肿瘤干细胞培养技术分享
肿瘤干细胞的分离培养及其在肿瘤治疗中的应用
肿瘤干细胞的分离培养及其在肿瘤治疗中的应用随着医学技术的不断前进，对肿瘤治疗的研究也越来越深入。
其中，肿瘤干细胞的研究备受关注。
肿瘤干细胞是指在肿瘤中所存在的一小部分细胞，能够不断分裂增殖，并给予肿瘤再生的可能性。
因此，肿瘤干细胞的分离与培养以及在肿瘤治疗中的应用，成为了当今医学研究的热点话题。
一、肿瘤干细胞的分离方法目前，分离肿瘤干细胞的方法主要包括紫杉醇浸润法、细胞表面标记法、限制稀释法等。
其中，限制稀释法是较为常用的一种。
限制稀释法是将单个肿瘤细胞样本通过连续的稀释、培养与观察，逐渐筛选出肿瘤干细胞。
它通过观察单个细胞的生长、分裂、增殖情况，来得出大量肿瘤细胞当中的干细胞。
虽然这种方法过程复杂、费时费力，但是它能够筛选出更加纯度高的肿瘤干细胞。
二、肿瘤干细胞的培养方法早期肿瘤干细胞的培养，主要采用血清补充的液体培养基进行细胞的培养。
但是在这种培养条件下，肿瘤干细胞很容易分化。
因此，近年来，越来越多的实验室采用无血清培养条件进行肿瘤干细胞的培养，以维持肿瘤干细胞的稳定状态。
无血清培养条件下，需要选择不同种类的培养基，添加多种生长因子与细胞基质，来模拟肿瘤干细胞自身的生长环境。
同时，还需注意对细胞的密度、温度、pH 值、CO2浓度等生理性因素的控制。
三、肿瘤干细胞在肿瘤治疗中的治疗应用肿瘤干细胞的研究在肿瘤治疗中，具有重要的应用价值。
首先，肿瘤干细胞作为肿瘤治疗的靶点，开启了新的临床治疗途径。
其次，肿瘤干细胞可以用于评估肿瘤药物的治疗效果，这一评价标准能够更为准确反映药物的实际效果。
此外，肿瘤干细胞还可以用于评估肿瘤的预后情况，帮助医生选择更加有效的治疗方式。
总之，肿瘤干细胞的研究在肿瘤治疗研究领域，具有非常重要的价值。
分离肿瘤干细胞、培养肿瘤干细胞以及开展针对肿瘤干细胞的治疗策略，将有助于提高肿瘤治疗的效果，为患者带来更好的治疗效果。
干细胞移植技术的成功案例分享
干细胞移植技术的成功案例分享干细胞移植技术作为一种前沿的医疗技术，已经在许多领域展现出了巨大的潜力。
通过利用干细胞的再生能力，可以治疗许多疾病，包括白血病、心脏病以及神经退行性疾病等。
本文将分享几个干细胞移植技术的成功案例，以展示这一技术在医学领域的巨大贡献。
首先，我们来看一个在白血病治疗中取得成功的案例。
白血病是一种造血系统恶性肿瘤，传统的治疗方法包括放疗和化疗，但是这些方法对患者身体造成的损害较大。
然而，通过干细胞移植技术，医生们可以从患者身体中提取健康的造血干细胞，经过加工和培养后再植入患者体内。
这些干细胞可以重新建立正常的造血系统，有效治疗白血病，并提供了更好的生存率和生活质量。
一位名叫李明的白血病患者就通过这种技术完成了干细胞移植，不仅成功战胜了疾病，还恢复了健康的生活。
除了白血病，干细胞移植技术在心脏病治疗中也取得了显著的成果。
心脏病是全球范围内造成死亡的主要原因之一，传统的治疗方法往往只能减缓病情，但不能治愈。
然而，通过干细胞移植技术，在患者的心脏损伤部位注射修复的干细胞，可以促进心肌细胞再生和修复，增强心脏功能。
一项研究显示，在一组心脏病患者中，采用干细胞移植技术的治疗方法显著缩小了心脏病变区域的面积，并提高了患者的生活质量和心脏功能。
这为心脏病患者提供了新的希望和机会。
此外，干细胞移植技术在神经退行性疾病治疗中也有重要的应用。
神经退行性疾病包括帕金森病、阿尔茨海默病等，这些疾病的特点是神经细胞的损伤和功能障碍。
通过干细胞移植技术，科学家可以将干细胞转变为神经细胞，并将其植入患者大脑或神经组织中，以替代受损的细胞。
一项名为“干细胞神经移植”的研究表明，帕金森病患者接受干细胞移植后，其运动能力得到明显改善，并且没有出现明显的副作用。
这为神经退行性疾病的治疗带来了新的曙光。
尽管干细胞移植技术已经取得了一些重要的成功案例，但仍面临一些挑战和限制。
首先，干细胞的来源和应用仍然是一个争议性的问题。
肿瘤细胞的培养及其实验的方法
肿瘤细胞的培养及其实验的方法肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，首先癌细胞是比较容易培养的细胞。
当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。
另外肿瘤对人类是威胁最大的疾病。
肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。
肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。
一、组织培养肿瘤细胞生物学特性肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。
生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。
培养中的肿瘤细胞具以下突出特点：（－）形态和性状培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。
电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。
（二）生长增殖肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。
正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（2％～5％）仍能生长。
已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。
正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的一个指标。
癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。
另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。
（三）永生性永生性也称不死性。
