骤就是将这些对应片段拼接成完整的DNA序列，并对其进行修复。
最后，注释工作则是将数据翻译成具有生物学意义的信息，如基因结构、编码和非编码序列等。
三、基因组重测序技术的应用领域基因组重测序技术可以广泛应用于医学研究、育种、环境污染监测等多个领域。
其中，在医学领域中，该技术通常用于寻找患病基因和识别病原微生物。
在育种领域，基因组重测序技术可以用于鉴定优良品种、筛选育种材料，以及深入分析某些种类的基因组结构和功能。
在环境污染监测方面，该技术则可以帮助研究人员监测水体、土壤、大气等环境中的污染物，对于环境保护和生态平衡的维护具有重要意义。
四、未来展望基因组重测序技术的发展趋势将从单样本到多样本，从低深度到高深度，从全基因组到全转录组、全基因组外显子和全基因组甲基化等多个方面不断拓展。
高通量测序分析B细胞非霍奇金淋巴瘤IGH基因克隆性重排特点及临床应用价值
高通量测序分析B细胞非霍奇金淋巴瘤IGH基因克隆性重排特点及临床应用价值马强;邹东梅;郭轶先;赵弘;常晓丽;胡蓉华;孙婉玲【期刊名称】《肿瘤防治研究》【年(卷),期】2024(51)5【摘要】目的探讨B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-NHL)IGH基因克隆性重排特点及临床应用价值。
方法收集接受NGS检测,且存在IGH基因存在克隆性重排的55例B-NHL患者的人口学资料、临床资料及IGH基因NGS检测结果,分析IGH基因克隆性重排特点、IGHV基因取用频率,以及NGS检测IGH基因重排在临床中的应用价值。
结果55例患者中,以单个优势克隆为主(85.45%,47/55),少数患者可检测到2个(12.73%,7/55)和3个优势克隆(1.82%,1/55);在IGHV基因取用偏好方面,IGHV3基因在B-NHL中取用频率最高,其次为IGHV4基因;在IGHV亚型中,IGHV3-23在慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤(CLL/SLL)中出现频率最高,IGHV4-34在原发中枢神经系统弥漫大B细胞淋巴瘤(PCNSL-DLBCL)及弥漫大B细胞淋巴瘤非特指型(DLBCL-NOS)中出现频率最高。
结论不同病理类型的B-NHL患者IGH基因克隆性重排中IGHV基因片段取用频率存在偏好,使用NGS检测IGH重排可以识别亚克隆,鉴定克隆相关性,辅助疾病诊断。
【总页数】5页(P368-372)【作者】马强;邹东梅;郭轶先;赵弘;常晓丽;胡蓉华;孙婉玲【作者单位】首都医科大学宣武医院血液内科【正文语种】中文【中图分类】R551.2【相关文献】1.IgH基因单克隆重排检测及其在B细胞性非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用2.血浆游离DNA IgH和TCRγ基因重排在非霍奇金淋巴瘤患者微小残留病中的应用及临床意义3.高通量测序结合捕获技术检测非霍奇金B细胞淋巴瘤中重链基因重排VDJ 区的临床研究4.血浆游离DNA IgH和TCRγ基因克隆性重排在非霍奇金淋巴瘤诊断中的意义5.实时定量PCR检测B细胞非霍奇金淋巴瘤患者外周血和骨髓IgH基因重排及临床意义因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
淋巴瘤的分子生物学诊断知识点
淋巴瘤的分子生物学诊断知识点淋巴瘤是一种以淋巴细胞增生异常为特征的恶性肿瘤，包括多种亚型，具有不同的生物学特征和临床表现。
分子生物学诊断技术在淋巴瘤的分类、预后评估和治疗选择等方面起到了重要的作用。
本文将介绍淋巴瘤分子生物学诊断的一些重要知识点。
一、免疫组织化学检测（IHC）免疫组织化学检测通过检测肿瘤细胞表面或细胞内的特定分子标志物，帮助确定淋巴瘤的亚型和对应的治疗策略。
例如，CD20和CD79a是B细胞标志物，CD3是T细胞标志物，CD30是霍奇金淋巴瘤的标志物等。
免疫组织化学检测可以通过染色的强度和分布情况来判断特定标志物的阳性率，并结合其他临床和病理学特征进行综合分析。
二、基因重排检测淋巴瘤的发生和发展与基因重排异常密切相关。
通过检测重排的免疫球蛋白（Ig）和T细胞受体（TCR）基因，可以帮助确定淋巴瘤的亚型和起源。
例如，典型的霍奇金淋巴瘤患者常存在免疫球蛋白基因的重排。
PCR和Southern blot是常用的基因重排检测方法，可以通过扩增和分析特定基因区域的DNA序列来判断重排情况。
三、染色体异常检测淋巴瘤中常伴随着染色体异常，如染色体重排、整倍体性改变和部分染色体缺失等。
通过检测染色体异常，可以帮助确定淋巴瘤的亚型、预后风险和治疗选择。
常用的染色体异常检测方法包括常规染色体核型分析、荧光原位杂交（FISH）和比较基因组杂交（CGH）等。
FISH 可以通过探针标记的染色体特定区域来检测染色体重排和缺失。
而CGH则可以全基因组范围内分析基因拷贝数变异。
四、新一代测序技术随着新一代测序技术的发展，淋巴瘤分子生物学诊断也得到了进一步的提升。
新一代测序技术可以高效地获得淋巴瘤患者的全基因组、外显子组、转录组和甲基化组等信息。
这些信息可以帮助识别新的突变驱动基因和疾病相关的生物学过程，为个体化治疗提供重要依据。
总结：以上介绍了淋巴瘤分子生物学诊断的一些重要知识点，包括免疫组织化学检测、基因重排检测、染色体异常检测和新一代测序技术。
IgH基因单克隆重排检测及其在B细胞性非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用
IgH基因单克隆重排检测及其在B细胞性非霍奇金淋巴瘤诊断中的应用李银珍;王芳;邵琼;张旭;邓玲;汤涛;张晓;吴秋良【摘要】AIM: To establish a reliable and feasible protocol for detection of monoclonal immunoglobulin heavy chain (IgH) gene rearrangements for routine diagnosis of B - cell non - Hodgkin lymphoma ( B - NHL). METH-ODS : Using the primer combinations of FR2, FR3, LJH and VLJH, modetube A + tube B, and semi - nested PCR, the monoclonal IgH gene rearrangements in 121 cases of B - NHL, 58 cases of T - cell non - Hodgkin lymphoma ( T - NHL) and 19 cases of reactive lymphoid hyperplasia were detected. The differences of clonality detection rate between B - NHLgroup and T - NHL group, B - NHL group and reactive lymphoid hyperplasia group, and between the use of FR2, FR3 and FR2 + FR3primers were analyzed. RESULTS: The clonality detection rates of B - NHL, T - NHL and reactive lymphoid hyperplasia were 81% (96/118), 4% (2/54)and 0% (0/19). There were remarkable differences between B - NHL group and T - NHL group, B - NHL group and reactive lymphoid hyperplasiagroup in monoclonal IgH gene rearrangements ( P < 0. 