外源基因的表达检测及遗传特性
外源基因的定位和转录调控分子机制
外源基因的定位和转录调控分子机制随着基因工程技术的不断发展，外源基因的引入和转录调控机制也逐渐成为生物学研究的热点问题之一。
在这个过程中，外源基因的定位和转录调控分子机制就变得至关重要。
本文将从以下几个方面探讨这个问题。
一、外源基因定位的技术手段外源基因的定位是基因工程研究的重要前提。
常见的技术手段有：1. PCR扩增：PCR是一种常用的外源基因定位技术，通过PCR反应，可以从待测样品中扩增出有代表性的DNA序列。
2. Southern印迹：Southern印迹是一种高灵敏度的外源基因定位技术，通过DNA电泳分离和传递等步骤，可以将待测DNA分子固定在膜上，进而对其进行探针杂交和检测。
3. FISH法：FISH法是通过荧光标记外源DNA序列，能够直接标记分子的位置和状态。
该技术具有定位精度高、灵敏度高等优点。
以上三种技术手段可以相互补充，从不同角度确定外源基因的位置和数量。
二、转录调控的机制外源基因的转录调控是基因工程研究的另一个重要方面。
它涉及到各种不同的转录因子、蛋白质和RNA等分子机制。
1.启动子启动子是转录因子、RNA聚合酶、蛋白质等分子参与的转录调控区域。
以轉錄因子增加启动子活性、RNA聚合酶聚到启动子等机制，促进外源基因的转录。
2.核糖体终止与脱落外源基因转录结束后，RNA聚合酶被肌肉卸载或者核糖体终止转录，RNA分子从RNA聚合酶上脱落，达到终止转录的目的。
3. RNA后转录调控RNA嵌合物和mRNA后调节会负责操纵RNA分子的最终结构和功能。
包括RNA剪接、RNA剪枝、RNA修饰等步骤，以改变RNA分子的结构和稳定性，进而影响外源基因的表达。
三、转录因子对外源基因表达的调节转录因子是外源基因转录调控的重要机制之一。
它会绑定到外源基因的启动子区域，增强或减少其转录活性，进而影响外源基因的表达。
目前，已经发现了多种调节类转录因子，可以在外源基因表达时起到重要作用。
其中，常见的转录因子包括激素受体、EGF受体、PPAR受体等。
《2024年转基因阿尔巴斯白绒山羊外源基因沉默相关研究》范文
《转基因阿尔巴斯白绒山羊外源基因沉默相关研究》篇一一、引言随着现代生物技术的迅猛发展，转基因动物作为基因编辑的优良载体，已经逐渐在畜牧养殖、生物医药、科研等多个领域发挥重要作用。
其中，转基因阿尔巴斯白绒山羊以其优秀的繁殖性能和优良的绒毛品质受到了广泛关注。
然而，在转基因过程中，外源基因的稳定表达及其沉默机制却成为了研究的关键问题。
本篇研究论文将深入探讨转基因阿尔巴斯白绒山羊中外源基因沉默的相关问题及其原因，旨在为今后的基因编辑及遗传育种工作提供理论基础和参考依据。
二、外源基因在阿尔巴斯白绒山羊中的表达转基因阿尔巴斯白绒山羊的培育过程中，外源基因的导入是关键步骤之一。
这些外源基因通常被整合到山羊的基因组中，并期望能够稳定表达以实现预期的生物学效应。
然而，在实际操作中，外源基因的表达往往受到多种因素的影响，包括基因本身的特性、整合位点的选择、宿主细胞的反应等。
三、外源基因沉默现象及其机制外源基因沉默是指转基因在宿主细胞中无法正常表达或表达水平显著降低的现象。
这一现象在转基因阿尔巴斯白绒山羊中同样存在，并可能由多种机制引起。
其中，最主要的机制包括甲基化修饰、非编码RNA的调控、宿主免疫系统的识别与清除等。
这些机制可能单独或共同作用，导致外源基因的表达沉默。
四、研究方法与实验设计为了研究转基因阿尔巴斯白绒山羊中外源基因沉默的原因及机制，我们设计了一系列实验。
首先，我们利用分子生物学技术手段，检测外源基因在山羊不同组织中的表达情况。
其次，通过分析基因组的甲基化水平，探讨甲基化修饰对外源基因表达的影响。
此外，我们还利用生物信息学方法，分析非编码RNA的分布及与外源基因的相互作用。
最后，通过建立免疫学模型，研究宿主免疫系统对转基因的识别与清除机制。
五、实验结果与分析经过一系列实验，我们得出了以下结论：1. 外源基因在阿尔巴斯白绒山羊的不同组织中存在表达差异，这可能与基因本身的特性及整合位点的选择有关。
2. 甲基化修饰是导致外源基因沉默的重要机制之一，且在不同组织中存在差异。
转基因植物的遗传特性与表达调控
（4）从头甲基化与沉默机制 A 植物对外源DNA的基因免疫诱导反应； B DNA-DNA配对诱导； C DNA-DNA互作诱导。
4. 克服转基因沉默的策略
(1) 转基因的选择： （2）启动子的选择； （3）利用组织和发育特异性作用的增强子 （4）利用MAR序列； （5）利用位置特异性重组系统； （6）选择单拷贝的转化体。
E 交叉相连的DNA链经旋转形成Holliday中间体； F Holliday中间体分枝迁移数个碱基后，另一条链再断裂并与对方的 断裂链重组，这时就完成重组，实现了交换。
（3）位点特异性重组在转基因整合遗传特性研究中的应用
A 控制转基因整合的拷贝数；
B 可导入多个基因进入植物基因组； C 使目标基因重排；
在44个转KM抗性基因的烟草中，通过转基因植株自交、转化与非转化杂 交、转化株杂交进行分析，发现35个无性系包含一个单位点插入KM抗性基 因，其余5个为两位点插入，且观察到双位点插入导致自交后代中出现隐形 致死突变。 多基因转化植株后代分离规律与其整合特性密切相关，多基因连锁形式整 合到一个位点，其符合单基因的孟德尔式分离规律；如分别整合到不同位点， 那么每个基因的分离符合孟德尔式规律，各个基因间不影响。