在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis）。
体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状，体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。
因恶性肿瘤终将杀死宿主并同归于尽，从而难以证明这一性状的存在。
体外肿癌细胞的永生性是否能反证它在体内时同样如此？也尚难肯定。
从近年建立细胞系或株的过程说明，如果永生性是体内肿瘤细胞所固有的，肿瘤细胞应易于培养。
那些肿瘤干细胞的研究套路-序章与实验方法介绍
那些肿瘤⼲细胞的研究套路-序章与实验⽅法介绍近年来，肿瘤⼲细胞（Cancer stem cells，CSCs）逐渐成为肿瘤研究中的热点，2014年以来发表在⾼影响因⼦的各领域顶级期刊上的⽂章超过了数百篇。
再来看看2018年的国⾃然基⾦项⽬，肿瘤⼲细胞的项⽬也有37项之多，不管肿瘤⼲细胞的概念过去存在多少争议，越来越多的SCI⽂章都在发表肿瘤⼲细胞相关的研究，本系列将以⼏个篇幅详细介绍⼀下肿瘤⼲细胞的基本概念、研究思路、实验⽅法和论⽂套路。
序章肿瘤⼲细胞是指⼀类具有⼲细胞的特征，包括休眠、DNA修复机制激活、ABC药物转运蛋⽩⾼表达、以及对细胞凋亡的天然抗性的⼀群特殊的肿瘤细胞。
这群特殊的肿瘤细胞还具有以下⼏个特征，第⼀是⾃我更新能⼒，即可以产⽣与亲代完全相同的⼦代细胞；第⼆是分化潜能，即可以分化成不同亚群的肿瘤细胞；第三是⾼成瘤性，即很少量的肿瘤⼲细胞就⾜以在体内起始肿瘤发⽣。
研究表明肿瘤⼲细胞在肿瘤的发⽣起始，转移以及耐药的过程中发挥着重要作⽤，下⾯着重介绍⼀下肿瘤⼲细胞的实验⽅法和⼤体研究思路。
1) 肿瘤⼲细胞分离⽬前主要采⽤FACS（流式细胞分选术）和MACS（磁珠分选）技术，FACS能够通过肿瘤⼲细胞表⾯特殊表⾯标志物的表达（如CD133，CD24，CD44等）进⾏肿瘤⼲细胞的分离，MACS则⼀般利⽤CD133作阳性选择分离细胞。
（附表1：不同肿瘤⼲细胞表⾯标志物）表1 不同肿瘤细胞表⾯标志物2) 肿瘤⼲细胞体外培养采⽤肿瘤⼲细胞微球Oncosphere体系对常规肿瘤细胞系或者病⼈来源的肿瘤⼲细胞进⾏培养： Oncosphere即⼲细胞成球，通过⽆⾎清的⼲细胞培养基在低吸附的培养板上对肿瘤细胞进⾏培养可以得到悬浮的球状细胞团（图1），细胞处于⽆⾎清培养基及超低黏附培养板中，在这种培养条件下，分化的肿瘤细胞渐渐死亡，肿瘤⼲细胞则会存活并增殖形成细胞微球。
图1 肿瘤⼲细胞sphere培养体系观察以乳腺癌与结肠癌为例，Oncosphere培养体系如下：乳腺癌CSC培养体系结直肠癌CSC培养体系DMEM/F-12DMEM/F-12B27 1X B27 1X20ng/ml EGF20ng/ml EGF20ng/ml bFGF20ng/ml bFGF0.4% BSA Penicillin/Streptomycin5ug/ml InsulinPenicillin/Streptomycin3) 肿瘤⼲细胞的鉴定和⼲细胞特性检测除了前述提到的染⾊肿瘤⼲细胞特异性表⾯marker并通过流式细胞术鉴定CSC外，成球能⼒也是肿瘤⼲细胞体外鉴定和反应⼲细胞特性的重要指标。
肿瘤细胞培养(完整版)
第6章肿瘤细胞的培养肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药的敏感性、肿瘤细胞和癌分子生物学特性的重要手段。
癌细胞是比较容易培养的细胞，当前所建立的细胞系中癌细胞是最多的。
应用体外细胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点：(1)可免受机体内环境因素的影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化和生物因素对肿瘤细胞生命活动的影响。
(2)既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞的结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究癌变的发生机理；(3)可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性和遗传行为的改变。
(4)可用于快速筛选抗癌药物和研究耐药机理。
(5)研究周期短，比较经济。
但是它也有缺点，如长期培养可使细胞生物学特性发生改变；体外实验所得的结果不能完全代表体内的情况，应与体内试验结合研究更为合理等。
一、肿瘤细胞培养的生物学特性1、形态和性状形态不规则，细胞界限清晰，伸展较差，核膜、核仁轮廓明显，核仁多、核浆丰富。
折光性强，电镜观察细胞表面微绒毛多而细密，与肿瘤细胞具不定向运动和铺着不依赖性有关。
2、生物特性癌细胞在无血清或低血清(2%～5%)时仍能生长，营养要求不高，因能自分泌促增殖因子，在软琼脂培养时单个细胞能形成集落，生长方向性消失，再加上失去了接触抑制，癌细胞数量增多时可呈多层重叠生长，细胞饱和密度大，有丰富的三极有丝分裂，分裂指数高，细胞倍增周期短。
3、永生性永生性也称不死性，在体外培养中表现为可无限制传代而不凋亡(Apoptosis)，体外培养的肿瘤细胞系(株)都表现有这种特性。
但体外培养的永生性和体内肿瘤的恶性(包括侵润性)是两种性状，受不同基因调控的，因恶性肿瘤多数在体外培养时并不那么容易获得成功，生长增殖能力并不旺盛，有时只能传若干代，说明体外培养的永生性可在体外培养后获得的。
另外，体外培养的许多细胞系，如NIH3T3、Rat-1 10T1/2等均具有永生性而无恶性。
但两者有相关性，永生性可能是细胞恶性变的某一阶段。
肿瘤细胞的培养方法
肿瘤细胞的培养方法
肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用RPMI、DMEM、McCoy-5A等培养基，血清浓度不高，10%即可，建议最好在原代培养时能加入生长因子或原患者血清（1%~2%）以利细胞生长。
培养方法很多，主要有组织块法、酶消化法、钽网法、脱落细胞法等。