05 ) . In B - NHL group, monoclonality was found in 58% of the cases using primer FR2, 55% using FR3 , andrn81% using the combination of both primers, with significant differences (P <0. 05) . CONCLUSION: Using the primer combinations of FR2, FR3 , LJH and VLJH, detection of paraffin - embedded tissues, the method of tube A + tube B mode and semi -nested PCR for determining monoclonal IgH gene rearrangements is feasible and reliable, and the clonality de-tection rate is high enough for clinical diagnosis of B - NHL.%目的:建立准确可靠、操作性强、适用于临床实际工作的免疫球蛋白重链(immunoglobulin heavy chain,IgH)基因单克隆重排检测方法,用于B细胞性非霍奇金淋巴瘤(B-cell non-Hodgkin lymphoma,B-NHL)的辅助诊断.方法:采用骨架区(framework region,FR)引物FR2、FR3和重链连接区(joining region of heavy chain,JH)引物LJH、VLJH组合、A管+B管模式、半巢式聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)法对121例B-NHL、58例T细胞性非霍奇金淋巴瘤(T-cell non-Hodgkin lymphoma,T-NHL)和19例淋巴结反应性增生的石蜡组织进行IgH基因单克隆重排检测,分析IgH基因单克隆重排检出率在B-NHL组、T-NHL组和淋巴结反应性增生组中的差异,以及B-NHL中联合应用FR2和FR3与单独应用FR2、FR3之间IgH基因单克隆重排检出率的差异.结果:118例成功检测的B-NHL中,IgH基因单克隆重排检出率为81%(96/118);54例成功检测的T-NHL中,IgH基因单克隆重排检出率为4%(2/54);19例成功检测的淋巴结反应性增生中未检出IgH基因单克隆重排.B-NHL组与T-NHL组、淋巴结反应性增生组相比,IgH基因单克隆重排检出率差异具有显著性(P<0.05).B-NHL中,FR2基因单克隆重排检出率为58%(68/118),FR3基因单克隆重排检出率为55%(65/118),联合应用FR2和FR3,IgH基因单克隆重排检出率为81%(96/118),联合应用FR2和FR3与单独应用FR2、FR3的检出率有显著差异(P<0.05).结论:采用FR2、FR3、LJH及VLJH引物组合、A管+B管模式和半巢式PCR法进行石蜡组织IgH基因单克隆重排检测,简单易行,结果准确可靠,阳性率较高,可用于临床B-NHL的辅助诊断.【期刊名称】《中国病理生理杂志》【年(卷),期】2012(028)011【总页数】5页(P1994-1998)【关键词】淋巴瘤;免疫球蛋白;基因重排【作者】李银珍;王芳;邵琼;张旭;邓玲;汤涛;张晓;吴秋良【作者单位】华南肿瘤学国家重点实验室,中山大学肿瘤防治中心分子诊断科,广东,广州,510060;华南肿瘤学国家重点实验室,中山大学肿瘤防治中心分子诊断科,广东,广州,510060;华南肿瘤学国家重点实验室,中山大学肿瘤防治中心分子诊断科,广东,广州,510060;华南肿瘤学国家重点实验室,中山大学肿瘤防治中心分子诊断科,广东,广州,510060;华南肿瘤学国家重点实验室,中山大学肿瘤防治中心分子诊断科,广东,广州,510060;华南肿瘤学国家重点实验室,中山大学肿瘤防治中心分子诊断科,广东,广州,510060;华南肿瘤学国家重点实验室,中山大学肿瘤防治中心分子诊断科,广东,广州,510060;华南肿瘤学国家重点实验室,中山大学肿瘤防治中心病理科,广东,广州,510060【正文语种】中文【中图分类】R733.4免疫球蛋白重链(immunoglobulin heavy chain，IgH)基因单克隆重排是B细胞性非霍奇金淋巴瘤(B－cell non－Hodgkin lymphoma，B－NHL)的重要特征，国内外病理界已达成一致共识:应用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术检测IgH基因单克隆重排可以辅助诊断BNHL[1－3]。
基因组学技术在肿瘤诊断和预后中的应用
基因组学技术在肿瘤诊断和预后中的应用随着科技的不断进步和研究的深入，基因组学技术在肿瘤诊断和预后中扮演着越来越重要的角色。
本文将探讨基因组学技术在肿瘤学领域的应用，并分析其对肿瘤诊断和患者预后评估的重要性。
一、引言肿瘤诊断和预后评估是肿瘤学领域的核心问题，准确的诊断和及时的预后评估对于患者的治疗和生存率至关重要。
传统的肿瘤诊断方法主要依靠组织病理学分析和影像学检查，然而，它们在一些方面存在着局限性。
近年来，基因组学技术的迅速发展为肿瘤诊断和预后带来了新的机遇。
二、基因组学技术在肿瘤诊断中的应用1. 基因突变检测基因突变是肿瘤发生和发展的重要因素。
基因组学技术可以帮助鉴定与肿瘤相关的突变，并提供更准确的诊断依据。
例如，通过测序技术可以检测到肿瘤细胞中的基因突变情况，从而确定特定靶向治疗的可行性。
2. 基因表达分析基因表达的异常与肿瘤的产生相关联。
通过基因组学技术，可以测定肿瘤细胞中的基因表达模式，并与正常细胞进行比较。
这样可以发现异常基因表达，并据此诊断不同类型的肿瘤。
三、基因组学技术在肿瘤预后中的应用1. 个性化治疗选择基因组学技术可以帮助确定肿瘤的分子亚型，从而指导个体化治疗方案的选择。
通过对患者肿瘤样本的基因组分析，可以预测特定治疗方法的疗效，并避免对无效治疗的浪费。
2. 预测预后基因组学技术可以分析肿瘤细胞中的多种基因变化，并据此评估患者的预后情况。
通过对大量病例数据的统计分析，可以建立预后模型，预测患者的存活率和复发率等重要指标。
四、技术挑战和前景展望基因组学技术在肿瘤诊断和预后中的应用面临着一些技术挑战。
首先，高通量测序技术的精准性和可靠性仍然需要提高。
其次，大规模数据的分析和处理需要更加高效的算法和计算平台。
然而，尽管存在一些挑战，基因组学技术在肿瘤学领域的应用前景依然广阔。
随着技术的不断发展，基因组学技术将成为肿瘤诊断和预后评估的重要工具。
结论基因组学技术在肿瘤学领域的应用已经取得了显著的进展，并在肿瘤诊断和患者预后评估上发挥着重要作用。
DNA重排检测方法
PCR-Dot blot即是将PCR扩增产物变性后直接点 在膜上，与标记的特异性探针进行杂交。 • 优点：时间短，可半定量分析，一张膜上可
同时检测多个样品。 • 局限：只能看到一个斑点，必须小心控制反
应条件，设立阳性及阴性对照，以便对检测 标本做出正确鉴定.