（2）转录水平的基因沉默 A 转基因及其启动子甲基化； B多拷贝重复基因序列引起的转录水平基因沉默； C 同源基因间的反式失活； D 转基因位置效应引起的转基因沉默； E 染色体包装对转基因沉默的影响； F 后成修饰作用导致转基因沉默。
（3）转录后水平的转基因沉默
A 生化开关模型；
B 异常RNA模型；
当两个loxP基因座方向相同，Cre介导的反应造成loxP基因座之间的 DNA被删除，loxP基因座方向相反，Cre介导使两端携带loxP的片段发 生倒位，如果loxP 不在同一DNA分子，如一个在质粒上，另一个在染 色体上，那么Cre酶可使质粒DNA整合到染色体loxP所在位置，实现定 点重组。
外源基因的表达
•Ⅱ型启动子
Ⅱ型启动子所属基因绝大多数编码蛋白质。
转录起始位点
TATA框（Hogness框）：富含AT的保守序列区，它 启动子 与DNA双链的解链有关，并决定转录起始点的选择。 基本区 其中心点位于转录起始点上游－20～－30bp的位置。 CAAT框：位于转录起始位点上游－75bp处，与RNA 聚合酶的结合有关。 GC框：位于转录起始位点上游－100～－300bp处， 与转录因子的结合有关。
s factor:
6.2.1.4 启动子的分离
随机克隆法 聚合酶保护法 过滤膜结合法 PCR扩增法
6.2.2 增强子
增强子（enhancer）：是能够增强启动子转录活性的DNA 顺式作用序列，又称强化子。 增强子的特性：
双向性。
重复序列。 增强子行使功能与所处的位置无关。
特异性。
增强子不仅与同源基因相连时有调控功能，与异 源基因相连时也有功能。
序列特异性
*启动子的特征 方向性 位置特性 种属特异性
6.2.1.1 原核生物的启动子
•转录起始位点：大多数细菌启动子转录起始区的序列为 CAT，转录从第二个碱基开始，该碱基为嘌呤碱基 （A/G）。 •Pribnow框： －10bp处的TATA区，又称－10序列区。 •Sextama框： －35bp处的TTGACA区，又称－35区。 •间隔区：内部无明显的保守性，其序列的碱基组成对启 动子的功能不十分重要，但其长度却是影响启动子功能的 重要因素。
6.1.3 外源基因mRNA的有效翻译
外源基因mRNA有效翻译必须考虑的基本原则：
AUG(ATG)是首选的起始密码子。
SD序列为与核糖体16S rRNA互补结合的位点，该序 列至少含有AGGAGG序列中的4个碱基。
转基因植物的遗传特性与表达调控
3、转化后整合位点的DNA结构变化
保持整合外源基因的完整性是实现转基因功能表达的基本条件，外源
基因整合后的完整性与其结构变化有关，现已明确，外源基因作为侵入 者的整合，会引起不同程度的基因重排，涉及缺失、异位、倒位及重复 等一系列现象。这主要与细胞本身的重复和修复功能有关。
Mayerhofer等（1991）和Gheysen等（1991）对15个独立的T-DNA插 入进行了研究，提出了外源DNA整合模型， 他们认为： （1）T-DNA的插入不会引起植物DNA大的重排，但在T-DNA的两侧各出 现了一个158bp的正向重复序列，且多数插入会导致靶位点处小的缺失， 最多79个核苷酸； （2）在T-DNA和植物DNA连接处常有几个至33个核苷酸的填充DNA， 这些填充序列与靠近连接处的植物DNA序列相似； （3）在靶位点处不要求有特异的序列，但若T-DNA两端与植物靶位点之 间有一段短序列（5-10bp）同源，则可能对T-DNA整合进植物基因组其 作用。
（2）整合拷贝数：许多研究表明，外源DNA的插入拷贝数有以下几种：单 拷贝单位点插入；串联多拷贝单位点插入；多拷贝多位点插入，多数情况 是以单拷贝在单位点整合，但在同一位点，也存在较多的多个拷贝串联整 合的情况。形式为头对尾式串联和头对头式串联。农杆菌转化和基因直接 转化整合拷贝数存在差异，前者拷贝数少，整合位点特异性强。
此外，插入植物染色体的外源DNA大小是有限制的，如油菜插入外源 DNA为5-6Kb，烟草中最大可达9Kb，但频率较低。
4、转化方法对整合外源基因结构的影响
尽管转化方法较多，但外源DNA以两种分子形式转化，一种是外源 DNA插入T-DNA质粒载体中导入；另一种是裸露的DNA分子直接导入， 由于转化原理不同，因此与整合后的外源DNA结构必然存在直接关系。 （1）T-DNA转化的外源DNA结构变化
实验九 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和降解物阻遏作用
实验九外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和降解物阻遏作用【实验目的】1.了解外源基因在原核细胞中表达的基础理论。
2.掌握乳糖操纵子的调节机制和操作方法。
【实验原理】1.外源基因在原核细胞中的表达蛋白质通常是研究的最终目标，因此蛋白质的表达在基因工程中占有非常重要的地位。
常用的表达系统有原核细胞和真核细胞。
原核细胞表达系统主要使用大肠杆菌，真核细胞表达系统主要有酵母细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。
这些表达系统各有优缺点，应根据实验目的和实验室条件加以选择。
本实验主要介绍以大肠杆菌为代表的原核细胞表达系统。
