流加发酵与高密度培养
大肠杆菌发酵经验总结
⼤肠杆菌发酵经验总结⼤肠杆菌发酵经验总结⾸先，补料速率与⽐⽣长速率直接影响着⼄酸的⽣成速率和积累量（主要是补料速率与⽐⽣长速率影响发酵液中的残糖量，进⽽影响），所以适当的控制补料速率和⽐⽣长速率，对于控制⼄酸的量有很好的效果。
其次，必须要保证充⾜的溶氧，并严格控制pH值，⽽且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋⽩的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所⽣产出的蛋⽩⼤多是有活性的，⽽较⾼的发酵温度下产⽣的蛋⽩⼤多⼀包涵体形式存在。
第三，选取合理的诱导时间⾮常重要，⼀般的诱导时间选在指数⽣长后期，⽽且诱导时的⽐⽣长速率最好能控制在0.2之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速⽣长期与蛋⽩合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋⽩的⾼表达；2.已经得到了⼤量的菌体，⽽且菌体的⽣物量基本接近稳定，不论是从动⼒学⾓度，还是能耗，物料成本⽅⾯，都⽐较合理。
第四，补料过程中的碳氮⽐也很重要。
若氮源过⾼，会使菌体⽣长过于旺盛，pH偏⾼，不利于代谢产物的积累，氮源不⾜，则菌体繁殖量少从⽽影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体⽣长，碳源不⾜，则容易引起菌体的衰⽼和⾃溶。
另外，碳氮⽐不当还会引起菌体按⽐例的吸收营养物质，从⽽直接影响菌体的⽣长和产物的合成。
根据⾃⼰的经验，⼀般情况下，对于⼀个稳定的发酵⼯艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，⽽且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮⽐不合理造成的。
可以适当调整碳氮⽐。
⼤家讨论得较多的是关于代谢副产物⼄酸对⼤肠杆菌发酵的影响，针对我们论坛所发的帖，我先总结以下⼏点，并作出相应解决措施。
⼀、代谢副产物-⼄酸⼄酸是⼤肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多⼤的浓度下产⽣抑制作⽤各种说法不⼀，⼀般认为在好⽓性条件下，5～10g/L 的⼄酸浓度就能对滞后期、最⼤⽐⽣长速率、菌体浓度以及最后蛋⽩收率等都产⽣可观测到的抑制作⽤。
当⼄酸浓度⼤于10或20g/L 时，细胞将会停⽌⽣长，当培养液中⼄酸浓度⼤于12g/L 后外源蛋⽩的表达完全被抑制。
第二章 流加发酵与高密度培养
微生物的高细胞密度培养
概述
发酵研究和工业的一个主要目标是使 体积生产率（g/L•h）最大化，即在 给定体积中和一定时间内获得尽可能 多的产品数量。 高细胞密度培养是高生产效率的要求。 历史上，高细胞密度培养首先建立在 酵母上，用以生产单细胞蛋白、乙醇 和菌体。
概述
后来，建立起其它的嗜温菌的高密度培养，生 产各种类型产品。 甲基营养生物的高密度培养导致了聚羟基烷酸 的高效生产。 如今，微生物的高细胞密 度培养的范畴已包括细菌、 古细菌和真核生物（酵母）。
温度的影响
把培养温度从 37 ℃降到 26 －30℃，会降低营养吸收和 生长速度，因此会减少有毒副产物和代谢产生的热量。 降低温度也能减少细胞对氧的需求。
降低重组细胞温度也有可能减少包含体形式的蛋白质 的产生。
以上这些优点说服了许多研究者使用低温，对大肠杆菌 进行高细胞密度培养。
HCDC遇到的问题
二氧化碳和放热的影响
HCDC中高细胞密度培养中的二氧化碳会影响细胞的生长。 高CO2分压（>0.3atm）会降低生长速率并刺激乙酸的生成。
放热也是高细胞密度培养的一个问题。
热量的主要来源是搅拌产生的机械热和细胞代谢产生的热量。
这些问题可通过降低细胞比生长速率而部分的解决。
HCDC遇到的问题
HCDC中各种微生物的最大细胞密度
微生物 细菌 Methylobacterium extorquens Escherichia coli DCW（g/l） 233 190 180 148 145 184 184 157 141 100 132 114 268 208 235 100
概述
Bacillus subtilis Alcaligenes eutrophus NCIMB 11599 Streptomyces laurentii Lactococcus lactis Pseudomonas putida BM01 古细菌 Marinococcus M52 Sulfolobus hibatae 真核 Candida brassicae Saccharomyces serevisiae Pichia pastoris
高密度发酵
Fig. 3 Fatty acid profiles(in mg/g cell dry weight(CDW)) as a function of time filled circles = C16:0（十六碳酸）, empty circles = C16:1, filled triangles = C18:0, empty triangles = C18:1（油酸）, and filled squares = C18:2（亚油酸）
When the total biomass was characterised at the end of the fermentation,he cell viability was also measured. The HCD fermentations showed similar viabilities at the end of fermentation, but the REF condition showed a slightly decreased percentage of living cells. This indicates that the long duration of fermentation had a negative influence on the yeast viability but that yeast viability remained at an acceptable level in all fermentations .