1．组织块法
将取得的瘤组织去除脂肪、结缔组织及坏死部分，在平皿中用Hanks液洗3次，剪碎组织，切成1~2mm3小块，接种于事先涂有鼠尾胶原的培养瓶（或皿）中，37℃、5%CO2或加盖并塞在普通恒温箱中培养。
2．酶消化法
在上述的碎组织块中加入0.25%胰蛋白酶或2000U/ml胶原酶，在37℃水浴中消化30min或更长一些，去除消化液，用洗液洗3次，培养基洗1次后，用完全培养基悬浮，并用吸管吹打分散制成细胞悬液，计数。
以（5~10）x108个/L细胞浓度，在含有10%小牛血清的RPMI、EagleMEM或DMEM中，在37℃、5%CO2下分瓶（或皿）中培养。
3．钽网法
在一张面积约为1cm2的钽网上放入上述剪碎的一块或几块肿瘤组织块（1~2mm3大小），用镊子轻压，使其粘于网上，再把但网放入培养皿中，使网下的组织块与皿壁紧紧接触，于37℃、5%CO2下培养，每隔2~3天换液一次，5天后可见有上皮细胞从网上移出，并能在相当于肿瘤组织部位形成纯净的单层上皮细胞。
4．脱落细胞法
将新鲜的肿瘤组织去除脂肪和结缔组织，洗液洗2次后，用刀片将肿瘤组织切成细薄片，在切割的同时有许多上皮细胞脱落下来，脱落细胞经洗涤后，加入完全培养基，便可获得较纯的上层细胞，于培养瓶（或皿）中，37℃、5%CO2下培养，每隔2~3天换液一次，7~10天上皮细胞逐渐长成单层。
肿瘤干细胞的分离和鉴定技术研究
肿瘤干细胞的分离和鉴定技术研究肿瘤干细胞是指一种具有自我更新能力的细胞，同时又可以分化成某些或所有肿瘤细胞的一种细胞。
它是肿瘤形成、生长、传播过程中至关重要的组成部分。
因为肿瘤干细胞具有高度的分化潜能和无限的增殖潜能，所以它们可以在充分的核苷酸切片的条件下自我更新、维持和增殖。
而且在化疗和放疗的过程中，肿瘤干细胞可以存活，这是导致肿瘤治疗失败以及肿瘤复发的原因之一。
因此，寻求分离和鉴定肿瘤干细胞的方法和技术至关重要。
目前分离和鉴定肿瘤干细胞的主要方法包括：1. 流式细胞仪流式细胞仪是一种可以对细胞进行分类、鉴定和计数的仪器。
通过标记分子，可以分离出具有肿瘤干细胞表型的细胞，如CD133、CD44、CD24和EpCAM。
但是，CD133和CD44等标记分子也可表达于非肿瘤干细胞，因此在使用流式细胞仪时需要结合其他的标记分子和鉴定方法，以提高分类和准确性。
2. 磁珠分选法磁珠分选法是一种通过对细胞表面标记抗原进行特异性结合和隔离的方法。
一般来说，将抗CD133的磁珠与肿瘤细胞混合，并在磁力场中分离，从而分离出肿瘤干细胞。
这种方法具有操作简单、高通量等优点，但仍然需要结合其他标记分子和方法以提高准确性。
3. 单细胞培养单细胞培养是一种将肿瘤组织显微切片后，将细胞分散到培养皿中，以培养单个肿瘤干细胞为主要目标的方法。
这种方法可以更加准确地分离出肿瘤干细胞，但是操作复杂、耗时长。
4. 体内鉴定体内鉴定是通过将标记细胞注射到小鼠等实验动物体内，观察肿瘤形成和生长的过程，进而鉴定出肿瘤干细胞。
这种方法可以检测到复杂的细胞肿瘤形成，但由于其时间和成本等原因，常常被用作其它方法的验证和分析。
需要注意的是，肿瘤干细胞的分离和鉴定不仅要依赖于单一的标记分子和方法，还需要结合多项标记分子和细胞生物学特征、分布情况等进行综合鉴定，以提高准确性和可靠性。
肿瘤干细胞的分离和鉴定技术对于肿瘤治疗、预防和管理具有重要意义。
通过分离和鉴定肿瘤干细胞，可以有效地评估肿瘤的潜在危险性、筛选出更加有效的治疗方法，更好地指导临床治疗、降低肿瘤复发率和死亡率。
肿瘤干细胞培养技术
肿瘤干细胞培养技术随着干细胞生物学以及肿瘤学研究得不断深入,肿瘤干细胞已成为当前肿瘤研究得热点、肿瘤干细胞得体外培养在肿瘤干细胞研究领域具有不可替代得重要地位,通过分离、纯化及培养肿瘤干细胞可以对其生物学特性如异质性、肿瘤得演化、转移与抗药性等进行研究,为肿瘤得早期诊断与治疗提供了新得思路与策略。
肿瘤干细胞得体外培养多采用无血清培养基(serｕｍｆree meｄium, SF Ｍ),根据不同得细胞类型加入适当得细胞因子联合培养以防止其分化。
肿瘤细胞系或者就是临床肿瘤组织联合采用机械与胶原酶消化肿瘤组织得到单细胞悬液,经过流式细胞仪或者免疫磁珠分选得方法得到肿瘤干细胞使用无血清培养基在饱与湿度得条件下进行体外培养,但值得注意得就是临床肿瘤组３7℃,５％CO２织得获取应该越新鲜越好,最好就是在外科手术后１小时内进行处理否则将影响肿瘤干细胞细胞得活性,不利于体外培养。
无血清培养基有很多种,针对不同得细胞类型有专门得无血清营养液出售。
无血清培养基具有以下得优点:各批产品之间成分相对明确、质量相对一致;便于控制培养得生理环境;特殊细胞类型得优化配方有利于提高细胞得稳定性,使不同类型得细胞能在最有利于各自生长得环境中持续传代培养;依据不同类型得细胞、甚至不同得细胞系(株)都可能有各自得无血清培养基。
总得来说可以分为基础营养基及附加成分两大部分［1］。
基础培养基一般采用人工合成得培养基主要有DMEM、DMEM/F12、UltraＣULTURETM、神经干细胞专用无血清培养基、黑色素瘤专用培养基等其中以DMEＭ/F１2(1:1,Iｎｖitｒoｇen)最为常用。
附加成分就是指在基础培养基中加入各种不同细胞生长所需得营养成分,包括①营养因子:胰岛素、转铁蛋白与亚硒酸钠、牛血清白蛋白、B27、Ｌ—谷氨酰胺;②细胞因子:白血病抑制因子、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、血小板衍化生长因子等。
使用无血清培养基培养得细胞经胰酶消化传代后不使用血清终止胰酶得作用,可使用０.1％－0.5%大豆胰酶抑制剂(sｏｙbeaｎ trypsin inhi ｂiｔｏr)。
肿瘤细胞培养方法及步骤
肿瘤细胞培养方法及步骤
一、机械刮除法
1．标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位。
2．刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间。
3．用Hanks液冲清洗一两次，洗除被刮掉的细胞。
