第5章基因工程菌的发酵

表5-7高密度培养酵母菌元素组成 （发酵过程原理P169）
元素 P 最低量 (g/L) 1.9 推荐量 (g/L) 2.2-10 元素 Fe 最低量 (g/L) 0.006 推荐量 (g/L) 0.0090.08
K
Mg Ca
1
0.15 0.06
1.5-10
0.3-1.2 0.08-0.8
Zn
Cu Mn
影响外源基因表达水平的因素
• • • • • 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4 5.2.5 培养基 比生长速率 培养条件 外源基因表达的诱导强度 代谢产物的影响
5.2.1 培养基
• 培养基的设计要点，要能满足基因工程菌 的高密度培养，均衡的培养基的设计是关 键，多由实验确定最优的培养基。
Imanaka的基因工程菌脱落性 不稳定的模型
• 设： • 质粒丢失的概率为p， • 基因工程菌和丢失质粒的宿主菌分别以恒定 的比生长速率增殖。
S为限制性底物浓度，X+为带有重组质粒的菌体浓度， X—为丢失重组质粒的菌体浓度， a和b为系数。 μ ＋和μ －分别是带有重组质粒和丢失重组质粒菌体 的比生长速率，开始培养时菌体浓度分别是X0+和X0—。
第5章 基因工程菌的发酵
大量的药用蛋白质，是通过基因工 程菌发酵产生的。如生长因子、酶、 激素、抗体等。
基因工程菌表达蛋白质的目的：
• 基因工程菌表达蛋白质，有两个目的： • 目的一：目标产物是蛋白质，故要设法提 高发酵液中该蛋白质的含量，提高体积生 产速率。 • 目的二：外源基因所表达的产物，是酶等 代谢调控的成分。 • 外源基因的表达适度为宜，不宜过分表达。 否则要引起宿主细胞代谢的紊乱。
5.1.1.2 比生长速率的影响
• 判断质粒的稳定性的指标：传代数(而不是 丢失全部质粒所需时间)； • 质粒的稳定性与重组菌的比生长速率有关。 但不同的基因工程菌质粒稳定性与比生长 速率的关系呈现不同的规律。 • 一些基因工程芽孢杆菌在较高的比生长速 率下显示较差的质粒稳定性。
• 而未经重组的菌，比生长速率一般快于重 组菌。原因：代谢活动较少。 • 故两者的比生长速率有差异(Δμ)。这是 连续培养时，重组菌质粒不稳定性下降的 主要原因。 • 质粒稳定性也与带质粒细胞丢失质粒的概 率(p)有关。 • 在连续培养中，稀释率(D)越大，基因工程 菌在培养液中的比例下降加快。因为D增大， 同时带动Δμ和p的增大。
影响基因工程菌质粒稳定性的因素
遗传因素
质粒的结构 质粒的拷贝数 宿主细胞特性 选择性遗传标记 外源基因表达水平
环境因素
培养基 限制性底物 比生长速率 溶氧 温度 发酵操作方式
5.1.1 培养条件对稳定性的影响
• • • • 5.1.1.1 5.1.1.2 5.1.1.3 5.1.1.4 培养基的影响 比生长速率的影响 外源基因的表达的影响 其它培养条件的影响
基因工程菌的不稳定性的两种情况
• 分离(或脱落)不稳定性(Segregational instability)：基因工程菌的生长和繁殖 过程中，因重组质粒在子代细胞中的分配 问题，造成重组质粒的丢失；丢失重组质 粒的细胞在非选择性培养基中一般具有生 长优势。培养液中一旦出现丢失重组质粒 的细胞，基因工程菌细胞在培养液中的比 例会随时间快速下降(竞争不稳定性)。 • 结构不稳定性(structural instability)： 重组基因的突变造成。
本章主要内容
• 5.1 基因工程菌的稳定性 • 5.2 影响外源基因表达水平的因素 • 5.3 基因工程菌的高密度发酵