The role of oxygen in yeast metabolism during high cell density brewery fermentations
Appl Microbiol Biotechnol
微生物的高密度培养
微生物的高密度培养高密度培养的定义：高密度培养：是应用一定的培养技术和设备来提高菌体生物量和目标产物时空产率的发酵技术。
一般认为，细胞密度接近理论值的培养为高密度培养。
但由于菌种、菌株及目标产物差异性较大，高密度培养的最终菌体生物量无法用一个确切的值或范围界定。
Riesenbere经计算认为，理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400g/L，考虑到实际情况的种种条件限制，Markel等认为最高菌体密度为200 g/L，此时，发酵液25%充满长3μm，宽1μm的菌体，发酵液粘度很高，几乎散失流动性。
而某些极端微生物细胞密度达到数克每升也可认为是高密度培养。
高密度培养技术最早用于酵母细胞的培养提高生物量或生产单细胞蛋白及乙醇的生产。
随着基因工程技术的发展和应用，构建基因工程菌已经成为提高目标蛋白表达水平的一项基本手段。
基因工程菌过量表达目标产物还有助于简化后续的分离纯化操作，同时也便于基因工程改造。
其中大肠杆菌、酵母是最常用的重组表达宿主菌高密度培养的优势:提高最终菌体生物量和目标产物的时空产率,缩小生物反应器体积，降低设备投资缩短发酵周期，减少水电使用，降低生产成本便于下游分离纯化工艺等高密度培养主要限制因素:固态或挥发性底物在液态培养基中,溶解限制底物对细胞生长可能存在限制或抑制作用。
底物和产物的稳定性差或易挥发产物降解产物或代谢副产物的积累，对细胞生长产生限制。
呼吸作用导致C02和热量的急剧积聚氧气需求量大，培养基黏度增加副产物的积累与毒害作用。
高密度培养的培养基：高密度培养要求培养基含有细胞生长所需的所有营养成分，配比均衡，且浓度不会对细胞生长产生抑制作用。
一般采用营养成分清晰的全合成培养基，便于发酵过程的调节控制和进一步的扩大培养。
培养基必须包含细胞生长必需的碳源、氮源、无机盐及生长因子。
高密度培养的初始发酵培养基营养成分必须低于抑制浓度，并结合恰当的流加补料策略提供营养物质，使细胞生长维持在最佳状态。
一种酿酒酵母高密度发酵培养的方法
一种酿酒酵母高密度发酵培养的方法酿酒酵母是一种重要的微生物资源，广泛应用于酿造行业。
高密度发酵培养是提高酿酒酵母生产效率的关键技术之一。
本文将介绍一种高密度发酵酿酒酵母的培养方法。
首先，酿酒酵母的培养基是高密度发酵的关键。
传统的酵母培养基主要由碳源、氮源、无机盐和微量元素组成。
在高密度发酵中，碳源的选择对提高酵母生长速度和酒精产生率很重要。
常用的碳源有葡萄糖、麦芽糖和淀粉等。
氮源是合成蛋白质和酵母细胞增殖的关键，常用的氮源有尿素、酵母浸渍物和氨态氮等。
在培养基中添加适量的无机盐和微量元素可以提供必需的元素，维持酵母细胞的正常生长和代谢活动。
其次，培养条件的调控对高密度发酵效果也有影响。
温度是控制酵母生长速率和代谢的重要因素，一般酿酒酵母的适宜培养温度为28-32摄氏度。
pH值是影响酵母生长和酒精产生的重要因素，常规条件下酵母培养基的pH值在4.5-5.5之间。
通风条件也是高密度发酵的重要指标，合理的通风条件有利于提供足够的氧气，促进酵母的代谢活动。
此外，酿酒酵母的菌种的选取也是高密度发酵成功的关键。
目前常用的菌种包括酒链球菌、面包酵母等。
选取适宜的菌株是提高高密度发酵效率的前提，菌株应具有良好的生长能力和耐受性，能够在高浓度的酒精环境中生存和繁殖。
最后，监控和调控发酵过程对高密度发酵的成功也至关重要。
通过监测酵母生长曲线、酒精产量和其它重要的发酵参数，可以及时发现并纠正发酵过程中的问题，提高发酵效果。
在发酵过程中，定期采集发酵液进行物理化学分析和微生物检验，以确保发酵过程的有效控制。
综上所述，高密度发酵是提高酿酒酵母生产效率的重要手段之一。
通过优化培养基组成、调控培养条件、选用合适的菌株以及监控和调控发酵过程，可以取得较高的发酵效果。
酒精工业可以借鉴这些方法，提高酿酒酵母的生产效率，推动酒精工业的可持续发展。