（1）大肠杆菌表达系统的特点：生物学特性和遗传背景清楚，易于操作；已开发较多的克隆载体可供选择；容易获得大量的外源蛋白（外源蛋白可占细菌总蛋白50％左右）。
（2）蛋白质在原核细胞中的表达特点：原核细胞有其固有的RNA聚合酶，识别原核基因的启动子。
因此，在用原核细胞表达目的基因（无论是真核基因还是原核基因）时，一般应使用原核启动子。
原核基因的mRNA含有SD序列，启动蛋白质的合成。
而在真核基因上则缺乏该序列。
因此，一些商品化原核表达载体上设计有SD序列，以方便真核基因的表达。
原核细胞没有mRNA转录后加工的能力。
因此，在原核细胞中表达真核基因时，应使用cDNA 为目的基因。
原核细胞缺乏真核细胞对蛋白质进行翻译后加工的能力。
如表达产物的功能和蛋白质的糖基化、高级结构的正确折叠有关，必须慎重使用原核表达系统。
外源基因在大肠杆菌中高效表达时，表达产物往往在胞浆聚集，形成均一密度的包涵体。
包涵体的形成有利于保护表达产物不被胞内的蛋白酶降解，而且可以通过包涵体和胞内其他蛋白质密度不同来纯化包涵体蛋白。
但包涵体蛋白不具有该蛋白的所有生物学活性，往往需要通过变性复性的方法恢复活性，有时只能回复部分活性。
（3）蛋白质在原核细胞表达的调控启动子是转录水平调控的主要因素。
根据启动子起始mRNA合成效率的不同，可分为强、弱启动子，但是启动子的强弱是相对于不同基因而言的。
第七八章-外源基因的表达及其优化策略20201112
略 稳定性 翻 译 的
培养基 环境因素对 受体菌生长 的影响
终止
诱导时间和
密码子
诱导剂量
的选择
第三节 外源基因在真核细胞中的表达
一 、真核生物基因表达与调控的特点
一 、真核生物基因表达与调控的特点
二 、真核生物基因表达载体的组成特征
基因组DNA的存在形式可影响基因表达 原核DNA序列
转录与翻译不偶联
启动子
调控是多层次的 具有组织和细胞类型特异性
增强子 终止子 内含子 选择标记基因，
对信号分子反应不同
PloyA加尾信号
第三节 外源基因在真核细胞中的表达
二、真核生物基因表达载体的组成特征
第三节 外源基因在真核细胞中的表达
根据启动子的功能和作用方式不同，真核基因的表达载体 的启动子可以分为几种类型，每一种类型的优缺点是什么？ 三、真核表达的受体系统 按照宿主细胞的不同，常用外源基因的真核受体系统可大 致分为酵母、职务、昆虫和哺乳动物等受体系统。 每种受体的系统的特征如下表：
原核生物基因表达一般以操纵子为单位 启动子特征：作用要强；必须表现最低水平的基础转录活性；启动
子具有简便和廉价的可诱导性
原核生物只有一种RNA聚合酶，识别原 特征：SD序列与起始密码子的间距对翻译起始效率影响较大；
核生物的启动子，催化所有RNA的合成 mRNA-rRNA的互补区域越长，基因翻译的概率越大；SD序列与起始
第八章 外源基因表达产物的分离纯化
四 、合适分离纯化介质的选择 1 、分离纯化蛋白质的材料 理想的蛋白质分离纯化应具有以下几个方面的性质： 对目标蛋白具有较高的分离效率；在分离纯化过程中不 会造成目标蛋白的变性；化学性能和机械性能稳定，重 复性好；价格低廉，成本低。
外源基因在植物种子中的表达与遗传稳定性研究
外源基因在植物种子中的表达与遗传稳定性研究基因编辑技术的兴起引发了对外源基因在植物种子中表达与遗传稳定性的研究。
外源基因可通过基因编辑技术、转基因等方式引入植物中，从而改变植物的性状。
然而，外源基因的遗传稳定性对植物的遗传改良和技术应用具有重要意义。
本文将从表达稳定性、遗传转移趋势两个方面综述外源基因在植物种子中的表达与遗传稳定性研究。
一、表达稳定性表达稳定性是指外源基因在植物种子中的表达程度是否稳定不变。
以水稻为例，Leone等人通过RT-qPCR测定外源基因Bar在各代间的表达水平差异。
结果表明，通过离子束转化的Bar基因在各个世代中表达相对稳定，但存在一定的浮动范围。
另一方面，通过农杆菌介导的转化方式表达的外源基因在各代间存在显著的表达变异。
这说明不同的转化方式对外源基因的稳定性有不同的影响。
表达稳定性还受到植物材料、生长条件、检测方法等多方面因素的影响。
例如，不同部位的种子含有不同程度的外源基因表达差异；温度、湿度等环境条件也会影响外源基因的表达。
此外，基因的检测方法和转录后调控机制也会对表达稳定性产生影响。
二、遗传转移趋势遗传转移趋势是指外源基因在不同世代间的遗传转移概率。
外源基因引入植物后，如果能够成功地遗传给后代，就可以达到遗传改良的目的。
研究表明，外源基因的遗传稳定性与植物的自然杂交、转基因品种与自然种群接触等因素密切相关。
特别是在转基因品种与自然种群接触时，外源基因的遗传转移率会更高。
然而，没有进一步的分析与控制，外源基因的转移概率可能过高，导致环境风险、生态安全等问题。
因此，控制外源基因在植物种子中的转移趋势是一个关键的问题。
有研究表明，结构稳定的转基因植物对外源基因的遗传稳定性更高。
建立基于DNA重组和基因编辑技术的高效分子标记技术，有助于对外源基因在植物中的遗传转移进行监控和控制。
结论外源基因在植物种子中的表达稳定性和遗传转移趋势是遗传改良和技术应用中的重要问题。
表达稳定性受到多种因素的影响，在转化方式、材料、环境、检测等方面的调控有助于提高表达稳定性。
实验四外源基因的多重PCR检测
产物鉴定
通过测序或限制性酶切的 方法对PCR产物进行鉴定， 验证是否为外源基因。
05 实验结果与分析
多重pcr产物的电泳分析
总结词