DNA重排检测方法
（4）不对称PCR（asymmetric－PCR） 直接测序法
• 改进：荧光素标记IgH、 Igk、Igl及各种TCR探 针化学发光试剂盒克服了上述缺点，以荧光素 取代了同位素作为标记；缩短了曝光时间(5~10 分钟)，并且敏感性不降低，非常有利于在临床 诊断中推广、应用。
DNA重排检测方法
2. 常规PCR技术
DNA发生重排后，其扩增产物条带与正常的有差异， 由此可以检测DNA重排 • 淋巴瘤诊断： 淋巴瘤是细胞克隆性增生的结果，其 特殊的基因重排形式占一定的数量优势，从而成为 细胞克隆性的检测指标。选取IgH与TCR（T细胞受体） 的V、D、J、C区基因编码中20 个左右的保守核苷酸 序列，人工合成一对或多对（家族基因）引物，以 待测样品DNA为模板，扩增目的DNA序列片段。如果 是淋巴瘤则扩增产物电泳出现单克隆性单带。而良 性增生性淋巴组织或正常组织则出现弥漫涂片状， 不形成单带。
急性骨髓白血病 10、11号染色体间易位
10、11号染色体易发生 断裂的基因(MLL)位点
DNA重排检测方法
小麦－簇毛麦F1 代染色体间易位
染色体涂染显示人染色体组
荧光标记探针
• 不对环境构成污染 • 灵敏度能得到保障 • 可进行多色观察分析，可同时使用多个
探针，缩短因单个探针分开使用导致的 周期过长和技术障碍。
核酸探针用荧光染料标记，荧光信号通 过显微镜观察。
IgH基因克隆重排在B细胞非霍奇金淋巴瘤中的的诊断价值
IgH基因克隆重排在B细胞非霍奇金淋巴瘤中的的诊断价值目的：探讨IgH基因克隆重排在B细胞非霍奇金淋巴瘤的中的诊断价值。
方法：用PCR凝胶电泳检测B细胞非霍奇金淋巴瘤中IgH基因克隆性重排。
结果：43例B细胞非霍奇金淋巴瘤中，39例用FR3A引物检测阳性，阳性率90.7%；22例用FR2A引物检测阳性，阳性率55.2%；FR3A或者FR2A引物联合检测的总阳性率为90.7%。
结论：PCR凝胶电泳技术检测IgH基因克隆重排对B细胞非霍奇金淋巴瘤的诊断有重要的辅助价值。
标签：B细胞非霍奇金淋巴瘤IgH基因克隆重排淋巴瘤作为我国常见恶性肿瘤之一，从分子病理学和分子遗传学水平来探讨相关基因的特征和发病机制，以期建立相应的分子标记，进一步协助诊断、判断预后[1-2]。
淋巴瘤组织学形态多样，免疫组化染色可鉴定淋巴瘤的类型，但无法解决良恶性鉴别难题。
近年来，国外用分子生物学技术证实，细胞增殖的单克隆性可协助肿瘤的诊断。
本研究应用PC R方法检测B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）中免疫球蛋白重链（IgH）基因重排情况，探讨其在淋巴瘤诊断中的价值。
胚系状态下，IgH基因由可变区（V）、多变区（D）、连接区（J ）、恒定区（C）构成。
这些区域在染色体上分布是不连续，片断之间可有长度不等的插入序列将其分开，当淋巴细胞发育到一定阶段，在重组酶的作用下，重新排列组合构成一个有结构的基因，即所谓的基因重排。
正常B淋巴细胞免疫球蛋白重链（IgH ）基因重排为多克隆性，而恶性B细胞肿瘤表现为单克隆性。
因此，这种单克隆IgH 基因重排可用于B细胞淋巴瘤的诊断，对鉴别良、恶性淋巴细胞增生有重要的参考价值[3-5]。
1. 材料与方法1.1. 标本来源收集浙江大学附属医院，温州医学院2010-2013年间诊断的B细胞非霍奇金淋巴瘤（B-NHL）石蜡标本43例，男性24例，女性19例，年龄17-75岁，平均年龄为52岁。
其中弥漫大B淋巴瘤（DLBCL ）30例，滤泡性淋巴瘤（FL）4例，粘膜相关淋巴组织淋巴瘤（MALT）4例，套细胞淋巴瘤（MCL）3例，小细胞淋巴瘤（SLL/CLL）2例。
BIOMED-2标准化免疫球蛋白基因重排技术在石蜡包埋弥漫大B细胞淋巴瘤组织中的应用
BIOMED-2标准化免疫球蛋白基因重排技术在石蜡包埋弥漫大B细胞淋巴瘤组织中的应用孙娟;艾晓非;李庆华;曹增【摘要】目的探讨石蜡包埋组织标本应用BIOMED-2标准化免疫球蛋白(IG)基因重排技术检测弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的可行性.方法从45例石蜡包埋组织标本中提取DNA,采用BIOMED-2系统引物进行多重聚合酶链反应(PCR)扩增,并应用PCR片段分析法进行IG基因重排的克隆性分析.结果将DNA由原浓度100～500 ng/μL稀释至50～100 ng/μL后,DNA扩增最大片段(300～400 bp)含量由10.0％提高到90.0％;45例DLBCL石蜡切片标本提取DNA进行免疫球蛋白重链基因(IGH)和免疫球蛋白kappa基因(IGK)克隆性分析,IGH+IGK阳性率达到84.4％;15例反应性淋巴组织增生标本进行IG/T淋巴细胞抗原受体(TCR)克隆性分析,未见克隆性重排.结论稀释DNA是唯一可以既提高DNA扩增最大片段又能提高克隆性检出率的方法.在DLBCL的诊断和淋巴组织增生性疾病的鉴别诊断中,BIOMED-2标准化体系检测IGH基因克隆性重排是一种快速、可靠的方法,具有重要的临床应用价值.【期刊名称】《检验医学》【年(卷),期】2016(031)009【总页数】4页(P810-813)【关键词】基因重排;石蜡包埋组织;弥漫大B细胞淋巴瘤【作者】孙娟;艾晓非;李庆华;曹增【作者单位】中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院病理中心,天津300020;中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院病理中心,天津300020;中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院病理中心,天津300020;天津医科大学附属肿瘤医院血液科天津市肿瘤防治重点实验室,天津300060【正文语种】中文【中图分类】R446.1弥漫大B细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是一种高度异质性的疾病，临床表现和预后差异较大。
高通量基因测序技术在肿瘤诊断中的应用
高通量基因测序技术在肿瘤诊断中的应用随着生物技术的不断发展，人们对于基因的了解越来越深入。
现在，高通量基因测序技术已经被广泛应用于医学领域，尤其是在肿瘤诊断中。
本篇文章将会对高通量基因测序技术在肿瘤诊断中的应用做一个详细的介绍。
一、高通量基因测序技术的基本原理高通量基因测序技术是指将DNA或RNA序列进行高质量测序的技术。
该技术主要分为三个步骤：DNA/RNA样品的制备、文库构建和测序。
1. DNA/RNA样品的制备DNA或RNA样品制备是高通量基因测序技术的第一步。
该步骤的目的是将DNA或RNA提取出来，并且将其打断成一系列不同长度的小分子，以便于后续步骤的处理。
2. 文库构建文库构建是高通量基因测序技术的第二步。
该步骤的主要作用是将DNA/RNA序列片段连接到一系列的“引物”上，并在“引物”的辅助下进行扩增。
这样，就可以构建出一个文库，其中包含了不同长度的DNA/RNA分子。