4．注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止。
二、反复帖壁法
1．待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液。
2．取编号为A、B、C三个培养瓶。
首先把悬液接种入A培养瓶中，置温箱中静止培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入B培养瓶中后，向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养。
3．培养B瓶中细胞5～20分钟后，按处理A的方法，把培养液注入C培养瓶中，再向B瓶补加完全培养基。
三、消化排除法
1．先是用0.5％胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培养基细胞一次，然后再换成新的混合继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化。
2．把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养，向原瓶内也补加新的培养液继续培养。
用此法处理后，成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落，经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。
四、胶原酶消化法
1．可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化。
2．用Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。
如成纤维细胞未被除净，可再次重复。
肿瘤干细胞实验方法
肿瘤干细胞实验方法肿瘤干细胞是一种新型细胞，具有自我更新，自我修复，多向分化和肿瘤形成的潜能。
它们在肿瘤的形成、发展和复发过程中扮演着重要的角色，因此对肿瘤干细胞的实验研究具有重要的意义。
本文将介绍肿瘤干细胞实验的基本方法。
1. 肿瘤干细胞培养肿瘤干细胞可通过单细胞克隆形成球体的方式进行培养，这种方法又被称为肿瘤球体培养。
其步骤如下：1) 确定肿瘤细胞株中的肿瘤干细胞含量。
2) 将肿瘤细胞株悬浮在无血清培养基中，添加必须的生长因子如EGF和FGF等，使其形成肿瘤球体。
3) 观察肿瘤球体的形成和生长情况，并进行维持和分离。
肿瘤球体与普通二维培养方式相比，具有较高的肿瘤干细胞含量，并具有良好的体外模拟肿瘤生长和浸润的特性。
此外，肿瘤球体可直接用于药物筛选和肿瘤干细胞信号机制的研究。
肿瘤干细胞的鉴定是肿瘤干细胞研究的重要环节。
主要通过以下两种方法进行：1) 流式细胞术通过肿瘤干细胞表面标志物表达的差异，通过流式细胞仪的分析来鉴定和筛选肿瘤干细胞。
常用的肿瘤干细胞表面标志物有CD133、CD44、CD24和ESA等。
2) 功能性鉴定法此方法是通过肿瘤干细胞的自我更新和多向分化的特性来进行鉴定。
肿瘤干细胞应该具有自我更新的能力，同时还具有多向分化的潜能，可以分化成多种类型的细胞。
通过上述方法鉴定出的肿瘤干细胞，需要进一步进行分选。
常用的方法有磁珠分选、流式细胞术和细胞筛等。
磁珠分选法是利用与表面标志物相关的磁珠对肿瘤干细胞进行筛选和富集。
流式细胞术，是利用表面标志物和细胞生物学特性进行筛选和富集。
细胞筛法是根据肿瘤干细胞的体积和生长特性进行富集。
4. 肿瘤干细胞治疗效果评价1) 体内治疗将肿瘤干细胞或肿瘤球体种植到动物体内，并进行药物治疗，以评价药物对于肿瘤干细胞的杀伤效果。
例如, 免疫缺陷小鼠移植瘤模型。
2) 体外药物筛选3) 分子生物学方法通过单细胞的特异性PCR和实时荧光PCR等分子生物学方法，检测肿瘤干细胞相对于肿瘤非干细胞的基因差异，从而评价治疗效果。
肿瘤干细胞的分离和识别技术研究
肿瘤干细胞的分离和识别技术研究肿瘤干细胞是一类具有自我更新、自我复制和多向分化能力的细胞，它们在肿瘤的形成、发展和复发中发挥着重要作用。
因此，肿瘤干细胞的研究受到广泛关注。
在肿瘤干细胞的分离和识别技术方面，已经取得了一定的进展，但仍存在许多难题。
一、肿瘤干细胞的分离技术1、表面标记法表面标记法是指利用单克隆抗体、磁珠、光标记物或其它生物标记物针对干细胞特异性表面标记，对肿瘤干细胞进行筛选或富集。
这种方法的优点是简单易操作，但局限性比较大，如标记物的选择、稳定性和特异性都会对结果产生影响。
同时，表面标记法只能识别已知表面标记的肿瘤干细胞，而且可能存在表面标记分子表达量的变化。
2、酶消化分离法酶消化分离法是指利用酶或混合物对肿瘤组织进行消化，将组织分解成单个细胞，然后通过细胞大小、浮力或黏附性等特性对肿瘤干细胞进行分离。
这种方法的优点是操作简单，重复性好，同时还能筛选出潜在的新的肿瘤干细胞。
但是，这种方法也存在着许多困难，如酶对肿瘤细胞的生长或表现出异常反应，随着分离时间的延长，对污染物的处理难度增大。
3、肿瘤单元株法肿瘤单元株法是指从混合物中分离出单克隆肿瘤细胞系，经过多次培养后，可以对细胞株的不同行为、生长规律和表型进行研究，较好地代表了其母体肿瘤细胞。
这种方法的优点在于能够保证分离出的细胞具有相似的特性，并且更适合进行实验室的基础研究。
但是，肿瘤单元株的缺点也明显，即只能用于特定的肿瘤类型，并且依赖于肿瘤细胞株的连续培养和细胞突变等因素可能导致失去肿瘤性质。
二、肿瘤干细胞的识别技术1、染色体畸变由于肿瘤干细胞具有自我复制的能力，可以分裂成不同类型的细胞。
在这个过程中，由于DNA复制的误差，会出现大量染色体的“异常”和“重排”，这些异常可以被用于识别干细胞。
此外，染色体的缺损或突变等也可以通过染色体分析技术进行识别。
2、表达谱分析通过RNA序列分析、DNA微阵引、蛋白质质谱分析等技术，可以对肿瘤干细胞的表达谱进行分析，以了解它们在特定环境下的表达情况，从而进行肿瘤干细胞的识别。
肿瘤干细胞的分离及其治疗应用
肿瘤干细胞的分离及其治疗应用肿瘤是机体内细胞异常增生所形成的疾病，长期以来是全球人类健康领域的一大难题。