通过电泳分析，可以观察到清晰的条带，表明多重pcr产物的 大小与预期相符。
详细描述
通过琼脂糖凝胶电泳，我们可以看到在预期的分子量范围内 ，有多条清晰的条带出现。这些条带的亮度较高，说明pcr产 物量较大。此外，条带没有出现弥散，说明pcr产物较为纯净 ，没有出现非特异性扩增。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
对未来研究的建议与展望
01 02 03 04
深入研究多重pcr检测的原理和机制，提高检测的灵敏度和特异性。
开发更多针对不同外源基因的多重pcr检测方法，扩大应用范围。
加强多重pcr检测在实际应用中的验证和评估，提高其在实践中的可 靠性。
加强与其他相关技术的结合，如测序技术、生物信息学等，以实现更 全面、深入的研究和应用。
实验四外源基因的多重pcr检测
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验材料 • 实验步骤 • 实验结果与分析 • 结论与展望
01 实验目的
理解多重pcr检测的原理
总结词：深入理解
详细描述：多重pcr检测基于聚合酶链式反应（pcr）技术，通过一对或多对引物， 在体外快速扩增特定的DNA片段。在反应过程中，引物与模板DNA结合，经过一系 列的变性、退火和延伸步骤，实现DNA的扩增。
02 实验原理
多重pcr检测的概述
定义
多重PCR是一种在单个反应中同时扩增多个DNA片段的聚合酶链 式反应。
优点
提高实验效率，减少实验成本和时间，同时检测多个基因或DNA 片段。
外源基因在真核细胞中的表达
（1）新霉素磷酸转移酶（氨基葡萄糖苷磷酸转移酶， neomycin phosphotransferase Ⅱ, NptⅡ）
Npt Ⅱ 基因表达产生的酶可催化许多氨基葡萄糖苷类抗生 素（如新霉素，庆大霉素，卡那霉素和G-418）的O-磷酸化， 使抗生素失去对细胞的毒性，这是由于磷酸化的抗生素不能 与植物细胞叶绿体和线粒体中的核糖体30S亚基结合，进一步 影响70S起始复合体合成，干扰线粒体和叶绿体的蛋白质生物 合成，使植物细胞最终死亡，因此，与外源基因结合的Npt基 因转化细胞后，就可在含有抗生素的培养基上存活下来。
gfp基因是从维多利亚水母中分离纯化的一种可以发出绿
色荧光的物质。GFP为238个氨基酸的小蛋白，发色团能吸 收可见光而发射荧光，用荧光显微镜可检测到GFP产生的绿 色荧光。GFP检测不需要添加任何底物或辅助因子，不使用 同位素，不需要测定酶的活性等优点，且在原核和真核生 物中都能表达，表达产物对细胞无毒性。
外源基因在真核生物细胞中的表达，对于分
子生物学理论研究，对真核生物基因表达调控的
探讨提供了其他试验方法难以达到的有力手段。
外源基因如何才能转入真核细胞？又如何能
从数量庞大的细胞群体中筛选出遗传转化的细胞？
又是如何对转化的真核生物进行鉴定？
一、选择标记基因和报告基因：
1. 基因转化的选择标记
选择标记一般是一种基因，即选择标记基因，他在转化 前与待转化外源基因相连接，当把已转化和未转化的细胞 群体臵于加有选择剂的（抗生素）的培养基上进行培养时， 已转化的细胞群体或再生植株由于带有选择标记基因，该 基因的产物---酶能分解培养基中加入的选择剂，因此，转 化细胞对选择剂具有抵抗能力，不受选择剂毒害而正常地 生长，发育。相反未转化细胞或再生植株受培养基中选择 剂的毒害，而不能存活下来而被淘汰。
转基因小鼠中外源基因遗传及表达稳定性的研究
按 文献 ［］ 实验 步骤 和方 法进 行 。 ２的
１ ５ 外 源 基 因 完 整 性 的 鉴 定 ．
Ｈ
Ｎ
表 达 取 决 于 它 的 整 合 位 点 ， 于 整 合 位 置 的 不 同 ， 用 相 同 由 使
表 达 载 体 获 得 的 转 基 因 动 物 中 外 源 基 因 的 表 达 量 可 相 差 许
进 入 循 环 。 循 环 条 件 为 ９ ￣ 性 ６ ｓ５ ４ Ｃ变 ０ ，７ Ｃ退 火 ４ ｓ ７ ￣ ｏ ５ ， ２Ｃ延
多 倍 。由于 外源 基 因是整 合于转 基 因动 物 的染色 体上 ， 此 因 可 以 遗 传 给 后 代 ， 果 它 能 够 稳 定 地 遗 传 和 表 达 ， 么 将 高 如 那
Ｔ ｑ酶 购 自 Ｔ Ｋ Ｒ ａ ａ ａ ａ公 司 ； ＬＳ 显 色 底 物 Ｔ Ｅ ＩＡ ＭＢ 购 自 Ｒ ｃｅ 司 ； ｏｈ 公 鼠抗 人 ＦＸ 单 克 隆 抗 体 ３ ６ 由 日 本 奈 良 医 学 院 Ｉ Ａ
５ ５
Ａ ＴＧＧＴＡ ＡＴＡＣ ３
Ｙ ｓｉ ａ 士 惠 赠 ； 抗 人 ＦＸ 抗 体 及 Ｈ Ｐ 标 记 的 羊 抗 兔 ｏｈｏ 博 ｋ 兔 Ｉ Ｒ
制备 ｈＩ ＦＸ转 基 因 小 鼠 所 使 用 的 乳 腺 特 异 表 达 载 体 以 前 已经 过 测 序 ， 们 在 该 载 体 上 设 计 了 ７对 Ｐ Ｒ 引 物 （ 彩 版 我 Ｃ 见 图 １ 对 所 有 原 代 及 子 代 转 基 因 小 鼠 的 外 源 基 因 完 整 性 进 行 ） 检 测 ， 些 引 物 覆 盖 了 载 体 中 启 动 子 和 外 源 基 因 的 全 部 序 这 列 ， 物 的 序 列 见 表 ｌ 扩 增 条 件 为 ９ ℃ 预 变 性 ５ ｎ 而 后 引 。 ４ ｍｉ，
《基因工程赋予生物新的遗传特性》第2课时示范公开课教学课件【高中生物浙科版(新课标)】
