肿瘤干细胞培养技术分享

肿瘤干细胞培养技术

肿瘤干细胞起源：

最初形成肿瘤的不一定是肿瘤干细胞（Cancer stem cells, CSCs），尽管肿瘤起始细胞有时能和CSCs互换；CSCs的存在最早是在40年前被提出来的，支持CSCs 存在的最佳证据来源于对恶性血液疾病急性白血病的研究；CSCs也被很多学者称之为肿瘤传播细胞（Tumor propagating cells, TPCs）；图中显示：CSCs不仅可以来源于正常干细胞的突变，还可以由祖细胞分化的细胞获得无限增殖潜力而形成、由分化的细胞去分化后突变形成。

肿瘤干细胞特征：

1、CSCs的迁移对肿瘤远处转移的影响：CD133+胰腺癌细胞具有形成肿瘤的能力；这些细胞能够进行连续传代，说明其具有自我更新能力（Self-renewal capacity），且能够通过制造分化的、非致瘤的子代从而产生肿瘤异质性；临床生存分析也表明CD133和肿瘤患者的无疾病生存和总生存率相关；还发现，经历上皮间充质转化（EMT）的肿瘤细胞呈现CSC特性。

2、CSCs具有一些干细胞的特征，如休眠、DNA修复机制激活以及对细胞凋亡的天然抗性等。

3、CSCs对治疗耐受；

Ref: Drug Discov Today, PMID: 24819719

其耐受的主要机制包括：药物外排，最经典的耐药机制为ABC（ATP-binding cassette）转运蛋白、抗凋亡通路、干扰细胞分化、乙醛脱氢酶、缺氧环境等等。

肿瘤干细胞的分离：荧光激活细胞分选（FACS）和磁珠细胞分选（MACS）是分选CSCs的主要技术；FACS是通过细胞水平特殊蛋白表达、细胞培养、表观遗传学变化以及细胞标志物CD44、CD133等的表达方式来分离细胞；MACS是

肿瘤干细胞分选的标准方法，根据特殊的肿瘤干细胞标志物，如CD133的表达

来分离细胞。

图中是FACS和MACS常用的仪器流式细胞仪和免疫磁珠分选装置。

肿瘤干细胞标志物：

Tumor type Cell surface marker

Acute myeloid leukemia (AML) CD34+, CD38-

Breast cancer EPCAM(ESA)+, CD44+, CD24-, ALDH, CD29, CD133 Ovarian cancer CD133+, CD44+, CD117+, CD24+

Glioblastoma CD133+, CD15+

Medulloblastoma CD133+, CD15+

Small cell and none-small cell lung

CD133+

cancer

Hepatocellular carcinoma CD45−, CD90+

Colon cancer CD133+, CD44+, CD26+, ALDH

Tumor type Cell surface marker

Melanoma CD20+, CD271+

Pancreas adenocarcinoma CD44+, CD24+

Renal carcinoma CD133+

Head and neck squamous cell carcinoma

CD44+, ALDH1

(HNSCC)

LUNG CD133+, CD90, CD117, ALDH1 Prostate cancer CD44+, CD133+, CD49

表中是各类肿瘤的CSC标志物，如急性髓系白血病干细胞呈现CD34阳性、CD38阴性；乳腺癌干细胞呈现ESA、CD44和ALDH阳性以及CD24阴性；卵巢癌干细胞呈现CD133、CD44、CD117和CD24阳性等。

肿瘤干细胞培养技术：

实验室经典的CSCs分选方法为荧光激活细胞分选（FACS），现在比较常用FACS 为侧群（Side-population）分析，其原理主要为用Hoescht 33342和Rhodamine 123染色细胞，CSCs具有高耐药能力，能够排除染料，从而分选出这类不被染色细

胞，即CSCs；其缺点主要在于：耗时长、技术含量高及得到的分选细胞少。

图中是FACS实验操作的示意图，首先用特异抗体或染料标记细胞，经过流式细胞仪分选得到被标记或不被染色的细胞，再将这些分选的细胞继续培养，用于后续实验。

另一种CSCs分选方法为磁珠细胞分选（MACS）；其操作比较简便，但是一次只能够分选一个标志物；

图中是MACS实验操作示意图，首先将特异性的免疫磁珠标签于肿瘤细胞，带

CSC标志物的细胞将会被标签；用磁珠分选装置分选细胞，将带有标签的细胞吸附于分选装置上，其余细胞被洗脱；最后将标签细胞从分选装置上洗脱下来继续培养。

分选得到的细胞进行后续培养，培养的方法主要为微球培养法；

图中模式图显示：传统细胞培养技术的主要特点是将细胞培养于高血清培养基中，细胞平铺生长于培养瓶底部；而微球培养技术是将细胞培养于无血清（serum-free）培养基及超低黏附培养瓶中，在这种条件下，分化的细胞将会死亡，CSCs会继续存活并增殖形成悬浮的肿瘤细胞球。

乳腺癌干细胞（Breast cancer stem cells, BCSCs）培养模式采取的是分选后再进行肿瘤微球培养；

6孔超低黏附（吸附）培养板T25超低黏附培养瓶（美国Corning公司）

首先需要的是超低黏附培养板或超低黏附培养瓶，培养所需其他材料还包括细胞培养基、细胞因子及其他添加试剂等，如DMEM/F12基础培养基、重组人表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、双抗、B27、胰岛素等。

培养BCSCs实验步骤主要为：

1、配置BCSCs培养基，

上图中显示了配置50 mL BCSCs培养基所需要添加的各种试剂浓度及体积。

2、将分选后的细胞接种于超低黏附培养板，一般使用6孔板，添加4 mL

BCSCs培养基，以一定的梯度接种，一般为1000~20000个细胞/孔，以确定