染色质免疫沉淀(ChIP)技术的难点及应用

染色质免疫沉淀（ChIP）技术的难点及应用

序言

随着人类基因组测序工作的基本完成，功能基因组学的研究逐渐成为研究的热点。而基因表达的调控又是功能基因组学的一个重要研究领域。研究某个蛋白因子的调控功能，可以通过对蛋白活性（激活或抑制其活性），蛋白数量（过表达Overexpression或基因缺陷型Knockout）, 以及蛋白功能（功能缺陷型蛋白Dominant-negative mutation）的控制，影响下游基因的表达，而下游基因的变化又可以通过基因芯片（cDNA Microarray），抑制消减杂交（Suppression Subtractive Hybridization），差异显示RT-PCR等方法进行研究[1]。然而这些方法都无法提供证据证明这些变化是受某个蛋白因子直接调节的，还是间接的其他变化导致的结果。所以，要想提供蛋白因子直接调控的证据，就要直接检测蛋白质-DNA的相互作用。传统的方法包括转录因子结合实验（Transcription Factor Assay），电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay），DNase I 足印法（DNase I footprinting），酵母单杂交系统等。但这些方法都有一定的局限性，不能充分反映生理情况下DNA与蛋白相互作用的真实情况，而且很难捕捉到在染色质水平上基因表达调控的动态瞬时事件[2]。

染色质免疫沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，简称ChIP）是研究体内蛋白质与DNA相互作用的一种技术。它利用抗原抗体反应的特异性，可以真实地反映体内蛋白因子与基因组DNA结合的状况。特别是近年来由于该技术不断的发展和完善，其应用范围已经从研究目的蛋白与已知靶序列间的相互作用，发展到研究目的蛋白与整个基因组的未知序列的相互作用；从研究一个目的蛋白与DNA 的相互作用，发展到研究两个蛋白与DNA共同结合的相互作用；从研究启动子区域的组蛋白的修饰，发展到研究结合在DNA序列上的蛋白复合物。随着对基因功能研究的不断深入，这项技术正越来越多的被应用于科研的各个领域。目前已经有成熟的ChIP试剂盒出售，如Millipore公司提供的EZ-ChIP 试剂盒，使得越来越多的研究者更容易地采用染色质沉淀技术在许多研究领域取得了成功。

ChIP技术的原理

染色质免疫沉淀技术的原理是：在生理状态下把细胞内的DNA与蛋白质交联在一起，通过超声或酶处理将染色质切为小片段后，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来。染色质免疫沉淀技术一般包括细胞固定，染色质断裂，染色质免疫沉淀，交联反应的逆转，DNA 的纯化，以及DNA的鉴定。因为ChIP实验涉及的步骤多，结果的重复性较低，所以对ChIP实验过程的每一步都应设计相应的对照，而且对结果的分析也需要有一定的经验。对于刚刚开始使用ChIP技术的研究人员来说，使用成熟的商品化试剂盒和相关的技术服务会达到事半功倍的效果，比如Millipore 公司的EZ-ChIP试剂盒就是专门为初学者设计的入门产品。下面我们就最基本的实验步骤，实验中的小技巧以及需要注意的问题简单介绍一下。

1. 细胞固定

甲醛能有效的使蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA，蛋白质-RNA交联，形成生物复合体，防止细胞内组分的重新分布。甲醛的交联反应是完全可逆的，便于在后续步骤中对DNA和蛋白质进行分析。交联所用的甲醛终浓度为1%，交联时间通常为5分钟到1个小时，具体时间根据实验而定。值得注意的是，交联时间如果过长，细胞染色质难以用超声波破碎，影响ChIP结果，而且实验材料也容易在离心过程中丢失。交联时间如果过短，则交联不完全，产生假阴性。甲醛的交联反应可被加入的甘氨酸终止。

2. 染色质断裂

的样品。Millipore公司有商品化的Micrococcal Nuclease处理的ChIP试剂盒（EZ-Enzyme）提供。

1. 染色质免疫沉淀

抗体选择：

染色质免疫沉淀所选择的目的蛋白的抗体是ChIP实验成功的关键。因为在蛋白质与染色质交联结合时，抗体的抗原表位可能因为与结合位点的距离太近，不能被抗体识别，所以不能有效地在体内形成免疫沉淀复合物，直接影响ChIP的结果。所以不是所有的抗体都能做ChIP实验的，只有经过ChIP实验验证后的抗体才能确保实验结果的可靠性，比如Millipore公司的ChIP Validated抗体等。

阳性与阴性对照：

在做ChIP实验时，一定要做好实验对照，因为没有对照，很难对实验结果的可靠性进行评估。阳性抗体和阴性抗体对照是最基本的实验对照。阳性抗体通常选择与已知序列相结合的比较保守的蛋白的抗体，常用的包括组蛋白抗体或RNA Polymerase II抗体等。阴性抗体通常选择目的蛋白抗体宿主的IgG 或血清。目的蛋白抗体的结果与阳性抗体和阴性抗体的结果相比较，才能得出正确结论。另外，还应考虑目的蛋白抗体与DNA的非特异性结合的可能，所以通常还会选择一对阴性引物，即目的蛋白肯定不会结合的DNA序列，作为该抗体的阴性对照。最佳的阴性对照引物是在靶序列上游的一段与目的蛋白肯定不能结合的序列。如果目的蛋白没有商品化的适用于染色质免疫沉淀实验的抗体，只有其他用途的抗体时，可以先做蛋白质免疫沉淀（Immunoprecipitation）检测。如果抗体可以成功的沉淀蛋白，再进行染色质免疫沉淀实验的检测。

1. 交联反应的逆转和DNA的纯化

用不含DNase的RNase和Proteinase K，65o C保温6小时逆转交联，经DNA纯化柱回收DNA 或用酚氯仿抽提、乙醇沉淀纯化DNA。DNA纯化柱纯化DNA的质量高，有利于下一步PCR等方法的检测。因为甲醛不仅交联DNA-蛋白质，还交联蛋白质-蛋白质，所以还可以对DNA序列上的蛋白质复合物进行分析。在逆转交联时不使用Proteinase K，然后用丙酮回收有机相中的蛋白质，进行分析。

2. DNA的鉴定

最常用的DNA的鉴定方法是半定量PCR和Real-time PCR。由于启动子区域的序列具有多样性的特点，所以不同的细胞系或不同的动物品系的同一基因的启动子序列有可能不同。而且启动子区域多富含CG的序列，其PCR条件可能需要相应调整。有条件可设计不止一对引物来反复验证ChIP实验的结果（图2）。