虽然传统的化疗与放疗等治疗手段已经获得了显著的疗效，但是随着癌症种类的不断增多，传统治疗的局限性和毒副作用逐渐凸显。
近年来，人们开始重视肿瘤干细胞（CSCs）在肿瘤发生、发展、转移、复发等方面的关键作用。
本文将就肿瘤干细胞的分离及其治疗应用做简要介绍。
一、肿瘤干细胞的定义肿瘤干细胞是指具有自我更新和分化能力的肿瘤细胞亚群，是维持肿瘤生长和发展的关键细胞种群。
CSCs可自我更新、不断分裂产生更多的CSCs或分化成较为成熟的肿瘤细胞。
CSCs不但具有肿瘤起源的来源、维持和发展作用，而且能够潜伏在机体内造成肿瘤的复发和转移。
二、肿瘤干细胞的分离方法1、螺旋挤压法利用此方法可从肿瘤组织中获得单一肿瘤细胞，主要利用了体外3D组织培养模型（spheroid）作为皿底贴壁或者SFM的培养基。
该方法简便快速，能获得大量分离的CSCs。
2、染色质免疫沉淀法此法是针对特定的转录因子，利用其DNA结合特性设计寡核苷酸上凝集体或者DNA序列对特定转录因子进行免疫沉淀。
该方法适用于大量筛选，还可以精确定位目标CSCs。
3、表面标记技术可以通过细胞表面某些标记物的特异性抗体，将其分离出来做进一步机理研究，共同发掘肿瘤干细胞的特性。
三、肿瘤干细胞的治疗应用1、免疫治疗CSC是肿瘤细胞亚群中最具有免疫逃逸能力的细胞。
研究人员利用激活免疫细胞、转移转录因子和肿瘤相关抗原等方式，使免疫细胞杀伤CSCs。
而针对CSCs的免疫细胞在临床上同时具有治疗肿瘤的效果。
2、基因治疗针对CSCs的基因工程具有广阔的前景。
在CSCs放射抗性和化疗敏感性差的背景下，基因治疗有望通过表观遗传学、启动子甲基化、组蛋白去乙酰化等方式使CSCs的抗疗性得到扫除。
例如，近年来多项研究表明，针对CD47基因的抗体阳性踏迹分子具有在人类癌症中靶向CSCs的效果。
ZSCI肿瘤干细胞培养技术
CD45−, CD90+
CD133+, CD44+, CD26+, ALDH
References
PMID: 21318290 PMID: 19858069 PMID: 16449977 PMID: 12629218 PMID: 18775674 PMID: 15549107 PMID: 18567795
1,000
0.25
24
100
1
96
1
2
192
-彻底的混匀细胞悬液，根据上表在96孔细胞培养板中加入细胞悬液（200μL/well）； -利用显微镜观察，标记出含有单个细胞的培养板孔； -2~4周后，观察形成肿瘤球的培养板孔； -计算CSC形成肿瘤球的频率 （Analysis software: .au/software/elda/）
23
-In vivo CRC LDA
2.2 结直肠癌干细胞培养
Serially dilute cells so that you have the following final cell concentrations Tube 1 (50,000 cells/injection): 600,000 cells in 360 μL media Tube 2 (10,000 cells/injection): 120,000 cells in 360 μL media Tube 3 (1,000 cells/injection): 12,000 cells in 360 μL media Tube 4 (100 cells/injection): 1200 cells in 360 μL media Tube 5 (10 cells/injection): 120 cells in 360 μL media
pbmc肿瘤细胞共培养实验方法
pbmc肿瘤细胞共培养实验方法下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
本文下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Downloaded tips: This document is carefully compiled by the editor. I hope that after you download them, they can help you solve practical problems. The documents can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!肿瘤细胞共培养实验方法（PBMC）是一种用于研究肿瘤免疫治疗的重要技术。
肿瘤干细胞培养技术分享
肿瘤干细胞培养技术肿瘤干细胞起源：最初形成肿瘤的不一定是肿瘤干细胞（Cancer stem cells, CSCs），尽管肿瘤起始细胞有时能和CSCs互换；CSCs的存在最早是在40年前被提出来的，支持CSCs 存在的最佳证据来源于对恶性血液疾病急性白血病的研究；CSCs也被很多学者称之为肿瘤传播细胞（Tumor propagating cells, TPCs）；图中显示：CSCs不仅可以来源于正常干细胞的突变，还可以由祖细胞分化的细胞获得无限增殖潜力而形成、由分化的细胞去分化后突变形成。
肿瘤干细胞特征：1、CSCs的迁移对肿瘤远处转移的影响：CD133+胰腺癌细胞具有形成肿瘤的能力；这些细胞能够进行连续传代，说明其具有自我更新能力（Self-renewal capacity），且能够通过制造分化的、非致瘤的子代从而产生肿瘤异质性；临床生存分析也表明CD133和肿瘤患者的无疾病生存和总生存率相关；还发现，经历上皮间充质转化（EMT）的肿瘤细胞呈现CSC特性。
2、CSCs具有一些干细胞的特征，如休眠、DNA修复机制激活以及对细胞凋亡的天然抗性等。
3、CSCs对治疗耐受；Ref: Drug Discov Today, PMID: 24819719其耐受的主要机制包括：药物外排，最经典的耐药机制为ABC（ATP-binding cassette）转运蛋白、抗凋亡通路、干扰细胞分化、乙醛脱氢酶、缺氧环境等等。
肿瘤干细胞的分离：荧光激活细胞分选（FACS）和磁珠细胞分选（MACS）是分选CSCs的主要技术；FACS是通过细胞水平特殊蛋白表达、细胞培养、表观遗传学变化以及细胞标志物CD44、CD133等的表达方式来分离细胞；MACS是肿瘤干细胞分选的标准方法，根据特殊的肿瘤干细胞标志物，如CD133的表达来分离细胞。