3. 测序测序是高通量基因测序技术的第三步。
其主要步骤是利用荧光标记的核苷酸在模板上逐一加入，然后通过高灵敏CCD相机对信号进行检测和录像，将数据转化成电子信号。
对于每个文库，都需要进行数十亿次的重复加入和检测过程，以实现成千上万的DNA/RNA序列的高通量检测。
二、高通量基因测序技术在肿瘤诊断中的应用高通量基因测序技术在肿瘤诊断中的应用可以大致分为两个方向：肿瘤基因组学和肿瘤转录组学。
接下来，我们将会对这两个方向进行详细的介绍。
1. 肿瘤基因组学肿瘤基因组学是指对癌细胞中的基因组进行全面地测序，以发现其中与癌症相关的基因变异。
该领域的主要应用包括以下方面：（1）染色体异常检测肿瘤的发生与染色体异常密切相关。
利用高通量基因测序技术，可以检测出影响肿瘤发展的染色体异常情况，从而辅助医生进行癌症筛查和诊断。
（2）突变检测通过检测癌症细胞中存在的不同突变，可以判断出其与正常细胞存在的差异，并且根据这些差异进行癌症诊断和预测。
高通量基因测序技术可以实现在肿瘤样本中检测出大量突变位点。
基因重排检测技术的建立及其在淋巴瘤诊断中的应用
基因重排检测技术的建立及其在淋巴瘤诊断中的应用【关键词】淋巴瘤Detection and clinical significance of gene rearrangements in diagnosis of lymphomas【Abstract】 AIM: To establish a way to detect the gene rearrangements of IgH and TCR and to assess the application of the detection technique in the diagnosis of malignant lymphoma. METHODS: Fiftythree cases of malignant lymphoma and 20 cases of reactive lymphoid hyperplasia were chosen for making tissue sections. Genomic DNA was extracted， and amplified via PCR. The products were resolved on denaturing polyacrylamide gels and visualized through silver staining. RESULTS: Gene rearrangements of IgH and TCR were negative in 20 cases of reactive lymphoid hyperplasia. In all of 18 cases of T cellnonHodgkins lymphoma (TNHL)， gene rearrangement of TCR γ was found in 12 cases and that of TCR β was found in 3 cases， and IgH gene rearrangement was not found. IgH gene rearrangement was found in 28 cases out of 32 cases of B cellNHL (BNHL)，in 2 cases of which gene rearrangements of TCR γ and IgH were both found. There was IgH gene rearrangement in 3 cases of suspected lymphomas. There was a remarkable difference between NHL group and benign group in gene rearrangment (P<0.05). CONCLUSION: The detection of gene rearrangements of IgH and TCR by PCR can be a kind of subsidiary means to diagnose the lymphoproliferative disease. Particularly， the clonality showed in the formalinfixed and paraffinembedded samples may be useful in the retrospective researches.【Keywords】 lymphoma; gene rearrangement; polymerase chain reaction; neoplasm【摘要】目的：建立基于克隆性分析技术的B和T淋巴细胞产生的抗原受体分子基因重排检测技术，探讨B淋巴细胞免疫球蛋白及T淋巴细胞受体基因重排在恶性淋巴瘤临床诊断中的应用. 方法：从组织蜡块中切取组织片5~10张，提取基因组DNA，PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显示基因重排结果. 结果：20例良性淋巴组织反应性增生病例中，淋巴细胞IgH及TCR基因重排均为阴性；18例T细胞非何杰金氏淋巴瘤中TCRγ基因重排12例，TCRβ基因重排3例，未见有IgH基因重排；32例B细胞性非何杰金氏淋巴瘤标本中有28例IgH基因重排阳性，有2例TCRγ和IgH基因重排均阳性；3例未确诊的疑难病例均为IgH基因重排；IgH及TCR基因重排检出率在淋巴瘤组与良性组之间，差异有显著意义(P<0.05). 结论：应用PCR法检测B淋巴细胞IgH和T淋巴细胞TCR基因重排可作为淋巴细胞来源的良、恶性病变的一种辅助诊断手段，且适用于石蜡标本以进行回顾性研究.【关键词】淋巴瘤；基因重排；聚合酶链反应；肿瘤0引言恶性淋巴瘤(malignant lymphoma)是免疫系统的原发性恶性肿瘤，主要发生于淋巴器官和淋巴组织. 根据肿瘤的组织结构及细胞学特征可分为何杰金氏病（Hodgkins disease， HD）及非何杰金恶性淋巴瘤（nonHodgkins malignant lymphoma， NHL），淋巴瘤的诊断一直是病理诊断中的难点，部分淋巴组织增生性病变单纯通过HE和免疫组化很难明确性质，另外NHL由于种类繁多，分类复杂，给临床病理工作者带来了一定的困难.淋巴细胞从原始的胚系构型到分化成熟，其抗原受体(Ig和TCR)基因通过基因重排而形成有功能的基因. 一个T，B细胞或其克隆性后代，均只含一种独特的分子遗传学标记. 一旦某一克隆的淋巴细胞发生恶性变化，即可呈现特异的基因重排［1］. 因此，对基因重排类型进行检测可用于对淋巴细胞增殖性疾病的诊断. 此研究拟应用这一手段，探讨淋巴组织增生性病变的性质，并对该技术在恶性淋巴瘤中的诊断价值进行探讨.1材料和方法1.1材料53例恶性淋巴瘤标本均来自第四军医大学唐都医院病理科（1995~2005）. 其中男性29例（55%），女性24例（45%）；年龄12~76岁，平均年龄44.2岁. 