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
4．作用结果
EcoR Ⅰ
EcoR Ⅰ
催化形成磷酸二酯键。
连接酶
二、DNA连接酶——“分子缝合针”
学生活动1
每小组领两段不同颜色的DNA分子序列，依照图4-1中EcoR I
限制酶的特点，找到它的识别序列，并在特定的位点对两段DNA
课堂检测
3．质粒是基因工程中最常用的载体，其主要特点是（ C ）
①能自主复制 ②不能自主复制 ③结构简单 ④是蛋白质 ⑤是环状 RNA ⑥是环状DNA ⑦能“友好”地“借居”
A．①③Байду номын сангаас⑦
B．①④⑥
C．①③⑥⑦
D．②③⑥⑦
敬请各 位老 师提 出宝 贵意见 ！
课堂小结
学生活动1
比较与DNA有关的几种常见酶
项目 底物 部位 作用 特点
限制酶 DNA分子
磷酸二酯键
DNA连接酶 DNA分子
磷酸二酯键
切割目的基因及质粒 载体，识别特定核苷 酸序列，切开特定部 位的磷酸二酯键
将 双 链 DNA 片段“缝合” 起来，恢复磷 酸二酯键
DNA聚合酶 脱氧核苷酸
磷酸二酯键
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
拓展1
限制酶存在于原核生物中，主要的作用是什么？ 原核生物易受自然界外源DNA入侵，生物在长期的进化过程 中形成了一套完善的防御机制，限制酶就是它的一种防御性工具。 当外源DNA入侵时，它会利用限制酶将外源DNA切割掉，使 之失效，从而保护自身的安全。
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
2．来源 主要从原核生物中分离纯化出来的。
一、限制性内切核酸酶——“分子手术刀”
第十章外源基因表达和基因工程药物
（二）顺式作用原件（启动子、增强子和沉默子） 直接影响基因表达活性 （三）转录因子的调控 （四）真核生物在转录后仍可控制mRNA的结构和 功能，其在转录后层次不同于原核生物
目标蛋白性质
是否需要糖基化
三维结构复杂程度
是
否
简单结构
真核表达 系统
原核表达 系统
复杂的三维结构
• 目的：针对难以或无法从自然界直接提取、 分离、纯化所获得的，或制造成本、产量 规模等受限制的，或利用化学方法无法合 成的多肽，蛋白质、酶这类生物分子药物， 利用细胞或组织或器官或生命体的复制、 转录、翻译及其调控系统以及翻译后加工、 修饰等体系，按人的意愿生物合成这些生 物分子，并从中将表达产物分离纯化至预 期程度，最终加工成药品。
测序；表达图谱 4. 法医—犯罪现场标本分析 5. 肿瘤—各种肿瘤检测 6. 其他……
二、目的基因与表达载体的重组
• 重组载体的构建：对目的基因和载体DNA 进行剪切、修饰，在连接酶的作用下连接 形成完整有复制能力的重组体。
（一）载体
• 对于外源基因的表达，第二个问题就是选 择合适的表达载体并将目的基因重组至表 达载体上。
第十章外源基因表达与基 因工程药物
第一节 概 述
• 外源基因的表达：利用细胞内相关酶系及其调控 系统，将外源基因转录成肽链或加工成活性蛋白 质的过程。
• 具体的说，利用分子生物学技术，在体外将编码 外源蛋白质的基因重组至适宜的表达载体上，通 过相关技术将其导入宿主细胞内，借助宿主细胞 的转录、翻译或翻译后修饰酶系及相应的调控系 统，在宿主细胞合成或分泌具有原有生物活性的 蛋白质。
• 目的基因和载体DNA分子的体外重组关键 在于：选择合适的重组位点、剪切位点； 以及剪切后适当的条件将目的基因和载体 DNA分子连接获得重组分子。
遗传学实验
遗传学实验引言遗传学是研究遗传原理和规律的科学，通过实验可以帮助我们更好地理解和应用遗传学的知识。
本文将介绍几个常见的遗传学实验，并详细讨论实验的步骤和结果。
实验一：显性遗传实验实验目的通过观察后代表现形状确定亲代基因表达方式。
实验步骤1.选取一对昆虫作为实验对象，确保它们具有不同的表现形状。
例如，可以选择黑色翅膀的昆虫A和白色翅膀的昆虫B。
2.让昆虫A和昆虫B进行交配。
3.观察并记录交配后代的表现形状。
实验结果根据观察结果，如果后代中出现了黑色翅膀的昆虫，说明黑色翅膀是昆虫A的显性基因；如果后代全是白色翅膀的昆虫，说明黑色翅膀是昆虫B的隐性基因。
实验二：基因突变实验实验目的检测和观察基因突变对个体表现的影响。
实验步骤1.选择一种含有某个基因的生物作为实验对象。
2.通过诱变剂处理生物体，诱发基因突变。
3.观察和记录突变个体与正常个体的差异。
实验结果根据观察结果，突变个体与正常个体在某些性状上会有明显的差异。
这些差异可以帮助我们了解基因的功能和作用。
实验三：基因型分析实验实验目的通过遗传标记和DNA分析来判断个体的基因型。
实验步骤1.提取个体的DNA样本。
2.选择适当的遗传标记进行PCR扩增。
3.将扩增产物进行电泳分析，观察带型。
4.与已知基因型的样本进行比对，判断个体的基因型。
实验结果通过电泳分析，我们可以得到个体的基因型。
这对于遗传研究和疾病诊断非常重要。
实验四：基因转导实验实验目的通过将外源基因导入细胞中，研究基因的功能和调控机制。
实验步骤1.选择目标细胞，如细菌或植物细胞。
2.构建外源基因的载体。
3.将载体导入目标细胞。
4.观察和记录导入细胞中外源基因的表达情况。
实验结果通过观察外源基因在目标细胞中的表达情况，我们可以了解基因的调控机制，并进一步应用于基因工程和农业生产。