图中是FACS和MACS常用的仪器流式细胞仪和免疫磁珠分选装置。
肿瘤干细胞标志物：Tumor type Cell surface markerAcute myeloid leukemia (AML) CD34+, CD38-Breast cancer EPCAM(ESA)+, CD44+, CD24-, ALDH, CD29, CD133 Ovarian cancer CD133+, CD44+, CD117+, CD24+Glioblastoma CD133+, CD15+Medulloblastoma CD133+, CD15+Small cell and none-small cell lungCD133+cancerHepatocellular carcinoma CD45−, CD90+Colon cancer CD133+, CD44+, CD26+, ALDHTumor type Cell surface markerMelanoma CD20+, CD271+Pancreas adenocarcinoma CD44+, CD24+Renal carcinoma CD133+Head and neck squamous cell carcinomaCD44+, ALDH1(HNSCC)LUNG CD133+, CD90, CD117, ALDH1 Prostate cancer CD44+, CD133+, CD49表中是各类肿瘤的CSC标志物，如急性髓系白血病干细胞呈现CD34阳性、CD38阴性；乳腺癌干细胞呈现ESA、CD44和ALDH阳性以及CD24阴性；卵巢癌干细胞呈现CD133、CD44、CD117和CD24阳性等。
肿瘤干细胞的研究套路-干细胞的成球实验操作步骤
肿瘤干细胞的研究套路-干细胞的成球实验操作步骤肿瘤干细胞是是一群既具有自我更新能力又具有较强的侵袭迁移的细胞，对肿瘤的存活、增殖、转移及复发有着重要作用。
肿瘤细胞的成球实验（成球大小及数目）是衡量肿瘤细胞干性的金标准。
肿瘤干细胞成球实验一般将分选干细胞放在无血清培养基、超低粘附培养皿中进行培养，但也可以细胞系做。
恶性程度高的细胞系是很容易成球的，但有的细胞系很困难，所以一般建议用肿瘤干细胞培养，细胞容易成球。
一：一般选择多大的培养皿，6孔板？培养皿可以选择6，12，24孔板，也可以选择100 mm培养皿；二：接种密度？10000~100000个/ml还是说这个都要靠自己去摸索？有没参考密度？密度需要自己摸索。
低密度常用于原代肿瘤干细胞的提取，筛选可以非粘附生长的细胞。
高密度用于细胞球的扩增，一般来说5000个/ml以上的细胞量成球比较好。
三：怎么换液？一周加两次完全培养基。
以6孔板为例，每次加入500ul，加入后轻轻摇匀，细胞球生长很缓慢，培养基中的生长因子至少能够支持2周以上。
直接加入肿瘤干细胞无血清完全培养基，不推荐直接添加的细胞生长因子，确实会影响成球质量。
一旦成球后需要消化传代，细胞球传代需要用弱的消化酶，可使用的是TrypLE Express。
据说Accutase和Dispase也可以。
消化步骤如下：170μm的细胞筛过滤收集细胞球，TrypLE Express消化。
22%BSA溶液终止消化，PBS清洗细胞2次。
3重悬细胞，计数。
4用超低吸附的细胞培养板培养细胞（6孔板中每孔加入大约1000个细胞）。
5培养大约10-14天，观察细胞成球情况并计算SPF。
成球能力是肿瘤干细胞体外鉴定的一个重要方法。
其判断的是单个细胞在合适的条件培养基中自我更新的能力，一般用细胞球形成效率（Sphere Formation Efficiency，SFE）表示。
SFE的计算方法：SFE=每孔中直径大于75um的细胞球的个数/ 每孔中原始接种细胞的总数。
肿瘤干细胞分离与分析技术
肿瘤干细胞分离与分析技术肿瘤干细胞（tumor stem cell，TSC）是肿瘤组织中具有增殖、分化、自我更新和肿瘤形成能力的一类细胞。
与普通癌细胞相比，TSC在肿瘤生长、转移和复发中起着关键作用。
因此，对TSC进行分离和分析具有重要的临床意义，有助于深入了解肿瘤的病理生理和治疗机制。
一、TSC分离技术TSC在肿瘤组织中数量极少，且不同类型的肿瘤中的TSC表达不同，因此TSC的分离技术具有一定的挑战性。
传统的TSC分离技术主要包括限制性稀释法、流式细胞术、排序细胞术和磁珠分选法。
1. 限制性稀释法这种方法是将肿瘤细胞以一定的浓度进行限制性稀释，使得每个细胞单独生长成一个肿瘤球体，由此分离出TSC。
这种方法简单易行，但效率较低，且分离出的细胞存活率较低。
2. 流式细胞术流式细胞术是一种高通量的TSC分离技术，可以通过TSC表面标志物鉴定和分离。
目前已经鉴定出许多TSC表面标志物，如CD44、CD133和CD24等。
通过流式细胞术，可以精确地分离出TSC，但仍存在一定的误差。
3. 排序细胞术排序细胞术是流式细胞术的一种改良方法，也是一种基于细胞表面标志物鉴定的技术。
与流式细胞术不同的是，排序细胞术采用电子脉冲或光束来分离细胞。
这种方法能够减少细胞损伤，提高细胞分离效率。
4. 磁珠分选法磁珠分选法是一种基于TSC表面标志物的分离技术，通过在TSC表面标志物上结合磁珠，然后用磁力分离出TSC。
这种方法具有高效、不依赖特殊设备且可以大规模筛选的优点。
二、 TSC分析技术TSC分析技术包括细胞培养、体外转移和肿瘤形成等实验方法。
这些方法可以用于探究TSC在肿瘤生长、治疗耐药和复发中的作用机制。
1. 细胞培养TSC细胞培养是TSC分离后的第一步，通过这种方法可以得到足量、纯度高的TSC，并且可以探究TSC的稳定性、增殖能力和分化能力。
目前，培养TSC的常用培养基为鼠肝基质上清液（Matrigel）。
在Matrigel中培养的TSC可以保持其自我更新和分化能力，从而为肿瘤的治疗提供理论基础。
肿瘤细胞培养技术
肿瘤细胞培养技术《肿瘤细胞培养技术》肿瘤细胞培养可不像养小猫小狗那么简单，这是一个挺复杂又特别有趣的事儿。
