凝胶色谱柱操作上课讲义

凝胶色谱柱操作

凝胶色谱柱操作

1、溶胀

商品凝胶是干燥的颗粒，通常以40~63um的使用最多。凝胶使用前需要在洗脱液中充分溶涨一至数天，如在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温到近沸，则溶涨时间可以缩短到1~2小时。凝胶的溶涨一定要完全，否则会导致色谱柱的不均匀。热溶涨法还可以杀死凝胶中产生的细菌、脱掉凝胶中的气泡。

2、装柱

由于凝胶的分离是靠筛分作用，所以凝胶的填充要求很高，必须要使整个填充柱非常均匀，否则必须重填。凝胶在装柱前，可用水浮选法去除凝胶中的单体、粉末及杂质，并可用真空泵抽气排出凝胶中的气泡。最好购买商品中的玻璃或有机玻璃的凝胶空柱，在柱的两端皆有平整的筛网或筛板。将柱垂直固定，加入少量流动相以排除柱中底端的气泡，在加入一些流动相于柱中约1/4的高度。柱顶部连接一个漏斗，颈直径约为柱颈的一半，然后在搅拌下、缓慢的、均匀地、连续地加入已经脱气的凝胶悬浮液，同时打开色谱柱的毛细管出口，维持适当的流速，凝胶颗粒将逐层水平式上升，在柱中均匀地沉积，直到所需高度位置。最后拆除漏斗，用较小的滤纸片轻轻盖住凝胶床的表面，再用大量洗脱剂将凝胶床洗涤一段时间。

3、柱均匀性检查

凝胶色谱的分离效果主要决定于色谱柱装填得是否均匀，在对样品进行分离之前，对色谱柱必须进行是否均匀的检查。由于凝胶在色谱柱中是半透明的，检查方法可在柱旁放一至于柱平行的日光灯，用肉眼观察柱内是否有“纹路”或气泡。也可向色谱柱内加入有色大分子等，加入物质的分子量应在凝胶柱的分离

范围，如果观察到柱内谱带窄、均匀、平整，即说明色谱柱性能良好；如果色带出现不规则、杂乱、很宽时必须重新装填凝胶柱。

4、上样

凝胶柱装好后，一定要对柱用流动相进行很好的平衡处理，才能上样。凝胶柱的上样也是一个非常重要的因素，总的原则是要使样品柱塞尽量的窄和平整。为了防止样品中的一些沉淀物污染色谱柱，一般在上柱前将样品过滤或离心。样品溶液的浓度应该尽可能的大一些，但如果样品的溶解度与温度有关时，必须将样品适当稀释，并使样品温度与色谱柱的温度一致。当一切都准备好后，这时可打开色谱柱的活塞，让流动相与凝胶床刚好平行，关闭出口。用滴管吸取样品溶液沿柱壁轻轻地加入到色谱柱中，打开流出口，使样品液渗入凝胶床内。当样品液面恰与凝胶床表面平时，再次加入少量的洗脱剂冲洗管壁。重复上述操作及此，每一次的关键是既要使样品恰好全部渗入凝胶床，又不致使凝胶床面干燥而发生裂缝。随后可慢慢地逐步加大洗脱剂的量进行洗脱。整个过程一定要仔细，避免破坏凝胶柱的床层。

5、冲洗

凝胶色谱的流动相一半多采用水或缓冲溶液，少数采用水与一些极性有机溶剂的混合溶液，除此之外，还有个别比较特殊的流动相系统，这要根据溶液分子的性质来决定。加完样品后，可将色谱床与洗脱液贮瓶及收集器相连，设置好一个适宜的流速，就可以定量地分布收集洗脱液。然后根据溶质分子的性质选择光学、化学或生物学的方法进行定性和定量测定。

6、再生

因为在凝胶色谱中凝胶与溶质分子之间原则上不会发生任何作用，因此在一次

分离后用流动相稍加平衡就可以进行下一次的色谱操作。但在实际应用中常有一定的污染物污染凝胶。对已沉积于凝胶床表面的不溶物可把表层凝胶曲调，在适当增补一些新的溶涨胶，并进行重新平衡处理；如果整个柱有微量污染，0.5mo/LlNaCl溶液洗脱。在通常情况下，一根凝胶柱可使用半年之久。

凝胶柱若经多次使用后，其色泽改变，流速降低，表面有污渍等就要对凝胶进行再生处理。凝胶的再生是指用恰当的方法除去凝胶中的污染物，使其恢复其原来的性质。交联葡萄糖凝胶厂用温热的0.5mol/L氢氧化钠和0.5mol/L的氯化钠和混合液浸泡，用水冲洗到中性；而对于聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶由于遇酸碱不稳定，则常用盐溶液浸泡，然后用水冲到中性。

7、保存

经常使用的凝胶以湿态保存为主，为了避免凝胶床染菌，可加少许氯仿、苯酚或硝基苯等化学物质，它可以使色谱柱放置几个月至一年。凝胶的干燥应先对凝胶进行浮选，除去细小的颗粒，并用大量水洗，除去盐和污染物，然后逐步增加一春浓度使凝胶收缩，在60~80度干燥，在整个操作过程中的蒸馏水、器皿和房间必须干净。琼脂糖凝胶的干燥操作比较麻烦，并且干燥后还不容易溶张，所以一般仍以湿态保存为主。

凝胶色谱柱的使用方法

看到很多虫友问葡聚糖凝胶的使用方法，所以将自己的一点经验写下来，以作参考。葡聚糖凝胶柱的使用方法大体有一下步骤：

(1) 预处理称取葡聚糖凝胶（有不同型号）若干克，加入洗脱剂（通常为甲醇或者水，这里以甲醇为例）约20倍凝胶量，置室温下3h进行溶胀，溶胀必须彻底，否则会使上柱后流速变慢，凝胶断裂等。

(2) 装柱凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15。柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧，用洗净的玻璃丝（约200目尼龙布）垫底或购买类似规格的商品柱。然后将柱垂直安装好，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边缓缓连续装入，色谱柱的出口流速m维持在5~10ml/min。(1d为0.05ml，所以要1S两滴）胶颗粒沉积到柱底后关紧色谱柱，等沉降到1-2cm时再2打开色谱柱。直至降到满意高度为止，等凝胶柱内的液体留的与凝胶高度差不多时，用较小的滤纸盖住凝胶床表面，再用洗脱剂洗脱过夜。装柱后的凝胶必须均匀，不能有气泡或明显条纹。否则，必须到出重装。

(3) 加样装好的色谱柱至少要用相当于3倍保留体积的洗脱剂平衡，待洗脱剂流至与凝胶柱液面相平时（不能流干，否则会带入气泡），用滴管吸取样品溶液，在高于凝胶表面约1cm处，沿管壁四周缓缓滴加样品液，加完后打开下面的出口，使样品渗入凝胶内。再关闭出口，用少量洗脱液将管壁残留的样品洗下，再打开出口，至溶液渗入柱内，再关闭出口。可以考虑再加一层薄薄的脱脂棉以保护柱表面（我一般不加），然后即可进行洗脱。

(4) 洗脱与收集洗脱时，用甲醇作洗脱剂，并且要连续不断地进行，使凝胶柱上端保持一定的液层，防止凝胶柱表面的液体流干。一般酸性洗脱剂中碱性物质容易洗脱，碱性洗脱剂中酸性物质容易洗脱。多糖类物质等极性大的物质考虑用水洗脱，常用的洗脱剂是水-甲醇，水-乙醇，水-丙酮等，一般根据自己样品的性质选择洗脱液，洗脱液可一直用单一梯度。凝胶色谱的共性是流速慢，