流加培养名词解释-概述说明以及解释
流加培养名词解释-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述流加培养作为生物学和微生物学领域的一种培养方法，是一种通过提供适当的培养基和环境条件来满足细胞或微生物生长和繁殖的需求的过程。
它是一种广泛应用于实验室和工业生产中的技术，对于研究生物学和微生物学以及制造生物制品具有重要意义。
流加培养的基本原理是通过向培养基中连续添加新的培养液来维持细胞或微生物的生长。
在流加培养中，培养液会通过一个进料管源源不断地被加入到培养基中，而废液则通过排液管定期排除。
这种持续供给新鲜培养液和同时排除废液的过程，使得培养物中的养分始终处于较高的浓度，同时也有效地去除了代谢产物和有害物质，为细胞或微生物的生长提供了一个良好的环境。
流加培养广泛应用于许多领域，包括生物技术、生物制药和科学研究等。
在生物技术领域，流加培养被用于生产重组蛋白、表达目的蛋白以及制造生物燃料等。
在生物制药领域，流加培养可以用于生产抗生素、疫苗和其他生物制剂。
在科学研究中，流加培养被用于研究细胞生长和发育、细胞代谢以及微生物的生理学等。
尽管流加培养在许多方面具有优势，但也存在一些缺点。
流加培养的设备和操作相对复杂，需要一定的技术支持和成本投入。
此外，对于某些细胞或微生物来说，流加培养可能无法提供最适宜的生长环境。
因此，在选择培养方法时，需要根据具体的需求和实际情况进行权衡和选择。
综上所述，流加培养作为一种常用的生物学和微生物学培养方法，在实验室和工业中具有广泛的应用。
通过提供连续的培养液供给和废液排除，流加培养为细胞和微生物的生长提供了一个稳定和良好的环境。
然而，在实际应用中也需要考虑到其设备复杂性和适用性。
1.2文章结构文章结构部分内容：在本文中，我将按照以下结构来组织和呈现关于流加培养的相关内容。
首先，在引言部分，我会对流加培养进行概述，介绍其基本概念和背景。
接着，我会详细阐述本文的结构，包括各个章节的内容和组织方式。
最后，我会明确阐明本文的目的和意图。
动物细胞大规模培养技术
大规模培育技术应用简介通过大规模体外培育技术培育哺乳类动物细胞是生产生物制品的有效方法。
20 世界 60-70年月，就已创立了可用于大规模培育动物细胞的微载体培育系统和中空纤维细胞培育技术。
近十数年来，由于人类对生长激素、干扰素、单克隆抗体、疫苗及白细胞介素等生物制品的需求猛增，以传统的生物化学技术从动物组织猎取生物制品已远远不能满足这一需求。
随着细胞培育的原理与方法日臻完善，动物细胞大规模培育技术趋于成熟。
所谓动物细胞大规模培育技术〔large-scale culture technology〕是指在人工条件下〔设定ph、温度、溶氧等〕，在细胞生物反响器〔bioreactor〕中高密度大量培育动物细胞用于生产生物制品的技术。
目前可大规模培育的动物细胞有鸡胚、猪肾、猴肾、地鼠肾等多种原代细胞及人二倍体细胞、cho〔中华仓鼠卵巢〕细胞、BHK-21(仓鼠肾细胞)、Vero 细胞(非洲绿猴肾传代细胞，是贴壁依靠的成纤维细胞)等，并已成功生产了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、甲型肝炎疫苗、乙型肝炎疫苗、红细胞生成素、单克隆抗体等产品。
在过去几十年来，该技术经有了很大进展，从使用转瓶(roller bottle) 、CellCube 等贴壁细胞培育，进展为生物反响器〔Bioreactor〕进展大规模细胞培育。
第一代细胞培育技术核心问题是难以产业化或者说是规模化生产：一是在工艺生产时不能大规模制备产品；二是非批量生产简洁导致产品质量的不均一性；三是难以对同批生产进展生产和质量控制。
随着生物技术的进展，迫切需要大规模的细胞培育，特别是培育表达特异性蛋白的哺乳动物细胞，以便获得大量有用的细胞表达产物。
承受玻璃瓶静置或旋转瓶的培育方法，已不能满足所需细胞数量及其分泌产物。
因而必需为工业化生产开创一种的技术方法。
自 70 年月以来，细胞培育用生物反响器有很大的进展，种类越来越多，规模越来越大，较常见的细胞培育生物反响器有空气提升反响器，中空纤维管反响器，无泡搅拌反响器及篮式生物反响器等。