肿瘤细胞培养得有个合适的环境，就像人得住在房子里一样。
这房子就是培养容器，常见的有培养瓶、培养皿之类的。
这些容器得干净得很，不能有乱七八糟的东西，就像咱们住的房子得打扫干净一样。
而且啊，这容器的材质还得适合肿瘤细胞生长，得让细胞在里面感觉舒舒服服的。
说到肿瘤细胞生长的“食物”，那就是培养基啦。
培养基就像咱们吃的饭，里面有各种各样的营养成分。
有氨基酸啦，这就好比是米饭面条，给细胞提供能量。
还有维生素呢，像是菜里的营养，缺了可不行。
血清也是培养基里很重要的一部分，就像调料一样，让培养基的营养更丰富。
不过这血清可得选好，不同的肿瘤细胞可能对血清的要求还不一样呢。
有的细胞就喜欢牛血清，有的可能对马血清也能接受。
肿瘤细胞的来源也很关键。
有的是从病人身上取下来的肿瘤组织，这就像是从果园里摘了个特殊的果子。
取的时候得小心翼翼的，不能把细胞都弄伤了。
然后把这肿瘤组织处理一下，让里面的肿瘤细胞能在培养环境里好好生长。
还有些细胞是已经建立好的细胞系，这就像是已经驯化好的小动物，拿来就能养，比较方便。
在培养的过程中，温度和气体环境也得把控好。
温度一般要保持在37摄氏度左右，这就像咱们人身体的温度，细胞在这个温度下才会活力满满。
气体呢，二氧化碳和氧气的比例很重要。
二氧化碳就像是一个调节气氛的小家伙，能让培养基的酸碱度保持稳定，氧气就是细胞呼吸需要的东西，就像咱们人呼吸一样重要。
我曾经看到有人在培养肿瘤细胞的时候，因为没有控制好培养基的酸碱度，结果细胞就像闹脾气的小孩一样，不生长了。
这酸碱度啊，稍微偏一点都不行。
还有的人在换液的时候不小心把细胞给弄伤了，就像不小心踩了一脚小幼苗，细胞的生长就受到影响了。
在观察肿瘤细胞的时候也很有意思。
透过显微镜看细胞，就像看一群小小的精灵在跳舞。
有的肿瘤细胞长得圆圆的，有的则是长长的，形状各异。
肿瘤细胞培养技术
• 注意：不是每一肿瘤组织都能建株
2021/8/7
应用- 肿瘤治疗的研究
• 治疗药物敏感性的鉴定与筛选 • 肿瘤的多药耐药性的鉴定 • 各种新药治疗的实验研究
体外：肿瘤的生长（3HTdr掺入） 肿瘤的杀伤率（MTT、51Cr释放）
2021/8/7
2021/8/7
单克隆抗体的制备
2021/8/7
单克隆抗体的制备
基本原理：Bunet抗体选择学说，每个B细 胞只能够产生一种针对它的特异性抗原决定 簇的抗体。从一个祖先B细胞分裂繁殖形成 的纯细胞系，称为克隆。
2021/8/7
单克隆抗体的制备
单克隆抗体定义：来自克隆系的细胞基因完 全相同，产生的抗体完全相同。这种从一株 克隆系产生的抗体 — 单克隆抗体（McAb)。
2021/8/7
培养技术 - 取材
• 手术标本 • 活检标本 • 胸腹水穿刺 • 细针头穿刺 • 内窥镜活检
关键：新鲜、无菌、及时、准确
2021/8/7
技术- 分离纯化
• 分离：剪碎、酶消化、Ficoll、Percoll等 密度沉降分离
• 纯化：反复贴壁去除成纤维细胞 自然淘汰去除正常细胞 利用特异抗原标志筛选法( panning) 分亚型 流式细胞仪分选 克隆建株 高转移株的建立：反复接种
胞移入HAT培基中，按免疫脾细胞2×10 5 / 孔/96孔， 加入 0.1 ml ~ 0.2 ml/孔（已加入融合当天 制备的滋养细胞）， CO2 孵箱 37 ℃。 提示： 接种10~12块96孔板，使80%杂交瘤生长为 单克隆，减少克隆化次数，阳性孔不易丢失。
2021/8/7
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
肿瘤干细胞培养技术
肿瘤干细胞起源：
最初形成肿瘤的不一定是肿瘤干细胞（Cancer stem cells, CSCs），尽管肿瘤起始细胞有时能和CSCs互换；CSCs的存在最早是在40年前被提出来的，支持CSCs 存在的最佳证据来源于对恶性血液疾病急性白血病的研究；CSCs也被很多学者称之为肿瘤传播细胞（Tumor propagating cells, TPCs）；图中显示：CSCs不仅可以来源于正常干细胞的突变，还可以由祖细胞分化的细胞获得无限增殖潜力而形成、由分化的细胞去分化后突变形成。
肿瘤干细胞特征：
1、CSCs的迁移对肿瘤远处转移的影响：CD133+胰腺癌细胞具有形成肿瘤的能力；这些细胞能够进行连续传代，说明其具有自我更新能力（Self-renewal capacity），且能够通过制造分化的、非致瘤的子代从而产生肿瘤异质性；临床生存分析也表明CD133和肿瘤患者的无疾病生存和总生存率相关；还发现，经历上皮间充质转化（EMT）的肿瘤细胞呈现CSC特性。
2、CSCs具有一些干细胞的特征，如休眠、DNA修复机制激活以及对细胞凋亡的天然抗性等。
3、CSCs对治疗耐受；
Ref: Drug Discov Today, PMID: 24819719
其耐受的主要机制包括：药物外排，最经典的耐药机制为ABC（ATP-binding cassette）转运蛋白、抗凋亡通路、干扰细胞分化、乙醛脱氢酶、缺氧环境等等。
肿瘤干细胞的分离：荧光激活细胞分选（FACS）和磁珠细胞分选（MACS）是分选CSCs的主要技术；FACS是通过细胞水平特殊蛋白表达、细胞培养、表观遗传学变化以及细胞标志物CD44、CD133等的表达方式来分离细胞；MACS是
肿瘤干细胞分选的标准方法，根据特殊的肿瘤干细胞标志物，如CD133的表达
来分离细胞。
图中是FACS和MACS常用的仪器流式细胞仪和免疫磁珠分选装置。
肿瘤干细胞标志物：
Tumor type Cell surface marker
Acute myeloid leukemia (AML) CD34+, CD38-
Breast cancer EPCAM(ESA)+, CD44+, CD24-, ALDH, CD29, CD133 Ovarian cancer CD133+, CD44+, CD117+, CD24+
Glioblastoma CD133+, CD15+
Medulloblastoma CD133+, CD15+
Small cell and none-small cell lung
CD133+
