_精原干细胞的研究进展_精原干细胞的研究进展

第9卷第4期中华男科学Vol.9No.4 2003年7月N ational Journal of Andrology Jul.2003

#综述#

精原干细胞的研究进展

曾辛综述;徐斯凡审校

(江西医学院生理学教研室,江西南昌330006)

摘要:精原干细胞是具有自我更新和多向分化潜能等特性的多能干细胞,可在自身基因和/或外来信号调节下最终分化为精子,对其研究近年来倍受关注。本文介绍了精原干细胞的富集、初次分选技术,增殖调控因子以及移植技术的研究进展。

关键词:精原干细胞;富集;增殖;移植

中图分类号:R321.1;Q813文献标识码:A文章编号:1009-3591(2003)04-0288-05¹

Advances in the Research of Spermatogonial Stem Cell

Xin ZENG,S-i Fan XU

(Dep ar tment o f Phy siology,Jiangx i Medical College,Nanchang,Jiangx i330006,China)

Abstract:In r ecent years,people have paid more attention to the spermatogonial stem cells that have the capacity for self renewal and multilineage differentiation and produce daug hter cells that can ex pand and differentiate into spermatozoa under the adjustment of self g enes and ex ter nal signal.T his ar ticle reviews recent advances in studies o f enrichment and original selection of the spermato gonial stem cells.T his review also summarizes some control factors in proliferation and transplantation techniques.Natl J Androl,2003,9 (4):288-291,295

Key words:Spermatogonial stem cells;Enr ichment;Proliferation;T r ansplantation.

在哺乳动物成体中存在几套自我更新系统,包括造血系统、精子发生系统、肠上皮和皮肤等,就物种延续而言最重要的莫过于精子发生(spermatog en-esis)。因为它承担着雄性配子的产生和进化所必需的基因传递。青春期启动后,精子发生的过程持续于整个雄性生命,其通过有序而又严格调控的细胞增殖和分化步骤而产生大量的精子,这一系统的基础便是精原干细胞(spermatog onial stem cell)。成体中特定组织干细胞应具备的特点:长期增殖、自我更新和多分化潜能,并对于损伤仍能维持更新的潜能和重新增殖的能力[1]。同样,精原干细胞有着上述的生物学特性。本文就精原干细胞的富集、增殖和移植技术研究概况作简要概述。1精原干细胞的富集

精子发生是起源于精原干细胞而最终导致成熟精子形成的复杂而具生产性的过程。这些干细胞终身具有自我更新的能力,但由于它们在睾丸中的数量极少(2~3/104)和由于它们只有通过功能来鉴定,使得生物学特性的研究变得非常困难。尽管精原干细胞移植技术的发展提供了一个干细胞分析系统,但有效的干细胞富集方法并未获得。Shinohara 等[2]运用多参数选择策略(multiparameter selection strateg y)结合体内患隐睾病的动物睾丸模型和体外荧光激活细胞分选技术(fluorescence-activated cell sorting analysis)进行精原干细胞的富集。将表达

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¹收稿日期:2002-05-24;修回日期:2002-09-03

作者简介:曾辛(1975-),男,江西武宁县人,检验师,硕士研究生,从事生殖生理学专业。E-mail:xzdive@

lacZ的供者睾丸细胞移植入用白消安(一种烷化剂)处理过的4~6周鼠龄的受者精曲小管内,两个月后用解剖显微镜人工数出受体内供体细胞的集落数和用计算机成像系统测量集落面积,最终结果显示得到精原干细胞25倍的富集倍数。应用患隐睾病的动物睾丸模型是基于隐睾环境并不影响干细胞的活动而又消灭了受体睾丸内几乎所有的已分化细胞,相对于极少量富集干细胞的野生型对照组而言,其富集倍数可达25倍,从而为精原干细胞的纯化和特性研究提供了新的重要手段[3]。根据患隐睾病的小鼠睾丸细胞散射光特性和其分子表面表达A6、A v 整合素以及c-kit受体用流式细胞仪荧光激活细胞分选技术对其进行分级分离,结果发现患隐睾病的成鼠睾丸中的精原干细胞没有或很少表达c-kit,同时利用低侧向散射光特性发现精原干细胞没有或很少表达A v整合素却强表达A6整合素。在表达A6整合素的患隐睾病的小鼠睾丸细胞的第二级区域(A6hi SSC l o)显示最大的干细胞活性,该区域中平均集落数可达到41个,其集落面积为27mm2。A6hi SSC l o区域的细胞因为不表达c-kit和A v整合素而大大有利于其富集过程及其结果[2]。由于流式细胞仪荧光激活细胞分选技术其分析量有限且仪器价格昂贵,对于精原干细胞的分选就提出了另一分析系统,即采用免疫磁珠细胞分选系统(m agnetic cell sorting sys-tem)。有研究用该系统分选精原干细胞,收集到的细胞经在含有多克隆抗兔c-kit IgGs的培养液中孵育而标上此多克隆抗体,此后还进行荧光标记,最后通过流式细胞仪分析表明精原干细胞大量的富集且无任何单倍体细胞滞留在磁珠部位,有着极高的分离纯度,回收率也高,与传统的分选方法相比免疫磁珠细胞分选方法是分离精原干细胞的一快速有效的方法[4]。