高密度发酵
2 溶氧浓度
随着发酵时间的延长，菌体密度迅速增 加，溶氧浓度随之下降，细胞的生长减慢。 特别是高密度发酵的后期，由于菌体密度的 扩增，耗氧量极大，发酵罐各项物理参数均 不能满足对氧的供给，导致菌体生长极为缓 慢，外源蛋白的表达量也较差。
在发酵过程中保证适宜的溶氧浓度， 必须确定发酵罐的通气量和搅拌速度。
二、分离纯化的基本过程
由于基Байду номын сангаас工程药物是从转化细胞、而不是
从正常细胞生产的，所以对产品的纯度要求也
要高于传统产品。
基因工程药物的分离纯化一般不应超过4-5
个步骤，包括细胞破碎、固液分离、浓缩与初
步纯化、高度纯化直至得到纯品以及成品加工
发酵液
细胞分离
胞内产物
细胞破碎 固液分离 包含体 变性 复性 细胞碎片分离
贫氧条件下对氧的利用率。
3 构建蛋白水解酶活力低的工程化宿主 菌 对于以可溶性或分泌形式表达的目 标蛋白而言，随着发酵后期各种蛋白水 解酶的累积，目标蛋白会遭到蛋白水解 酶的作用而被降解。
第八节 基因工程药物的分离纯化
基因工程药物的分离、纯化非 常重要。表达的产物都是多肽或蛋 白质 。它的制得具有以下特点：
疏水层析 凝胶过滤 0.22μm微孔滤膜过滤
六、非蛋白质杂质的去除
DNA、热原质和病毒的纯化方法：
1、 DNA的去除：DNA在pH4.0以上呈阴离 子，可用阴离子交换剂吸附除去,目的 蛋白的pI应该在6.0以上。亲和层析和 疏水层析也有效。
2、热原质的去除：热原质是肠杆菌科产 生的细菌内毒素（脂多糖），去除困难。 分子量小的多肽或蛋白质中的热原可用 超滤或反渗透，脂多糖是阴离子可用阴 离子交换层析除去，脂多糖是疏水性可 用疏水层析法。 3、病毒的去除：层析或过滤可将病毒去 除。
白酒酿造优化方案(复习重点)
1、何谓流加发酵？答：所谓流加发酵，即补料分批发酵(Fed-batch fermentation)，有时又称半连续培养或半连续发酵，是指在分批发酵过程中间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方法2、写出Monod 方程，并写出其成立的条件和各参数的意义。
答： 条件：温度和pH 恒定时(1)菌体生长为均衡型非结构生长；(2)培养基中只有一种底物是生长限制性底物；(3)菌体产率系数恒定参数意义：μmax 称为最大比生长速率(h-1)，Ks 称为半饱和常数(g/L),S 为限制性底物浓度。
3、细胞高密度培养过程存在的问题有哪些？其相应解决措施有哪些？答：问题：1.产物或代谢副产物的积累对生长的抑制2.氧的限制3.HCDC 中培养基粘度不断增加，引起混合不充分4.CO2和热量的高释放率解决措施1.控制比生长速率在产生乙酸的临界值以下选择合适的培养基2提高通气速率和搅拌速度富氧空气和纯氧在加压环境下培养 SK S s +=max μμ3有必要研究发酵罐中的搅拌模型，找到改善搅拌的方法。
4通过降低细胞比生长速率而部分的解决把培养温度从37℃降到26－30℃，会降低营养吸收和生长速度，因此会减少有毒副产物和代谢产生的热量。
降低温度也能减少细胞对氧的需求。
降低重组细胞温度也有可能减少包含体形式的蛋白质的产生。
4、无反馈控制的流加策略有哪些？答：开环（无反馈）控制恒速流加——以预先决定的（恒定的）速率流加营养物质，比生长速率逐渐降低。
加速流加——以逐渐增加的速率流加营养物质。
可补偿一些比生长速率的降低。
指数流加——以指数的速率流加营养物质。
可得到恒定的比生长速率。
闭环（反馈）控制即时DO——当DO降低时补加营养物质。
即时pH——主要碳源耗尽引起pH上升时补加营养物质。
二氧化碳释放率（CER）——CER基本正比于碳源的消耗速度。
这一方法最为经常用于控制比生长速率。
细胞浓度——营养物质流加速率由细胞浓度决定。