结论遗传学实验是研究遗传学的重要手段，通过实验可以帮助我们更好地理解遗传原理和基因的功能。
本文介绍了显性遗传实验、基因突变实验、基因型分析实验和基因转导实验的步骤和结果。
外源基因在转基因生物中的遗传稳定性研究
外源基因在转基因生物中的遗传稳定性研究随着现代生物技术的飞速发展，转基因技术已经被广泛应用于食品、化妆品、医药以及农业等领域中。
转基因生物是指利用DNA重组技术将外源基因导入宿主细胞而形成的新生物。
外源基因的导入使得转基因生物具有了新的性状和特征，从而拓展了其应用领域。
然而，在实际应用中，外源基因在转基因生物中的遗传稳定性问题一直是一个备受关注和争议的话题。
外源基因在转基因生物中的遗传稳定性问题主要包括两个方面：一是外源基因在转基因生物中的表达稳定性问题，二是外源基因在转基因生物世代遗传稳定性问题。
首先，外源基因在转基因生物中的表达稳定性问题是指外源基因在转基因生物中是否能够持续地表达出其应该具有的功能。
外源基因的表达稳定性是转基因生物具有新特征的重要前提。
一旦外源基因的表达失效，转基因生物的特征也会受到影响。
因此，转基因生物外源基因的表达稳定性是一个十分关键的问题。
遗传稳定性是表达稳定性的一个重要方面。
遗传稳定性是指转基因生物在繁殖过程中是否能够保持其遗传信息的稳定性。
如果外源基因在转基因生物的繁殖过程中出现了不确定性的变异，那么将会影响其下一代的特征和应用效果。
因此，外源基因在转基因生物中的遗传稳定性问题对于转基因生物的应用安全和长期应用效果具有重要影响。
其次，外源基因在转基因生物世代遗传稳定性问题是指在转基因生物的繁殖和后代中，外源基因是否能够保持稳定。
这是由于在转基因生物的繁殖和后代中，外源基因可能会发生随机变异和重组，从而影响其稳定性。
如果外源基因在转基因生物的各个世代中出现了不确定性的遗传行为，那么将会影响其下一代的特征和应用效果。
为了探究外源基因在转基因生物中的遗传稳定性问题，许多科学家进行了一系列的研究。
有研究表明，在转基因植物的繁殖过程中，外源基因可能会出现随机变异和重组，从而影响其遗传稳定性。
这些突变可能会增加或降低外源基因的表达，或者引起新的表达或功能。
而有些研究，则提出了一些关于提高转基因生物遗传稳定性的方法。
外源基因的表达、检测及遗传特性
（3）植物总DNA提取时常遇到的问题
1.植物材料中含有较多的多酚类物质，使DNA呈褐色。
解决办法：提高CTAB提取缓冲液中巯基乙醇的含量
或在SDS提取液中加入6%的PVP（聚乙烯吡咯烷 酮）。
2.植物细胞壁难以破碎。
解决办法：在SDS提取液中加入蛋白酶K，在液氮冷 冻条件下研磨。
2.植物DNA样品纯度及浓度的鉴定
（2）Nos和Oct启动子
来自与根癌农杆菌Ti质粒的胭脂碱合 成酶基因和章鱼碱合成酶基因，具有与植 物基因相似的序列。
2. 组织特异性启动子
也称为器官特异性启动子，在这类启动子的调 控下，基因的表达往往只发生在某些特定的器官或 组织部位，并往往表现出发育调节的特性。这种特 异性通常以特定的组织细胞结构和化学物理信号为 存在的基础。典型的组织特异性启动子有：马铃薯 块茎蛋白基因启动子；小麦胚乳特异表达的ADP-葡 萄糖焦磷酸化酶基因启动子；番茄果实成熟特异性 表达的多聚半乳糖醛酸酶基因启动子；花粉特异表 达基因（lat52）启动子和木质部特异表达的苯丙氨 酸脂肪酶基因（pal）启动子等。
如以5-氮胞嘧啶核苷取代胞苷，诱导消 除甲基化修饰，可使基因激活。
2. DNA甲基化在转基因植物中的作用
众多实验表明， DNA甲基化严重 影响外源基因在转基因植物中的表达 水平。
第四节 提高转化外源基因表达的策略
一、克服转化外源基因失活的策略 1.筛选单拷贝转基因株系； 2.核基质附着区的使用； 3.诱导型表达启动子的使用； 4.基因DNA序列的改造。 二、启动子、增强子、终止子、内含子、5’和3’ 端调控序列的使用 三、优化先导序列，提高翻译效率
（2）DNA已整合到植物基因组中；
（3）能够传递给后代，并符合分离规律。
外源DNA在细胞中的转移和表达
外源DNA在细胞中的转移和表达随着科技的不断发展，我们对基因组的研究越来越深入。
在研究过程中，我们发现外源DNA的转移和表达对于生物的遗传特征和功能有着深远的影响。
本文将探讨外源DNA在细胞中的转移和表达的相关问题。
一、外源DNA的转移外源DNA指的是与受体生物个体基因组不同来源的DNA。
它主要通过三种方式转移：共轭转移、转化和病毒感染。
1.共轭转移共轭转移是指某些细菌通过细胞接触传递质粒来进行外源DNA的转移。
质粒是一种环形DNA分子，存在于细胞质中。
质粒常常拥有一个带有选择性抗性基因的繁殖元件，其可以使细胞对抗多种抗生素的攻击。
共轭转移是一种有目的的方式，它使得受体个体获得了不同的基因信息，从而增强了生命体对环境的适应能力。
2.转化转化是指细菌在自然环境中吸收外源DNA的过程。
在自然环境中，有许多细菌死亡，并释放出它们的DNA。
这些DNA被其他细菌吸收并整合到自己的基因组中。
这个过程被称为“自然转化”。
3.病毒感染有些病毒会把它们的DNA复制到细胞中。
这些病毒被称为“转座子”。
转座子能够整合到基因组的一个特定位置上，并且能够激活或关闭其他基因。
这种方式是一种被动的转移，但是病毒感染也可以改变个体的生物遗传特征。
