基因工程上课

平端切口
G
+
CCTAG
GATCC G
粘端切口
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⑶特殊性质的Ⅱ型限制酶：
同裂酶：又称异源同工酶，是从不同的原核生物中 分离出来的不同的酶。它们识别相同的序列，在切 割DNA时，其切割点可以是相同的，也可以是不同 的。 例如：Aha Ⅲ和DraⅠ的识别和切割序列都相同， 产生平端：
5 3 A - - T ''T A T A A T A T A T - -3 5 '' A D h ra a Ⅲ Ⅰ 5 3 ''- -T A T A T A +A T A T A T - -5 3 ''
如SmaⅠ
5 C '-C C G G G -3 ' 3 G '-G G C C C -5 ' S m aI
5 3 ''- -C G C G C G +G C G C G C - -5 3 ''
基因Байду номын сангаас程上课
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
BamHⅠ
GGATCC CCTAGG
GTC CAG
+
GAC CTG
5、从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到 扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。
6、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使 之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所 需要的物质。
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分
目的基因
基因载体
切
接
重组体
转 筛
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总 体 技 术 路 线
表
1996年7英国爱丁 堡罗斯林（Roslin） 研究所用药物促使母 羊排卵，将卵吸空， 制成空卵壳，再从母 羊乳腺中取出一个体 细胞，使它与卵壳合 成一个含有遗传物质 的卵细胞。当卵细胞 分裂形成胚胎后被植 入母羊子宫内，母羊 产下了与自己有相同
基因的多莉！
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第一节 重要的工具酶
• 一、限制性核酸内切酶 • 二、DNA聚合酶 • 三、逆转录酶 • 四、DNA连接酶 • 五、碱性磷酸酶 • 六、末端脱氧核苷酸转移酶
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一、限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶(RE)是由细菌产生的一种能识别双链 DNA中的特定位点，并水解该点磷酸二酯键的核酸内切酶 (简称限制酶或内切酶)，多在原核生物中存在.
53''--G CCATG+GTACG C--35''
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同尾酶(isocaudarner)：有些限制酶的识别序列 不同，但是它们作用后产生相同的粘性末端，故 称为同尾酶。
例如MboⅠ、BamHⅠ、BglⅡ的识别切割序列分别
为：
G 5 -'A T C -3 ' G 5 -G 'A T C C -3 ' A 5 -G 'A T C T -3 ' C 3 -'T A G -5 ' C 3 -'C T A G G -5 ' 3 T -C 'T A G A -5 '
基因工程
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基本概念
基因重组(DNA重组):将不同来源的DNA分子
通过磷酸二酯键连接而形成新的DNA分子的过程
克隆(clone)是指通过无性繁殖过程所产生的与
亲代完全相同的子代群体
分子克隆是在体外对DNA分子按照既定的目的和 方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受 体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得 DNA分子大量复制，并使受体细胞获得新的遗传
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⒊限制酶的识别和切割位点 特点：4-8个bp，具有回文结构的DNA片段
⑴粘性末端 在识别序列的两个对称点切开DNA双链，产生 带单链尾的粘性末端
如 EcoRⅠ 切 割 后 产 生 5'粘 性 末 端 ， PstⅠ 切 割 后 产 生 3'粘 性 末 端 ：
5 G -'A A TT C-3' 3 C -'TT A A G-5'E coRI
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又如KpnⅠ和Asp718Ⅰ的识别位点相同，但切割
位点不相同，前者产生3'粘性末端，而后者产生 5'粘性末端
5'-GGTACC-3' 3'-CCATGG-5' KpnI
53''--G CGTAC+CATGG C--53''
5'-GGTACC-3' 3'-CCATGG-5'
Asp718 I
1、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或 PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段。
2、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到 能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形 成重组DNA分子
3、将重组DNA分子转移到适当的受体细胞(亦称寄主 细胞)，并与之一起增殖。
4、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组 DNA分子的受体细胞克隆。
5 3''--G C TTA A+A A TT G C --3 5''
5 C -'T G C A G-3' 3 G -'A C G T C-5' P stI
5 3''--C G TG C A+A C G T G C --5 3''
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⑵平末端： 切割点是识别序列的对称轴，产生平端或钝 端(blunt end)。
⒈限制酶的分类
①I型限制酶：具有限制和DNA修饰作用，这种酶通常在 识别位点下游100～1000bp处切割DNA；
②Ⅲ型限制酶：与I型酶一样，具有限制与修饰活性，能 在识别位点附近切割DNA，切割位点很难预测.
③Ⅱ型限制酶：能在DNA分子内部的特异位点识别和切割 双链DNA，其切割位点的序列可知、固定,是基因工程常 用酶。
特征的过程。
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基因工程的概念：
利用DNA体外重组或PCR扩增技术从 某种生物基因组中分离感兴趣的基因， 或是用人工合成的方法获取基因，然后 经过一系列切割，加工修饰，连接反应 形成重组DNA分子，再将其转入适当的 受体细胞，以期获得基因表达的过程.
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基因工程(gene engineering)常和以下 名称混用
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⒉限制酶的命名
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株。 另外用罗马数字代表同一菌株中不同限制酶的编号， 现在常用来表示发现的先后次序
EcoRⅠ：E代表Escherichia属 co代表coli 种
R代表RY13株 I代表该菌株中首次分离到的核酸内切酶
• 遗传工程(genetic engineering); • 基因克隆(gene cloning); • 分子克隆(molecular cloning); • 基因操作(gene manipulation); • 重组DNA技术(recombination DNA
technique)
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基因工程的主要内容或（步骤）