底物浓度控制——营养物质流加速率直接由主要碳源的浓度控制5、何谓发酵产物的理论得率？可由哪些途径计算得到？答：假设发酵过程中完全没有菌体生成，则YP/S 可达理论最高值，称为理论代谢产物产率 计算途径（a ）根据化学计量关系计算例如，由葡萄糖、氨和氧生成谷氨酸的化学计量方程为∶依此计算 =147/180=0.82 （b ）由生物化学计量关系计算根据由底物生成目标代谢产物的代谢途径，进行代谢过程中有关NAD(P)+和ATP 等辅底物的物料衡算，结合化学计量关系可求出下式 由该反应式得 =(147×12)/(13×180)=0.75由于NADPH 和ADP 的再生过程要消耗底物，故依这种方法求得的值要小于单纯依据化学计量关系求得的结果。
高密度培养
基因工程菌高密度培养
High Cell-Density Culture
浙江工业大学 杭州
课前思考：
1、为什么凉开水养不活鱼？
2、为什么菜市场卖鱼的地方需 要一个鼓气设备？ 3、什么物质在水中的溶解度随 着温度的升高而降低？ 4、进一步增加鱼的密度，而且 要保证鱼不死，你能想出其它办法 吗？
c、磷：磷是DNA的组成成分
酵母膏、蛋白胨等可以提供全面的营养
3、解决环境毒性问题 部分微生物代谢产物对细胞有 一定的毒性。比如乙酸（酵解产物） pH改变
4、防止质粒丢失
丢失质粒的细胞具有生长优 势，但是它不含目的基因，所 以不能合成产物。
解决方案
1、关于供氧：
a、通入空气、搅拌
b、提高搅拌速度
关于质粒丢失：
在培养基中添加抗生素，丢失质 粒的细胞不能生长或死亡，即给予 适当的选择压力。
氨苄青霉素易失活，培养中 期补加氨苄青霉素，维持选择压 力
诱导时机的选择也非常重要 在生长前期，无诱导剂可以使 细胞快速生长，加入诱导剂诱导目 的基因表达会抑制细胞的增殖能力。 所以，过早诱导会影响细胞密度。 在细胞达到一定密度以后加入 诱导剂，可以得到高密度发酵液。 一般选在对数生长期的中后期诱导
高密度培养：
单位体积内细胞数量高于 常规的培养模式。 E.coli最高密度理论值：400g/L （DCW Dry Cell Weight） 国外达到：200g/L
国内小于50g/L
高密度培养的意义：
1、节约诱导剂的用量：摩尔浓度
相同，体积越小，诱导剂用量越少。
微生物的高密度培养
微生物的高密度培养高密度培养的定义：高密度培养：是应用一定的培养技术和设备来提高菌体生物量和目标产物时空产率的发酵技术。
一般认为，细胞密度接近理论值的培养为高密度培养。
但由于菌种、菌株及目标产物差异性较大，高密度培养的最终菌体生物量无法用一个确切的值或范围界定。
Riesenbere经计算认为，理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400g/L，考虑到实际情况的种种条件限制，Markel等认为最高菌体密度为200 g/L，此时，发酵液25%充满长3μm，宽1μm的菌体，发酵液粘度很高，几乎散失流动性。
而某些极端微生物细胞密度达到数克每升也可认为是高密度培养。
高密度培养技术最早用于酵母细胞的培养提高生物量或生产单细胞蛋白及乙醇的生产。
随着基因工程技术的发展和应用，构建基因工程菌已经成为提高目标蛋白表达水平的一项基本手段。
基因工程菌过量表达目标产物还有助于简化后续的分离纯化操作，同时也便于基因工程改造。
其中大肠杆菌、酵母是最常用的重组表达宿主菌高密度培养的优势:提高最终菌体生物量和目标产物的时空产率,缩小生物反应器体积，降低设备投资缩短发酵周期，减少水电使用，降低生产成本便于下游分离纯化工艺等高密度培养主要限制因素:固态或挥发性底物在液态培养基中,溶解限制底物对细胞生长可能存在限制或抑制作用。
底物和产物的稳定性差或易挥发产物降解产物或代谢副产物的积累，对细胞生长产生限制。
呼吸作用导致C02和热量的急剧积聚氧气需求量大，培养基黏度增加副产物的积累与毒害作用。
高密度培养的培养基：高密度培养要求培养基含有细胞生长所需的所有营养成分，配比均衡，且浓度不会对细胞生长产生抑制作用。
一般采用营养成分清晰的全合成培养基，便于发酵过程的调节控制和进一步的扩大培养。
培养基必须包含细胞生长必需的碳源、氮源、无机盐及生长因子。
高密度培养的初始发酵培养基营养成分必须低于抑制浓度，并结合恰当的流加补料策略提供营养物质，使细胞生长维持在最佳状态。
2、什么是高密度培养,举例论述如何利用高密度培养技术来
2、什么是高密度培养，举例论述如何利用高密度培养技术来某一产品的。