5.1 基因工程菌的稳定性
• 5.1.1 培养条件对稳定性的影响 • 5.1.2 发酵过程中群体组成的变化
• 基因工程菌的稳定性是实现外源基因产物 高水平生产的基本条件。 • 外源基因是通过重组的载体进入受体菌中。 以质粒和噬菌体的方式。 • 外源基因位臵：质粒中，被整合到受体菌 中的染色体中。
5.1.1.3 外源基因的表达的影响
• 外源基因的高表达会引起重组质粒的不稳 定性。
5.1.1.4 其它培养条件的影响
• 温度：温度升高，基因工程菌的质粒稳定 性变差。 • pH和溶氧：由不同的实验数据看，没有明 显的规律可循。应对所用的菌种进行研究， 然后决定采用哪种工艺参数，才能保证质 粒的稳定性。 • 固定化：菌体经固定化后，质粒的稳定性 较好。主要原因可能是经固定化后的菌传 代次数较少。尚未形成质粒丢失的个体。 • 操作方式：周期性补料比分批培养的方式 的质粒稳定性较好。
• 进行基因工程菌的高密度培养时，由于菌 体浓度很高，OUR相应也很高，而反应器的 KLa值有限，易造成供氧的限制。措施：增 大搅拌转速，增加空气流量，升高罐压， 甚至通入纯氧。 • 一般高的要求控制空气饱和度的80%，一般 不低于30%。
• 5.2.3.2 温度 • 对于采用温度调控基因表达的基因工程菌， 发酵过程可分为生长和表达两个阶段，分 别维持不同的培养温度。 • 温度也会影响重组蛋白的降解。降低培养 温度可以减少重组蛋白的降解。 • 发酵温度还会影响重组蛋白在细胞内的溶 解状态。
• 由于基因工程菌中质粒的复制与维持以及 外源基因的表达需要消耗更多的物质和能 量，丢失重组质粒的宿主菌更具有生长的 优势，故α一般在1-2之间。
分批发酵过程基因工程菌质粒丢失的模型
dX＋/dt =μm＋S(1－p)X＋/(Ks＋S) dX－/dt =μm－SX－/(Ks＋S) ＋ μm＋SX＋p/(Ks＋S)
5.3 基因工程菌的高密度发酵
• 高密度发酵的优点：提高产物的生成速率、 提高目标产物的浓度，有利于进一步的产 品分离，减少反应器的体积。 • 分批培养不可能获得高菌体密度的发酵液， 通常采用补料分批培养实现。 • 5.3.1 高密度发酵 • 5.3.2 代谢副产物生成的防止 • 5.3.3 例
• 但高密度培养的实现并不一定意味外源基 因的高表达。应结合发酵动力学研究，建 立基因工程菌高密度培养的工艺条件，并 结合反应器的合理设计，配臵，操作和控 制，才能实现高效表达的目标。 • 5.3.1 高密度发酵的培养基优化 • 高密度发酵，关键是菌体生长所需的营养 成分合理。培养基的优化非常重要。 • 常用培养基中有些元素过量。
0.002
0.0006 0.0006
0.0030.04 0.0010.01 0.00090.008
S
0.1
0.2-5
5.3.2
代谢副产物生成的防止
• 不恰当的发酵工艺会造成严重的代谢副产 物积累，造成原料的浪费，抑制基因工程 菌的生长和外源基因的表达。
大肠杆菌积累乙酸问题
• 大肠杆菌在葡萄糖培养基中很容易积累乙 酸。供氧不足时更是如此。在形成乙酸后， 即使增加葡萄糖的浓度，也不能恢复菌体 的比生长速率。大肠杆菌积累乙酸的机理 不清。一般认为是由于三羧酸循环流量的 限制、呼吸链流量的限制等引起。有时， 由于流加葡萄糖时，葡萄糖未得到及时的 分散稀释，也会造成乙酸的产生。
5.2.2 比生长速率
• 许多基因工程菌外源蛋白质的生产显示出 与生长速率正相关的特点。 • 故保持较高的比生长速率可提高目标蛋白 质的产量。 • 对于外源基因需诱导表达的基因工程菌发 酵，可分为菌体生长和外源基因诱导表达 两个阶段。分别控制合适的生长和表达条 件。