二、外源DNA的表达外源DNA被转移到受体个体后，在细胞中，需要进一步经过转录和翻译等过程才能表现出来。
外源DNA在受体个体中的表达三种方式：转录、翻译和蛋白质修饰。
1.转录转录是指DNA信息通过RNA分子传递到蛋白质的生物合成过程。
外源DNA在受体个体中的转录，需要使用特殊的酶来“阅读”DNA序列。
这些酶负责转录DNA，把它们转化成类似于RNA的分子。
这种方式被称为“反转录”。
反转录发生在病毒、反转录病原体和外来基因的转染过程中。
2.翻译翻译是指RNA指导的蛋白质骨架的合成过程。
外源DNA被转录为mRNA后，mRNA要到核外才能被翻译成蛋白质。
在核外，mRNA被翻译成蛋白质，然后该蛋白质在细胞中被修改，最终形成目标蛋白质。
基因诊断
基因诊断Gene diagnosis第一节概述⏹基因变异致病可分为两种主要类型⏹1 内源基因的变异：由于先天遗传背景的差异和后天内、外环境的影响，人类的基因结构及其表达的各个环节都可能发生异常，从而导致疾病。
⏹2 外源基因的入侵：如各种病原体感染人体后，其特异的基因被带入人体并在体内增殖而引起各种疾病。
一、基因诊断的概念所谓基因诊断就是利用现代分子生物学和分子遗传学的技术方法，直接检测基因结构及其表达水平是否正常，从而对疾病作出诊断的方法。
二、基因诊断的特点1.以基因作为检查材料和探查目标，属于“病因诊断”，针对性强。
2.分子杂交技术选用特定基因序列作为探针，故具有很高的特异性。
3.由于分子杂交和聚合酶链反应（PCR）技术都具有放大效应，故诊断灵敏度很高。
4.适用性强，诊断范围广。
5.检测外源基因时，可以检测出潜伏的病原体。
三、基因诊断的临床意义⏹1.可以更加准确的对遗传性疾病作出诊断，对了解发病过程和机制，为疾病的分类和分型，以及最终治疗这些疾病提供理论依据。
⏹2.进行产前基因诊断，提高人口素质⏹3.进行病原体的流行病学检查。
⏹4.更好的完成组织配型，提高器官移植的成功率。
第二节基因诊断的原理⏹一、人类基因的结构：⏹二、基因的表达与突变基因的突变类型⏹（一）大片断缺失或插入突变⏹（二）移码突变⏹（三）点突变（point mutation)⏹染色体易位、基因重排、基因扩增等。
第三节基因诊断的常用技术方法（一）核酸分子杂交技术⏹限制性内切酶谱分析法⏹DNA限制性长度多态性(restriction fragmentlength polymorphism, RLFP)分析⏹等位基因特异寡核苷酸探针(allele specificoligonucleotide, ASO)（二）聚合酶链反应(PCR)（三）基因测序（四）基因芯片1、限制性内切酶酶谱分析法 此方法是利用限制性内切酶和特异性DNA探针来检测是否存在基因变异。
外源基因表达机制
B）构建重组异源蛋白表达系统 将SD序列和启动子安装在外源基因的5’端 ATG碱基前的正确位置，使外源基因高效表达序 列正确的天然蛋白． C）构建分泌型异源蛋白表达系统 将分泌型蛋白的信号肽编码序列与外源基因 拼接，使异源蛋白表达后分泌到细胞周质中或直 接进入到培养基中． 优点：增大表达蛋白的稳定性大大简化后续 的分离纯化步骤．
原核生物启动子
转录起始位点。多数细菌启动子转录起始区序列为 CAT． Pribnow框。在距转录起始位点上游6bp处存在一个六联 体保守序列： TATAAT ，由于中间的碱基位于转录的起始 点上游的 10bp 处，又称为 -10 序列区。少数 Pribnow 框 中间碱基的位置在-9-18之间变化。 Sextama 框。在转录启动区的另一个六联体保守序列位 于距转录起 始位点上游 35bp 处，通常称为 -35 区，该 保守序列为TTGACA，它是 RNA聚合酶的识别位点。 间隔区。间隔序列内部无明显的保守性，其序列的碱基 组成对启动子的功能并不十分重要。但间隔序列的长 度却是影响启动子功能．
5 绝缘子
* 绝缘子（insulator）：在真核生物基因组中， 既是基因表达的调控元件，也是一种边界元 件．在果蝇和鸡的基因组中已发现多个绝缘子， 它能阻止临近的调控元件对其所界定基因的启 动子起增强或抑制作用．
* 果蝇中绝缘子SCS和SCS’分别位于果蝇多线染色 体87A7座位hsp70基因两侧的核酸酶高度敏感 区，它们是一种具有顺式调控作用的边界元件， 能使其界定的染色体结构域上的基因免受区域 外两端正调控和负调控信号的影响．
Ⅲ型启动子。 * 内启动子:转录起始位点的下游，如tRNA和5sRNA 的启动子。 * 外启动子:转录起始位点的上游，如脊椎动物U6 核小RNA和7SK RNA启动子，其结构类似于真核生 物Ⅱ型启动子。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1.外源基因瞬时表达的机制
（1）瞬时表达是未整合的外源基因的表达
（2）瞬时表达是一种正常的表达方式
基因扩增是指细胞内某些特定基因的 拷贝数专一性地大量增加的现象。扩增的 基因片断游离在细胞核内。
2.外源基因瞬时表达的影响因素
（1）质粒DNA的基因结构； （2）细胞内源核酸酶的影响； （3）受体细胞生理状态及其内源Gus酶抑
第一章 转化外源基因在植物细胞中的表达调控
第一节 转化外源基因的瞬时表达和稳定表达 第二节 DNA序列对转化外源基因表达的调控 第三节 DNA甲基化对转化外源基因表达的调控 第四节 提高转化外源基因表达的策略
第一节 转化外源基因的瞬时表达和稳定表达