所有标本均为福尔马林固定、石蜡包埋组织. 其中B细胞非何杰金淋巴瘤32例，T细胞非何杰金淋巴瘤18例，未能定性的淋巴组织增生性病变3例. 20例良性淋巴组织反应性增生病例作为阴性对照. 所有淋巴瘤病例均在取PCR 模板前经临床病理HE和免疫组化标记（B细胞: CD20，CD79α; T细胞: CD3，CD45RO）证实，以确定为相应病例且所取部位确为病变部位，包含有需检测的部分. 3例未能定性的淋巴组织增生性病变怀疑为BNHL(免疫组化标记CD79α阳性)，但诊断仍未明确.1.2方法1.2.1石蜡包埋组织DNA的提取每例标本制备厚度为4 μm的切片6张，贴于载玻片上，常规烤片、二甲苯脱蜡、乙醇冲洗，切片自然干燥. 用无菌双面刀片将组织刮入1.5 mL的离心管中，按以前的方法［2-3］提取基因组DNA.1.2.2引物合成引物序列由上海生工生物工程技术公司合成. 引物序列为: β球蛋白基因内对照PC03：ACACAACTGTGTTCACTAGC， PC04：CAACTTCATCCACGTTCACC；免疫球蛋白基因重排(IgH) FR3A：ACACGGCTGTGTATTACTGT， LJH： TGAGGAGACGGTGACC，VLJH：GTGACCAGGGTACCTTGGCCCCAG；T细胞受体基因重排(TCR β链和γ链)Db1: CAAAGCTGTAACATTGTGGGGAC， Jb2:AGCACTGTGAGCCTGGTGCC，TVG: AGGGTTGTGTTGGAATCAGG， TJX: CGTCGACAACAAGTGTTGTTCCAC，Vγ11: TCTGGAGTCTATTACTGTGC，Vγ101: CTCACACTCTCACTTC，Jγ12:CAAGTGTTG TTCCACTGCC， Jp12: GTTACTATGAGCTAGTCC.1.2.3PCR扩增及循环条件PCR扩增在PT200型热循环仪（MJ Research）上进行. 反应体系为25 μL，含10 mmol/L dNTP（Gibco BRL）2 μL，10×缓冲液2.5 μL，50 mmol/L MgCl2 0.75 μL，Taq DNA聚合酶（Gibco BRL） 1 U，20 pmol/L引物1 μL，DNA样品1~5 μL. IgH基因采用半巢氏PCR扩增: 第一轮引物为FR3A和LJH，95℃预变性3 min，然后94℃变性40 s，62℃退火50 s，72℃延伸40 s，共30个循环; 最后72℃延伸10 min. 扩增产物经1∶100稀释后取1 μL进行第二轮扩增，引物为FR3A和VLJH，95℃预变性3 min，然后94℃变性40 s，60℃退火50 s，72℃延伸40 s，共30个循环; 最后72℃延伸10 min. FR 3A与VLJH扩增产物为100～120 bp.TCRβ和TCRγ采用40个循环，其中TCRγ引物为Vγ11，Vγ101和Jγ12或Vγ11，Vγ101和Jp12的混合物. 95℃预变性3 min，然后94℃变性40 s，56℃退火50 s，72℃延伸40 s；最后72℃延伸10 min. TCRβ扩增产物为65～85 bp. TCRγ各组扩增产物在70～200 bp不等.β球蛋白基因引物作为内对照进行扩赠，共40个循环. 95℃预变性3 min，然后94℃变性40 s，60℃退火50 s，72℃延伸40 s；最后72℃延伸10 min. 产物长度为110 bp.1.2.4电泳及结果观察琼脂糖凝胶（20 g/L）电泳评价扩增效果后，将3 μL产物和等体积的上样缓冲液［4］（990 mL/L甲酰胺，1 g/L溴酚蓝，1 g/L二甲苯青）混匀后加到厚度为0.8 mm的聚丙烯酰胺凝胶（100 g/L，含尿素8mol/L），应用miniVE系统（AmershamPharmacia Biotech）泳动8 h（80 V）.取出后按以前的方法［2］银染，分别用UVP凝胶分析系统（UVP， Cambridge，UK）和光学照相记录数据，根据IgH及TCR相应阳性位置判断结果.1.2.5结果判定阳性结果判定标准：①PCR扩增电泳条带清晰，宽度不大于1 mm，边缘锐利；②片段大小与预计范围相符，与期望值相差不超过5 bp；③若出现期望值大小之外的其他条带或期望值内出现两条或以上可接受的条带，应判定为重排阴性.统计学处理：采用SPSS 10.0统计分析软件对组间率的差别进行χ2检验，以P<0.05为有统计学意义.2结果2.1组织学观察和免疫组织化学结果32例B细胞非何杰金淋巴瘤免疫组化证实CD20和(或)CD79α阳性， CD3和CD45RO阴性（图1）; 18例T细胞非何杰金淋巴瘤免疫组化证实CD3和(或)CD45RO阳性， CD20和CD79α阴性（图2），支持原来的诊断和分型. 3例未能定性的淋巴组织增生性病变免疫组化标记CD79α阳性， CD3和CD45RO阴性，怀疑为BNHL. 20例良性淋巴组织反应性增生病例CD20，CD79α，CD3，CD45RO均有不同程度的阳性表达.A: CD79а； B: CD20.图1BNHL组织中CD79а和CD20阳性表达（略）A: CD45RO； B: CD3.图2TNHL组织中CD45RO和CD3阳性表达（略）2.2基因重排检测结果2.2.1石蜡组织标本DNA检测PC03，PC04引物对良性增生的淋巴组织以及淋巴瘤组织DNA进行扩增，均见110 bp大小的β球蛋白特异条带（图3）.右侧泳道为100 bp DNA标志物的位置. 1：实验组TNHL. 黄色箭头为110 bp涌动位置;2：实验组BNHL；3：阳性对照TNHL（已知TCRγ重排阳性）；4：阳性对照BNHL（已知IgH重排阳性）；5：反应性增生淋巴组织作为阴性对照.图3PC03/PC04引物PCR扩增结果电泳图（略）2.2.2良性淋巴组织反应性增生病例结果20例良性淋巴组织反应性增生病变组织B细胞和T细胞抗原受体重排均为阴性（图4）.2.2.3阳性对照T，B淋巴瘤检测结果B细胞淋巴瘤阳性对照标本组织B细胞Ig重排阳性（图5）. T细胞淋巴瘤阳性对照标本组织T细胞TCRγ1重排阳性（图6）.右侧泳道为100 bp DNA标志物的位置. 1：IgH FR3A/LJH， FR3A/VLJH引物扩增产物；2：TCRβDb1/Jb2引物扩增产物；3：TCRγ1 TVG/TJX引物扩增产物；4：TCRγ2 Vγ11/Vγ101/Jγ12引物扩增产物； 5：TCRγ3Vγ11/Vγ101/Jp12引物扩增产物. 黄色箭头为110 bp涌动位置.图4良性淋巴组织反应性增生病例PCR扩增结果电泳图（略）左侧泳道为100 bp DNA标志物的位置. 1：内对照PC03/PC04引物扩增产物；2：IgH FR3A/LJH，FR3A/VLJH引物扩增产物；3：TCRβDb1/Jb2引物扩增产物； 4：TCRγ1 TVG/TJX引物扩增产物； 5：TCRγ2 Vγ11/Vγ101/Jγ12引物扩增产物；6：TCRγ3 Vγ11/Vγ101/Jp12引物扩增产物；7：阴性对照FR3A/LJH，FR3A/VLJH引物扩增产物. 黄色箭头为110 bp涌动位置.