5.2.3培养条件
• 5.2.3.1 溶氧 • 外源基因的高表达需要细胞合成大量的 mRNA和重组蛋白，占用细胞的mRNA合成酶 和核糖体等资源，消耗更多的营养和能量， 给宿主细胞带来了很大的代谢负担，在培 养中显示更高的维持系数，因此基因工程 菌发酵中，一般应提供足够的氧以满足其 代谢的需要。 • 但仍需通过实验确定最佳的供氧水平。
避免乙酸对生长造成危害的措施
• 故通过限制葡萄糖的浓度（如补料发酵）， 维持较低的比生长速度，当比生长速率低 于临界值时，加强混合，使葡萄糖尽快分 散，可避免乙酸的生成。 • 采用不产生乙酸的菌株，或采用对乙酸耐 受性好的菌株也是避免乙酸对生长造成危 害的措施。 • 碳源种类的合理选择及搭配（如用甘油、 果糖、酮基戊二酸或延胡索酸为碳源可减 少乙酸的生成）。
5.2.5 代谢产物的影响
• 大肠杆菌在葡萄糖为培养基时，产生乙酸，乙酸 浓度过高，会影响菌体的生长，对外源基因表达 也有抑制作用。 • 对碳源供应应加以有效的控制，如采用流加葡萄 糖的方式。 • 有时也发现即使流加葡萄糖，也产生乙酸，可能 原因是搅拌不匀，致使流加的葡萄糖局部浓度过 高。 • 或加入其它碳源（如甘油）代替葡萄糖。 • 也可采用不产乙酸的菌，或采用对乙酸具有耐性 的菌株。
5.1.1.1 培养基的影响
• 基因工程菌在复合培养基中显示较高的质 粒稳定性。 • 在基本培养基中造成基因工程菌比例下降 的主要原因是基因工程菌和宿主菌比生长 速率的差异。 • 限制性底物种类对质粒稳定性有很大的影 响。对于给定的基因工程菌，培养时选用 恰当的限制性底物有可能明显提高质粒稳 定性，但需要进行实验确认。
5.2.3.3
来自百度文库pH
• 发酵pH可能对重组蛋白的生产有很大的影 响，主要原因是细胞分泌的蛋白酶会造成 重组蛋白的降解，而蛋白酶的活性则与pH 有很大的关系。
5.2.4 外源基因表达的诱导强度
• 基因工程菌的构建中通常考虑采用可诱导 的强启动子，但强启动子表达外源基因时， 高表达会对宿主细胞的代谢带来很大的负 担，影响细胞的生长和质粒的稳定性，故 在进行发酵时可分成两个阶段（生长和生 产）。 • 诱导剂的用量可以影响被诱导的启动子调 控的基因表达水平。
• bS ＋ X¯ →2 X ¯
• 经时间t的培养后，基因工程菌传代n次。可以推导 出基因工程菌在培养液中的比例Fn为： • Fn＝ （1－α－ p）/ ［1－α－p ×2n(a＋p－1)］ • α＝ μ－/μ＋
• α反映了丢失和带有重组质粒的细胞生长速率的差异。 • α一般在1-2之间。 α小于0，说明基因工程菌失去耐药性而被杀死
丢失本身的生长 丢失后转变过来的
dS/dt = －dX＋/dtY+ － dX－/dtY－ dP/dt =αdX＋/dt ＋ βX＋
5.2
影响外源基因表达水平的因素
• 外源基因表达水平的影响因素包括： • 基因剂量、转录和翻译效率、启动子、中 止编码、重组DNA的稳定性、mRNA的稳定性、 重组蛋白质的稳定性、宿主细胞和载体的 特性、偏爱密码子等因素。 • 此外，外源基因表达水平的影响因素还包 括：基因工程菌的培养条件、反应器的操 作和过程控制。
5.1.2 发酵过程中群体组成的变化
• 发酵过程要求纯种发酵。 • 但是对于基因工程菌，绝对的纯种发酵很 难保持。 • 细胞和重组细胞两种类型可能同时存在。 • 条件改变，两者的比例会发生变化。 • 研究发酵过程中，重组细胞比例变化的规 律，是发酵过程优化的重要内容。
•
Imanaka模型
aS ＋ X＋→ (2－p)X＋ ＋ pX ¯