答：高密度培养有时也称高密度发酵，一般是指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术，现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌生产多肽类药物的实践中逐渐发展起来的。
重组大肠杆菌高密度培养技术摘要：阐述了基因工程菌高密度发酵工艺的几个主要影响因素,包括重组菌构建、培养条件、生长抑制因子以及它们的控制技术。
通过高密度发酵可以提高细胞生长密度、目的蛋白的表达含量。
在高密度发酵过程中,会产生一些有害抑制代谢副产物,但通过分批补料可以降低影响。
关键词:高密度发酵; 分批补料; 生长抑制因子。
重组ＤＮＡ技术和大规模培养技术的有机结合,使得原来无法大量获得的天然蛋白质能够规模生产。
目前,已经在高密度培养中成功地提高了同源和异源蛋白的产量。
分批补料培养通常被用于微生物发酵,这种方法通过在培养过程克服细胞的调节机制:苹果酸影响,催化阻遏,产生抑制,使细胞密度达到较高水平。
大肠杆菌高密度培养工艺广泛地应用于重组蛋白的生产,这主要是由于大肠杆菌的遗传学和生理学已基本被认清。
产量的高低主要取决于细胞密度、目的蛋白的表达含量。
但在培养过程也存在一些问题,如氧、基质的利用率、小分子物质、生长抑制物的积累等。
因此,减少抑制物的形成,提供良好的生长条件是必要的。
1 重组大肠杆菌构建的几个影响因素1.1宿主菌的选择不同的大肠杆菌菌株在培养条件和外源基因表达能力上存在很大差别。
现在普遍应用的大肠杆菌ＢＬ21(ＤＥ3)ｐｌｙｓＳ因其带有编码Ｔ7溶菌酶的小质粒,而有效地降低杂蛋白的表达,但不影响ＩＰＴＧ诱导目的蛋白的表达水平,从而成为近年来最为常用的宿主菌。
表达产物的形成在大肠杆菌体内有三条路径:第一,形成稳定的天然构象,可溶且有活性,不易被降解;第二,蛋白质是可溶性的,但构象为非天然状态,易被胞内的各种蛋白酶识别降解;第三,多肽链间彼此聚集形成不可溶的包涵体,并且有蛋白酶抗性。
发酵工艺：工程菌高密度发酵工艺开发策略8项(以大肠杆菌为例)
发酵工艺：工程菌高密度发酵工艺开发策略8项（以大肠杆菌为例）利用重组DNA技术获取的生物药物在人类文明史上具有划时代的意义。
许多价值高产量低的功能蛋白如干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、生长激素、胰岛素、人血白蛋白、蛋白酶等都在工程菌中获得了高效率表达。
由于工程菌高密度培养能够提高单位体积的产量，在工业生产上可以提高效率降低成本。
所以，高密度培养一直都是发酵工程师们所追捧的热点。
本文就工程大肠杆菌高密度发酵工艺开发中涉及的关键控制点加以探讨。
1工程菌种稳定可靠的菌种是工业化大生产的有力保障，直接关系到生产效率和成本高低。
不同于传统诱变育种模式，在对待工程菌菌种问题上，有人认为基因工程菌种构建完成后无需经过严格单克隆筛选，既节约时间成本又大大减少了工作量，这其实是一个认识误区。
这样做出来的菌种很难连续稳定传代50次以上，给中试放大以及后续的长期稳定生产留下了隐患。
业内一般以能否稳定遗传50代作为判断工程菌种优劣的一个标准。
发酵所需的接种量不是越大越好，要适当。
接种量过小导致适应期过长，菌种易提前老化，也增加了杂菌污染的风险。
接种量过大会过早引起溶氧不足，导致发酵失控。
且营养物质消耗过快也会影响后期正常生长。
一般大肠杆菌接种量遵循逐级增大的原则，并将最后一级的放大倍数控制在10倍左右。
种子培养一定要在最佳条件下进行，培养时间不宜过长，当种子生长至最佳状态时果断移种。
如果种子做的不好，其负面影响往往在发酵中后期会有所体现。
工程菌种培养会加入抗生素，不仅是为了抑制杂菌生长，更重要的是为了给菌种形成正向的抗性筛选压力，及时淘汰质粒丢失的菌株或者衰老的菌体，保证质粒携带菌群的正常生长与表达。
2高密度发酵培养基除了必须的碳源以外，有机复合氮源在蛋白表达阶段不可或缺。
有机复合氮源可提供丰富的氨基酸、小肽、嘌呤、嘧啶、维生素、生物素以及一些生物活性物质，能减轻细胞代谢负担，促进外源蛋白表达。
如果酵母膏和蛋白胨是以流加的方式添加时，存在一种非常有趣的代谢机制：当流加培养基中只有酵母膏时，重组蛋白不稳定；而当流加培养基中只有蛋白胨时，大肠杆菌难以再利用其所产生的乙酸。