当然这一过程需要我们首先能识别精原干细胞。Shinohara等[5]利用干细胞与基膜相互关联的相关知识以及他们所构建的精原干细胞移植分析系统来研究它们的表面标志物,结果表明c-kit在胎儿干细胞发展过程中持续表达且极为重要;B1-和A6-整合素是鉴定精原干细胞的表面标志物并提示此两者在精原干细胞表面形成一二聚体。抑制素B是抑制素家族中主要的成员之一,它由1个A亚单位和1个B亚单位组成,Krause等[6]研究结果表明抑制素B在精原干细胞、精母细胞以及早期精子细胞中均有表达,提示抑制素B可能是精原干细胞的标志物之一。Aubry等[7]在胚胎期(8周)生殖腺以及胎儿不同时间点的(15、17和28周)生殖腺中检测到单克隆抗体57B(抗MAGE-A4),该结果提示MAGE-A4可能是生殖干细胞潜在的表面标志物,同时他们的研究结果还提示MAGE-A4可能也是生殖细胞肿瘤潜在的表面标志物。Satie等[8]运用免疫组织化学方法分析健康的胎儿期和成人的睾丸以及59例不同类型的人类睾丸肿瘤的睾丸中NY-ESO-1的表达情况,结果发现NY-ESO-1在从18周到出生为止的胎儿睾丸中,成人睾丸的精原干细胞和初级精母细胞以及睾丸肿瘤的最早期阶段中均有较强的表达,而在其他相关基质细胞中未见表达,从而提示NY-ESO-1可能为精原干细胞的表面标志物之一。

2精原干细胞的增殖

2.1GDNF/FSH通路自我调控作用间质细胞能够分泌许多因子,维持干细胞的增殖,分化和存活。Tadokoro等[9]利用没有生育能力的睾丸模型来研究生殖干细胞自我更新机制,由于缺乏分化能力可消除在自我更新的同时干细胞产生分化成熟的子细胞的干扰,结果发现未分化精原细胞的增殖过程在支持细胞所产生的高浓度胶质细胞衍生的神经营养因子(g lial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)作用下加速进行。同时还发现GDNF浓度的一主要调控子为卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone ,FSH),这些结果表明在哺乳动物睾丸中GDNF/ FSH通路自我调控生殖干细胞的增殖。

2.2干细胞因子和集落刺激因子的调控作用D-i rami等[10]采用富含钾的培养基(a potassium-rich medium derived by the simplex optimization method, KSOM)培养精原干细胞来研究干细胞因子(stem cell factor,SCF)和巨噬细胞集落刺激因子(granulo-cyte macrophage-colony stimulating factor,GM-CSF)对其增殖的作用,用电极板聚集并纯化精原干细胞,即剔除肌细胞和支持细胞的污染,并用免疫组化进行c-kit受体标记。在34e条件下使用KSOM培养基进行培养120h,期间用MTT比色分析仪每隔24 h观察精原干细胞的活力。结果表明在培养基中分别加入rhSCF(浓度不低于100ng/ml)和rhGM-CSF(浓度低于10ng/ml,因为高于此浓度rhGM-CSF的毒副作用会非常明显)均可明显提高干细胞的生存百分比,而两者同时加入培养基并不能进一步提高干细胞的活力,说明两者参与精原干细胞增殖调控过程。SCF的加入引起一系列细胞外信号调控激酶(extracelluar signa-l regulated kinases,ERK)的短暂激活,从而导致细胞周期素D3的重新分布以及激活其相关激酶的活性、细胞周期素E的聚集以

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第4期曾辛等精原干细胞的研究进展