图5阳性对照BNHL PCR扩增结果电泳图（略）2.2.4淋巴瘤组织检测结果18例T细胞淋巴瘤中TCRγ基因重排为12例，TCRβ基因重排为3例， TCR基因重排阳性率83.3%，与良性组（TCR基因重排均阴性）相比，差异有显著意义(χ2=15.10， P<0.05)；32例B细胞性非何杰金氏淋巴瘤标本中有28例IgH基因重排阳性，其中2例TCRγ基因重排也阳性，基因重排阳性率87.5%，与良性组（IgH基因重排均阴性）相比，差异有显著意义(χ2=25.30， P<0.05).中间泳道为100 bp DNA标志物的位置. 1：TCRβDb1/Jb2引物扩增产物； 2：TCRγ3 Vγ11/Vγ101/Jp12引物扩增产物；3：TCRγ2Vγ11/Vγ101/Jγ12引物扩增产物；4：TCRγ1 TVG/TJX与内对照PC03/PC04引物扩增产物；5：阴性对照TCRγ1 TVG/TJX与内对照PC03/PC04引物扩增产物；6：阴性对照TCRγ2 Vγ11/Vγ101/Jγ12引物扩增产物； 7：阴性对照TCRγ3Vγ11/Vγ101/Jp12引物扩增产物；8：IgH FR3A/LJH，FR3A/VLJH引物扩增产物. 黄色箭头为110 bp涌动位置，红色箭头为190 bp涌动位置，红色箭头为80 bp涌动位置.图6阳性对照TNHL PCR扩增结果电泳图（略）2.2.5未确诊病例检测结果3例未确诊的疑难病例均为IgH基因重排，经FR3A/LJH，FR3A/VLJH引物采用半巢氏PCR扩增后出现95 bp大小IgH阳性条带.3讨论恶性淋巴瘤(malignant lymphoma)是免疫系统的原发性恶性肿瘤，主要发生于淋巴器官和淋巴组织. 淋巴瘤的诊断一直是病理诊断中的难点，部分淋巴组织增生性病变单纯通过HE染色和免疫组化方法很难明确性质，另外NHL种类繁多，分类复杂，给临床病理工作者带来了一定的困难［5］.干细胞在向淋巴细胞分化过程中， Ig重链基因(IgH)和T细胞受体(TCR)基因的可变区(V)和结合区(J)基因会发生重排［6］. 基因重排过程是一个正常的过程，正常淋巴细胞在发育中是多克隆性质，但淋巴造血系统肿瘤所具有的是单克隆性重排，也就是全部肿瘤细胞具有一个相同的免疫球蛋白或TCR 基因重排，即表现为重排基因为单一模式，这对研究淋巴细胞恶变的机制和解决临床的诊断问题都十分重要［6］. 检测单克隆性免疫球蛋白和T细胞受体基因有助于鉴别淋巴系统的肿瘤性和反应性增生，并确定细胞的来源.本研究中18例T细胞淋巴瘤中TCRγ基因重排为12例，TCRβ基因重排为3例， TCR基因重排阳性率83.3%，与Diss等［7］报道的T 细胞淋巴瘤78.2%的检出率相近. 而良性淋巴组织未见克隆性条带， TCR基因重排检出率在TNHL及良性淋巴结反应性增生之间相比，差异有显著意义(P<0.05). 说明TCR基因引物对T细胞性NHL的克隆性确定有重要价值. 32例B细胞性非何杰金氏淋巴瘤标本中有28例IgH基因重排阳性，基因重排阳性率87.5%，与Kros等［8］报道的B细胞淋巴瘤77%的检出率以及国内王萍等［9］报道的B细胞淋巴瘤72 %的检出率相近. 而TNHL及反应性增生均未见IgH克隆性基因重排， IgH基因重排检出率在BNHL及良性淋巴结反应性增生之间相比，差异有显著意义(P<0.05). 说明IgH基因引物对B细胞性NHL的克隆性和细胞源性确定有重要价值，可用于淋巴瘤的诊断和分型.B淋巴细胞产生的抗原受体分子Ig和T淋巴细胞产生的抗原受体分子TCR，其编码基因在细胞的分化过程中均发生重排. 一个T，B细胞或其克隆性后代，均只含一种独特的分子遗传学标记. 大量的实验已证实，淋巴细胞肿瘤源于单克隆性增生. 我们利用特定的引物对其基因进行扩增，当将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时，多克隆淋巴细胞将产生一片弥漫带（见于反应性增生），而单克隆性增殖的淋巴组织则出现一明显条带（见于恶性淋巴瘤）.因此对于淋巴瘤的诊断，首先应依靠形态学检查，并辅以免疫组化结果，对于仍不能明确诊断一小部分病例得，可行基因重排检测，在本研究中有3例较难诊断病例，由于病理HE切片、免疫组化均不能做出明确诊断，通过运用PCR技术对其进行基因重排检测，有IgH的特异性重排条带，提示基因重排的检测对于识别此类交界性及淋巴瘤的早期发现可能具有重要价值.参考文献［1］ Garcia MJ， Delgado BM， Granizo JJ， et al. IgH，TCRγ and TCRβ gene rearrangement in 80 B and Tcell NonHodgkins lymphomas: Study of the association between proliferation and the socalled “A berrant” patterns［J］. Diag Mol Pathol， 2001， 10(2): 69-77.［2］王淑芳，苏勤，朱少君，等．多发性子宫平滑肌瘤的克隆性［J］．中华病理学杂志，2002， 31:107-111.［3］朱少君，苏勤，王淑芳，等. 女性外阴尖锐湿疣的克隆性［J］. 诊断病理学杂志， 2003， 10:81-84.［4］ Lucas DR， Shroyer KR， McCarthy PJ， et al. Desmoid tumor is a clonal cellular proliferation: PCR amplification of HUMARA for analysis of patterns of Xchromosome inactivation［J］. Am J SurgPathol， 1997， 21:306-312.［5］高子芬，潘增刚，裴斐，译. 女性生殖系统. 见: Juan Rosai，ed. 回允中，主译. 阿克曼外科病理学［M］. 8版. 沈阳: 辽宁教育出版社，1999. 1319.［6］朱平. 现代血液肿瘤诊断治疗学［M］ . 北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1998:24-41.［7］ Diss TC， Watts M， Pan LX， et al. The polymerase chain reaction in the demonstration of monoclonality in T cell lymphomas［J］. J Clin Pathol， 1995， 48:1045-1050.［8］ Kros JM， Bagdi EK， Zheng P， et al. Analysis of immunoglobulin H gene rearrangement by polymerase chain reaction in primary central nervous system lymphoma［J］. J Neurosurg， 2002，97:1390-1396.［9］王萍，王瑞年，卢健，等. 非霍奇金淋巴瘤的IgH和TCRδ基因重排［J］. 临床与实验病理学杂志， 2002，18: 21-23.。