大肠杆菌高密度经验总结
大肠杆菌发酵经验总结首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。
其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。
第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。
第四，补料过程中的碳氮比也很重要。
若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。
另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。
根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。
可以适当调整碳氮比。
大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，针对我们论坛所发的帖，我先总结以下几点，并作出相应解决措施。
一、代谢副产物-乙酸乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。
当乙酸浓度大于10或20g/L 时，细胞将会停止生长，当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。
生物工程导论知识要点
生物工程导论知识要点一、概论1.生物工程的概念：利用工程学的方法，将生命科学和技术的研究成果应用于生产实践或达到其他社会目标二、基因工程2.现代生物技术的核心：基因工程3.基因工程的定义：基因工程就是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞（也称宿主细胞或寄主细胞）内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。
基因工程的核心内容是在分子水平上对生物的遗传特性进行有目的的改造。
4.基因工程的基本步骤包括：1.带有目的基因的DNA片段的获取2.目的基因与载体的体外重组3.重组DNA分子导入受体细胞4.含重组体的细胞群体的繁殖扩增5.重组体的筛选6.目的基因的表达5.基因工程的实施的四个基本要素（1）基因（2）载体（3）工具酶（4）受体细胞6.基因工程的类似名称：遗传工程、基因工程、基因操作、重组DNA技术、分子克隆、基因克隆7.工具酶：限制性核酸内切酶、DNA连接酶、DNA聚合酶以及DNA和RNA的一些修饰酶8.II类限制性内切酶的特点1）识别特定的核苷酸序列，其长度一般为4-8个核苷酸，且具回文序列（双轴对称性）2）具有特定的酶切位点，产生特定的酶切末端（专一性）3）没有甲基化修饰酶功能，不需要ATP和SAM作为辅助因子，一般只需要Mg2+9.DNA连接酶：用于将两段乃至数段DNA片段拼接起来的酶。
基因工程中最常用的连接酶是T4DNA连接酶。
它催化DNA 5’磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二酯键。
除T4DNA连接酶外，还有大肠杆菌的DNA连接酶，其催化反应基本与T4DNA连接酶相同，只是催化反应需要辅助因子NAD+参与。
10.基因工程载体：用于携带目标基因并使其能在特定细胞中稳定复制的DNA分子11.载体种类：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体按功能：克隆载体、表达载体、穿梭载体12.质粒：是能自主复制的双链环状DNA分子，它们在细菌中以独立于染色体之外的方式存在。
（一个质粒就是一个DNA分子，1~200kb）可分为天然质粒和经过人工修饰的质粒载体。
流加发酵与高密度培养
假定为常数，则上式积分可得： XV X F VF e (t t F )
由于生长符合Monod方程
d ( XV ) XV dt
m S
Ks S
dS 0 dt
V
dS dV S F S0 ( m) V X dt dt Yx / c