cancer
Hepatocellular carcinoma CD45−, CD90+
Colon cancer CD133+, CD44+, CD26+, ALDH
Tumor type Cell surface marker
Melanoma CD20+, CD271+
Pancreas adenocarcinoma CD44+, CD24+
Renal carcinoma CD133+
Head and neck squamous cell carcinoma
CD44+, ALDH1
(HNSCC)
LUNG CD133+, CD90, CD117, ALDH1 Prostate cancer CD44+, CD133+, CD49
表中是各类肿瘤的CSC标志物，如急性髓系白血病干细胞呈现CD34阳性、CD38阴性；乳腺癌干细胞呈现ESA、CD44和ALDH阳性以及CD24阴性；卵巢癌干细胞呈现CD133、CD44、CD117和CD24阳性等。
肿瘤干细胞培养技术：
实验室经典的CSCs分选方法为荧光激活细胞分选（FACS），现在比较常用FACS 为侧群（Side-population）分析，其原理主要为用Hoescht 33342和Rhodamine 123染色细胞，CSCs具有高耐药能力，能够排除染料，从而分选出这类不被染色细
胞，即CSCs；其缺点主要在于：耗时长、技术含量高及得到的分选细胞少。
图中是FACS实验操作的示意图，首先用特异抗体或染料标记细胞，经过流式细胞仪分选得到被标记或不被染色的细胞，再将这些分选的细胞继续培养，用于后续实验。
另一种CSCs分选方法为磁珠细胞分选（MACS）；其操作比较简便，但是一次只能够分选一个标志物；
图中是MACS实验操作示意图，首先将特异性的免疫磁珠标签于肿瘤细胞，带
CSC标志物的细胞将会被标签；用磁珠分选装置分选细胞，将带有标签的细胞吸附于分选装置上，其余细胞被洗脱；最后将标签细胞从分选装置上洗脱下来继续培养。
分选得到的细胞进行后续培养，培养的方法主要为微球培养法；
图中模式图显示：传统细胞培养技术的主要特点是将细胞培养于高血清培养基中，细胞平铺生长于培养瓶底部；而微球培养技术是将细胞培养于无血清（serum-free）培养基及超低黏附培养瓶中，在这种条件下，分化的细胞将会死亡，CSCs会继续存活并增殖形成悬浮的肿瘤细胞球。
乳腺癌干细胞（Breast cancer stem cells, BCSCs）培养模式采取的是分选后再进行肿瘤微球培养；
6孔超低黏附（吸附）培养板T25超低黏附培养瓶（美国Corning公司）
首先需要的是超低黏附培养板或超低黏附培养瓶，培养所需其他材料还包括细胞培养基、细胞因子及其他添加试剂等，如DMEM/F12基础培养基、重组人表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、双抗、B27、胰岛素等。
培养BCSCs实验步骤主要为：
1、配置BCSCs培养基，
上图中显示了配置50 mL BCSCs培养基所需要添加的各种试剂浓度及体积。
2、将分选后的细胞接种于超低黏附培养板，一般使用6孔板，添加4 mL
BCSCs培养基，以一定的梯度接种，一般为1000~20000个细胞/孔，以确定
后期细胞传代的密度及该密度下细胞的生长周期。
3、对生长过程中的BCSCs进行拍照：一般隔天进行拍照，如0/2/4/6或0/1/3/5/7天进行拍照，拍出来的效果如图所示
上图为乳腺癌细胞MDA-MB-231的肿瘤干细胞第0/2/4/6天图片，右边为对比的普通肿瘤细胞；
下图为是鼠来源的乳腺癌细胞4T1的肿瘤干细胞第0/1/3/5/7天图片；
可以发现其细胞生长前期长势慢，后期快，一般一周左右传代一次，中途需要添加BCSCs培养基。
4、裸鼠移植瘤实验检测分选培养的CSCs的体内成瘤能力；这个实验需要对比肿瘤干细胞和对应的普通肿瘤细胞的体内成瘤能力，两种细胞的注射密度不一致，肿瘤干细胞的体内注射密度可以比普通肿瘤细胞低2~3个数量级，实验流程如示
意图所示；
此项实验注意事项为：首先，建议做体内移植瘤之前用流式细胞术检测所培养CSCs的干细胞标志物比率，如BCSCs的干细胞标志物CD44和CD24等，既能说明培养方式未使CSCs分化或分化减少，又能保证体内移植瘤实验的成功率；体内移植瘤模型，一般皮下成瘤即可，原位移植瘤当然更好；且实验过程中，既要关注移植瘤的成瘤率，还要关注其成瘤时间，可在伦理准许范围内适当延长实验时间，以保证实验的准确性。
5、体外检测CSCs相关因子及干细胞标志物等；
如图所示，免疫荧光检测乳肿瘤干细胞微球体干细胞生物标志物CD44/CD24/ALDH的表达情况显示：CD44/ALDH高表达、CD24低表达；
检测干性相关因子Nanog/Oct-4/Sox-2/C-myc，如图所示，
对比普通肿瘤细胞和肿瘤干细胞的干细胞因子表达量，发现Nanog/Oct-4/Sox-2均在肿瘤干细胞微球体中高表达；但是一般不建议进行对比，因为两种细胞的培养条件完全不一致；检测肿瘤干细胞自我更新能力，如图所示：
肿瘤干细胞传代20次后仍能保持微球状态而未分化；检测CSCs的上皮间充质转化（EMT）相关指标，一般较少单独检测，除非做到EMT相关转移研究。
结直肠癌干细胞培养：
基本和乳腺癌干细胞培养一致；首先配置结直肠癌干细胞培养基，
跟BCSCs培养基的配置相比差别较大，只需要加入常用的几个细胞生长因子；干细胞相关标志物也不同，结直肠癌干细胞标志物一般检测CD133/CD44等，下图是细胞免疫组化检测干细胞标志物结果。
极限稀释法（ELDA）检测肿瘤干细胞特征：体外极限稀释法如示意图所示，
首先消化肿瘤干细胞制成单细胞悬液，细胞计数，按照一定密度种板，3周后观察96孔板中形成肿瘤微球的孔板，用极限稀释法在线软件计算肿瘤球形成频率；
细胞接种时的密度、稀释方法、所需要的96孔板孔数以及培养板数如图表所示。
体内极限稀释法如示意图所示，
细胞经消化计数后吸入注射器中，同时还要加入基质胶以保证成瘤率，然后注射入小鼠体内，一只小鼠注射两次；这是细胞注射密度以及稀释方法；所需的注射器数及小鼠数量以及简化的实验步骤和计算网站如图表所示。