基因重排技术在皮肤淋巴增生性疾病中的应用
【 ｅ ｏｄ 】 Ｌ ｍ ｈ ｍ ；Ｒ ｃｐｏ； ｅｅ ｅｒ ｎｅ ｅｔ Ｋ ｙｗ ｒｓ ｙ ｐ ｏ ａ ｅｅｔ Ｇ ｎ ；Ｒ ａｒ ｇｍ ｎ ｒ ａ
ｌ 基 因重 排原理
中的多 基 因 片段 。单 一 基 因 片 段 经 过 选 择 性 编 码 ， 并 由 Ｄ Ａ重排 组 成 功能 性 基 因 。在 Ｂ淋 巴 细 胞 分 Ｎ 化期间， 重链 基 因首选 组 合 ， 若在 一 染 色体 上 重 排 成 功 ， 另一染 色体 上基 因片 段 的重 排 即被 抑 制 ． 则 同时 激 发轻链 ｖ区基 因重排 ； 若重 链 基 因重排 失 败 ， 试 则 图在第 ２个 染 色 体 上 进行 成 功 的重 排 （ 等 位 基 因 即 排除 现象 ）２ Ｌ ］
型 特 征 和 受 体 基 因重排 方 式 。 受 体基 因重排 克 隆性 分析 技 术 为 解 决这 些 问题 提 供 了一 条 途 径 ， 为 辅 助诊 断 的 重要 手段 成
【 关键词 】 淋 巴瘤； 受体 ； 因； 基 重排
中 图 分 类 号 ： ３３ ２ １Ｒ ５ ４ Ｒ ６ ． ： ５７ ． 文献标识码 ： Ａ ｄ ｉ１． ９９ ｊｉ ｎ １０ — ３０ ２ １ ．４ ０ ８ ｏ ： ３ ６／．ｓ ．０ ２ １ １．０ ２ ０ ．０ ０ ｓ
１２ Ｔ Ｒ基 因重排 ． Ｃ Ｔ Ｒ 基 因重 排 是 指 Ｔ细 胞 的 Ｃ
基 因重 排 过 程 是 一 个 正 常 的 过 程 ， 常 淋 巴细 正 胞 在 发育 中是 多克 隆性 质 ， 淋 巴造 血 系 统 肿 瘤 所 但 具有 的是 单 克 隆性 重 排 ， 就 是 全 部 肿 瘤 细 胞 具 有 也 个 相 同的免 疫 球 蛋 白或 Ｔ细 胞 受体 基 因重 排 ． 这
基因测序技术在肿瘤诊断和治疗中的应用
基因测序技术在肿瘤诊断和治疗中的应用近年来，基因测序技术在肿瘤诊断和治疗中的应用逐渐成为研究的热点。
基因测序技术的快速发展为肿瘤的个体化治疗提供了重要的工具，有效地推动了肿瘤精准医学的发展。
本文将探讨基因测序技术在肿瘤诊断和治疗中的应用，并讨论其带来的机遇和挑战。
一、基因测序技术在肿瘤诊断中的应用随着肿瘤发病率的增加，传统的肿瘤诊断方法已经难以满足临床医学的需求。
而基因测序技术的应用为肿瘤诊断带来了新的希望。
通过对肿瘤基因组的测序，可以发现肿瘤基因组的异常变化，从而帮助医生更准确地确定肿瘤类型和分期。
基因测序技术还可以帮助寻找肿瘤相关的遗传突变，为肿瘤患者的个性化治疗提供依据。
二、基因测序技术在肿瘤治疗中的应用1. 靶向治疗靶向治疗是基因测序技术在肿瘤治疗中的一大应用领域。
通过测序分析，可以发现肿瘤细胞中存在的特定基因突变，然后针对这些突变的蛋白或信号通路进行针对性的治疗。
这种个体化的治疗策略可以提高治疗的效果，减少患者的不良反应。
2. 免疫治疗免疫治疗是近年来肿瘤治疗领域的重要突破，而基因测序技术在免疫治疗中的应用使得治疗的效果更加显著。
通过测序分析，可以发现肿瘤细胞中的免疫逃逸机制，从而寻找到合适的免疫治疗靶点。
此外，基因测序技术还可以通过预测肿瘤患者免疫治疗的应答性，从而帮助医生制定更加个体化的治疗方案。
三、基因测序技术在肿瘤诊断和治疗中的机遇与挑战1. 机遇基因测序技术的不断发展为肿瘤诊断和治疗带来了巨大的机遇。
通过对肿瘤基因组的全面测序和分析，可以实现肿瘤的早期诊断和个体化治疗。
此外，基因测序技术的不断降低成本也使得肿瘤基因测序技术更加普及和广泛应用。
2. 挑战随着基因测序技术的广泛应用，也面临着一些挑战。
首先，基因测序技术在临床应用中的标准化和规范化仍然需要进一步完善。
其次，基因测序技术的数据分析和解读也是一个挑战，需要专业的人员和工具支持。
此外，隐私保护和信息安全也是基因测序技术应用中需要重视的问题。
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基因重排检测技术的建立及其在淋巴瘤诊断中的应用(一)
作者：朱少君，李艳红，张伟，王旭霞，巩丽，李爱宁,兰淼
【关键词】淋巴瘤Detectionandclinicalsignificanceofgenerearrangementsindiagnosisoflymph omas
【Abstract】AIM:ToestablishawaytodetectthegenerearrangementsofIgHandTCRandtoas sesstheapplicationofthedetectiontechniqueinthediagnosisofmalignantlym phoma.METHODS:Fiftythreecasesofmalignantlymphomaand20casesofreac tivelymphoidhyperplasiawerechosenformakingtissuesections.GenomicDN Awasextracted,andamplifiedviaPCR.Theproductswereresolvedondenaturin gpolyacrylamidegelsandvisualizedthroughsilverstaining.RESULTS:Generearr angementsofIgHandTCRwerenegativein20casesofreactivelymphoidhyperpl asia.Inallof18casesofTcellnonHodgkinslymphoma(TNHL),generearrangeme ntofTCRγwasfoundin12casesandthatofTCRβwasfoundin3cases,andIgHgene rearrangementwasnotfound.IgHgenerearrangementwasfoundin28casesou tof32casesofBcellNHL(BNHL),in2casesofwhichgenerearrangementsofTCRγa ndIgHwerebothfound.TherewasIgHgenerearrangementin3casesofsuspecte dlymphomas.TherewasaremarkabledifferencebetweenNHLgroupandbenig ngroupingenerearrangment(P0.05).CONCLUSION:Thedetectionofgenerearr angementsofIgHandTCRbyPCRcanbeakindofsubsidiarymeanstodiagnoseth
elymphoproliferativedisease.Particularly,theclonalityshowedintheformalinf ixedandparaffinembeddedsamplesmaybeusefulintheretrospectiveresearch es.