一、转化外源基因的瞬时表达
在合适的条件下，转化的外源基因通常 在数小时后就能检测到其表达的产物，并在 1-2天内达到最高值，随后又逐渐降低，至 十多天后完全消失。这种短时间内的外源基 因表达称之为瞬时表达。
二、转化外源基因的稳定表达
所谓稳定表达是指外源基因整合到和基因 组DNA分子上，并能稳定地遗传的外源基因的 表达。需符合以下条件： （1）表达时间长，无迅速衰退现象；
（2）DNA已整合到植物基因组中；
（3）能够传递给后代，并符合分离规律。
第二节 DNA序列对转化外源基因表达的调控
一、植物基因工程中常用的启动子 按作用方式及功能不同可将启动子分为三类： 1. 组成型启动子 2. 组织特异性启动子 3. 诱导型启动子
3.poly(A)及其信号序列的调控
poly(A)和某些蛋白因子的结合能保 护mRNA 免遭外切核酸酶的降解。 3’端聚腺苷酸信号附近的一些核苷酸 序列能够促进提高植物基因表达水平，很 可能是通过促进mRNA加工和增加其稳定 性而发挥作用。
四、内含子对转化外源基因的表达调控作用
1.内含子有利于基因的变异进化 （1）有利于在内含子序列之间发生重组，从 而产生新的基因； （2）内含子切割点的变异导致外显子延伸。
（2）Nos和Oct启动子
来自与根癌农杆菌Ti质粒的胭脂碱合 成酶基因和章鱼碱合成酶基因，具有与植 物基因相似的序列。
2. 组织特异性启动子
也称为器官特异性启动子，在这类启动子的调 控下，基因的表达往往只发生在某些特定的器官或 组织部位，并往往表现出发育调节的特性。这种特 异性通常以特定的组织细胞结构和化学物理信号为 存在的基础。典型的组织特异性启动子有：马铃薯 块茎蛋白基因启动子；小麦胚乳特异表达的ADP-葡 萄糖焦磷酸化酶基因启动子；番茄果实成熟特异性 表达的多聚半乳糖醛酸酶基因启动子；花粉特异表 达基因（lat52）启动子和木质部特异表达的苯丙氨 酸脂肪酶基因（pal）启动子等。
三、5’，3’端序列对外源基因转录后的调控作用
基因的整体表达过程包括：转录、初级转 录产物的加工、运输、mRNA的翻译以及蛋白 产物的后加工这一系列步骤，每个步骤上都存 在着复杂而精细的调节，只提高外源基因的转 录活性并不能有效地提高细胞中相应的mRNA 水水平和蛋白含量。分析和改造转录产物的结 构、提高mRNA 的稳定性和翻译活性是转录后 调控研究的重点。
（1）CaMV35S启动子
该启动子来自花椰菜花叶病毒（CaMV），其转 录产物的沉降系数为35S，故名。 最近发现35S启动子可以划分为两个区域：从90 ~ +8为A区域，主要负责在胚根、胚乳的根及根 组织内表达；从-343 ~ -90为B区域，主要负责在胚 的子叶及成熟植株的叶组织及维管组织内表达，在B 区域内的增强子序列可以提高表达水平。
1. 5’ 端帽序列的调控
帽子结构不仅能提高翻译起始频率， 还能保护mRNA 免遭外且核酸酶的破坏， 提高mRNA的稳定性。
Байду номын сангаас
2. 5’ 端先导序列的调控
从真核基因mRNA 5’ 端帽子到起始密码 子之间的不翻译核苷酸序列称为先导序列。 先导序列的结构、组成和长度对翻译效率的 影响是存在的，但不是绝对的。TMV基因组 RNA68碱基的先导序列和AMV RNA436碱基 的先导序列具有提高外源基因mRNA 翻译活 性的功能。
1. 组成型启动子
在该类型启动子控制下，结构基因的表达 大体恒定在一定水平上，在不同组织部为表达 水平也没有明显差异，为此称之为非特异性表 达组成型启动子。其特点是：表达具持续性； 表达量相对稳定；不表现时空特异性；不受外 界因素诱导；在结构上存在六聚体花纹序列 （TGACTG），往往以重复形式出现并被6-8 个核苷酸隔开。
2.内含子具有提高外源基因表达水平的作用
由于内含子的有效拼接提高了细胞中成 熟mRNA 的水平，从而有利于基因表达。
五、信号肽序列对转化外源基 因翻译产物的调控作用
翻译的完成不是基因表达的结束，初 级翻译产物并不具有生物活性，称之为前 体蛋白。它通常还需要加工、修饰和正确 折叠才能成为有活性的蛋白。前体蛋白的 信号肽与活性蛋白的成熟有关、也与蛋白 质的运输和分泌有关。
制剂的影响；
3.外源基因瞬时表达的应用
（1）在基因转化研究中的应用
①农杆菌转化能力的检测； ② 优化基因转化条件，选择导入DNA的方法，确定 农杆菌共培养的时间等。 （2）植物基因表达调控的研究 ①启动子、增强子、内含子、终止子的功能研究； ②外界因素对基因表达调控的影响； ③ 植物激素的调控机理。
3. 诱导型启动子
所谓诱导型启动子就是在某些特定的 物理或化学信号的刺激下，可以大幅度地 提高基因转录水平的启动子。该类启动子 常以诱导信号命名，如光诱导表达基因启 动子；热诱导表达基因启动子；创伤诱导 表达基因启动子；真菌诱导表达基因启动 子等。
二、终止子的转录调控作用
不同来源的有着很大影响。使用35S 启动子与NPTII结构基因形成共整合体， 并于不同来源的终止子构建成融合基因， 转化烟草。发现不同的终止子使NPTII基 因的表达水平可相差60倍。植物基因的终 止密码子多用UGA，而在双子叶植物中， UAA的使用频率高于UGA。
第三节 甲基化对转化外源基因的表达调控
DNA甲基化现象广泛地存在于动植物 细胞中，有许多重要的生物学功能，包括 DNA复制起始、突变、修饰限制系统等。 通过改变DNA的甲基化状态可以调控基因 的表达。