【Keywords】lymphoma;generearrangement;polymerasechainreaction;neoplasm
【摘要】目的：建立基于克隆性分析技术的B和T淋巴细胞产生的抗原受体分子基因重排检测技术，探讨B淋巴细胞免疫球蛋白及T淋巴细胞受体基因重排在恶性淋巴瘤临床诊断中的应用.方法：从组织蜡块中切取组织片5~10张，提取基因组DNA，PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳后银染显示基因重排结果.结果：20例良性淋巴组织反应性增生病例中,淋巴细胞IgH及TCR基因重排均为阴性；18例T细胞非何杰金氏淋巴瘤中TCRγ基因重排12例,TCRβ基因重排3例，未见有IgH基因重排；32例B细胞性非何杰金氏淋巴瘤标本中有28例IgH基因重排阳性,有2例TCRγ和IgH基因重排均阳性；3例未确诊的疑难病例均为IgH 基因重排；IgH及TCR基因重排检出率在淋巴瘤组与良性组之间，差异有显著意义(P0.05).结论：应用PCR法检测B淋巴细胞IgH和T淋巴细胞TCR基因重排可作为淋巴细胞来源的良、恶性病变的一种辅助诊断手段，且适用于石蜡标本以进行回顾性研究.
【关键词】淋巴瘤；基因重排；聚合酶链反应；肿瘤
0引言
恶性淋巴瘤(malignantlymphoma)是免疫系统的原发性恶性肿瘤,主要发
生于淋巴器官和淋巴组织.根据肿瘤的组织结构及细胞学特征可分为何杰金氏病（Hodgkinsdisease,HD）及非何杰金恶性淋巴瘤（nonHodgkinsmalignantlymphoma,NHL），淋巴瘤的诊断一直是病理诊断中的难点，部分淋巴组织增生性病变单纯通过HE和免疫组化很难明确性质，另外NHL由于种类繁多，分类复杂，给临床病理工作者带来了一定的困难.
淋巴细胞从原始的胚系构型到分化成熟,其抗原受体(Ig和TCR)基因通过基因重排而形成有功能的基因.一个T，B细胞或其克隆性后代，均只含一种独特的分子遗传学标记.一旦某一克隆的淋巴细胞发生恶性变化,即可呈现特异的基因重排〔1〕.因此,对基因重排类型进行检测可用于对淋巴细胞增殖性疾病的诊断.此研究拟应用这一手段，探讨淋巴组织增生性病变的性质，并对该技术在恶性淋巴瘤中的诊断价值进行探讨. 1材料和方法
1.1材料53例恶性淋巴瘤标本均来自第四军医大学唐都医院病理科（1995~2005）.其中男性29例（55%），女性24例（45%）；年龄12~76岁，平均年龄44.2岁.所有标本均为福尔马林固定、石蜡包埋组织.其中B细胞非何杰金淋巴瘤32例，T细胞非何杰金淋巴瘤18例，未能定性的淋巴组织增生性病变3例.20例良性淋巴组织反应性增生病例作为阴性对照.所有淋巴瘤病例均在取PCR模板前经临床病理HE和免疫组化标记（B细胞:CD20,CD79α;T细胞:CD3,CD45RO）证实，以确定为相应病例且所取部位确为病变部位，包含有需检测的部分.3例未能定性的淋
巴组织增生性病变怀疑为BNHL(免疫组化标记CD79α阳性),但诊断仍未明确.
1.2方法
1.2.1石蜡包埋组织DNA的提取每例标本制备厚度为4μm的切片6张，贴于载玻片上，常规烤片、二甲苯脱蜡、乙醇冲洗，切片自然干燥.用无菌双面刀片将组织刮入1.5mL的离心管中，按以前的方法〔2-3〕提取基因组DNA.
1.2.2引物合成引物序列由上海生工生物工程技术公司合成.引物序列为:β球蛋白基因内对照PC03：ACACAACTGTGTTCACTAGC，PC04：CAACTTCATCCACGTTCACC；免疫球蛋白基因重排(IgH)FR3A：ACACGGCTGTGTATTACTGT，LJH：TGAGGAGACGGTGACC，VLJH：GTGACCAGGGTACCTTGGCCCCAG；T细胞受体基因重排(TCRβ链和γ链)Db1:CAAAGCTGTAACATTGTGGGGAC，Jb2:AGCACTGTGAGCCTGGTGCC，TVG:AGGGTTGTGTTGGAATCAGG，TJX:CGTCGACAACAAGTGTTGTTCCAC，Vγ11:TCTGGAGTCTATTACTGTGC，Vγ101:CTCACACTCTCACTTC，Jγ12:CAAGTGTTGTTCCACTGCC，Jp12:GTTACTATGAGCTAGTCC.
1.2.3PCR扩增及循环条件PCR扩增在PT200型热循环仪（MJResearch）上进行.反应体系为25μL，含10mmol/LdNTP（GibcoBRL）2μL，10×缓冲液2.5μL，50mmol/LMgCl20.75μL，TaqDNA聚合酶（GibcoBRL）1U，20pmol/L引物1μL，DNA样品1~5μL.IgH基因采用半巢氏PCR扩增:第一轮引物为FR3A和LJH,95℃预变性3min,然后94℃变性40s,62℃退火
50s,72℃延伸40s,共30个循环;最后72℃延伸10min.扩增产物经1∶100稀释后取1μL进行第二轮扩增,引物为FR3A和VLJH,95℃预变性3min,然后94℃变性40s,60℃退火50s,72℃延伸40s,共30个循环;最后72℃延伸10min.FR3A与VLJH扩增产物为100～120bp.
TCRβ和TCRγ采用40个循环,其中TCRγ引物为Vγ11，Vγ101和Jγ12或Vγ11，Vγ101和Jp12的混合物.95℃预变性3min,然后94℃变性40s,56℃退火50s,72℃延伸40s；最后72℃延伸10min.TCRβ扩增产物为65～85bp.TCRγ各组扩增产物在70～200bp不等.
β球蛋白基因引物作为内对照进行扩赠,共40个循环.95℃预变性3min，然后94℃变性40s,60℃退火50s,72℃延伸40s；最后72℃延伸10min.产物长度为110bp.
1.2.4电泳及结果观察琼脂糖凝胶（20g/L）电泳评价扩增效果后，将3μL 产物和等体积的上样缓冲液〔4〕（990mL/L甲酰胺，1g/L溴酚蓝，1g/L 二甲苯青）混匀后加到厚度为0.8mm的聚丙烯酰胺凝胶（100g/L，含尿素8mol/L），应用miniVE系统（AmershamPharmaciaBiotech）泳动8h（80V）.取出后按以前的方法〔2〕银染，分别用UVP凝胶分析系统（UVP,Cambridge，UK）和光学照相记录数据，根据IgH及TCR相应阳性位置判断结果.
1.2.5结果判定阳性结果判定标准：①PCR扩增电泳条带清晰，宽度不大于1mm，边缘锐利；②片段大小与预计范围相符,与期望值相差不超过5bp；③若出现期望值大小之外的其他条带或期望值内出现两条
或以上可接受的条带，应判定为重排阴性.
统计学处理：采用SPSS10.0统计分析软件对组间率的差别进行χ2检验,以P0.05为有统计学意义.。