采用恒流速流加培养时，可得到如下 的物料平衡方程式：
d (VX )
a.恒速流加 (包括单一速率和分阶段恒速流加)
b.指数速率流加
c.底物在线测定后的反馈流加
(如葡萄糖反馈流加)
细胞平衡：dt 碳平衡：
Vrx
d (VS ) Vrs FS 0 dt
d. pH-stat
e. DO-stat
dVP 产物平衡： Vrp dt dV 体积平衡： F dt
3. 流加发酵过程中某些重要参数的确定
a. 最佳底物浓度的确定
(包括菌体生长阶段和产物合成阶段)
b. 底物的消耗速率
c. 体比生长速率()
d. 菌体对底物的产率系数(Yx/s)
及产物对底物的产率系数 (Yp/s)
2
2014/1/8
4. 合适的流加发酵类型的确定
5. 流加方式的应用 (1) 恒速流加
流加发酵最优化研究的核心问题是找出 最佳的底物流加方式，以维持发酵过程 始终处于最佳状态 流加发酵最优化的研究内容包括： （1）状态方程的建立 （2）目标泛函的确定 （3）最优化底物流加方式的求解
流加发酵的物料衡算式可以表达为：
d ( XV ) XV dt d ( SV ) XV S F F dt
恒流速流加过程中的流量 F的确定：
(a)预试验中所得出的流加时刻菌体对
流加发酵与高密度培养
m) V X
对菌体量的变化进行物料衡算，则：
d(XV) XV
dt
假定为常数，则上式积分可得：
XV X F VF e (ttF )
由于生长符合Monod方程
m S
Ks S μ 是S的函数，要使μ 恒定，S必须 恒定，则有：
dS 0 dt
1.非生产时间长 2.需较多的操作人员或计算机控制系统 3.操作人员接触一些病原菌和有毒产品的可 能性大
流加发酵的研究进展
在20世纪70年代以前流加发酵的理论研 究几乎是个空白，流加过程控制仅仅以 经验为主，流加方式也仅仅局限于间歇 或恒速流加
1973年日本学者Yoshida等人首次提出了 “Fed-Batch Fermentation”这个术语， 并从理论上建立了第一个数学模型，流 加发酵的研究才开始进入理论研究阶段
DCW（g/l）
233 190 180 148 145 184 184 157 141 100
132 114
268 208 235 100
概述
概述
随着重组DNA技术的发展，利用大肠杆菌或其它微生物 为宿主表达重组蛋白（如干扰素、白介素等）在分子和 策略上已没有问题。但为了提高过程的经济性必需开发 高效的培养和发酵技术。
迅速生长，而目的代谢产物的产量会减少。而当营养物严重缺乏 时，菌体生长受抑制，代谢产物的产量也会减小 )
• 营养缺陷型菌株的培养
二、如何进行流加发酵操作？ 1. 流加发酵类型 2. 采用流加发酵应该解决的关键问题？ 3.流加发酵过程中某些重要参数的确定 4.合适的流加发酵类型的确定 5. 流加方式的应用
4.产品质量稳定 5.操作人员接触毒害物质的可能性 小 6.测量仪器使用寿命长 1.操作灵活 2.染菌、退化的几率小 3.可获得高的转化率
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流加发酵
所 谓 流 加 发 酵 ， 即 补 料 分 批 发 酵 (Fedbatch fermentation)，有时又称半连续培 养或半连续发酵，是指在分批发酵过程 中间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵 方法
分批、连续、流加操作方式的比较
分批发酵 连续发酵
流加发酵
优点 1.一般投资较小 2.易转产、生产灵活 3.分批操作中某一阶段可获得高的 转化率 4.发酵周期短，菌种退化率小 1.可实现有规律的机械、自动化 2.操作人员少 3.反应器体积小、非生产时间少
Yx / c
m) V X
对菌体量的变化进行物料衡算，则：
d(XV) XV
dt
假定为常数，则上式积分可得：
XV X F VF e (ttF )
由于生长符合Monod方程
m S
Ks S μ 是S的函数，要使μ 恒定，S必须 恒定，则有：
dS 0 dt
1. 流加发酵类型
流加发酵的分类
类别
流加方式
无反馈控 制
反馈控制
恒流量流加、变流量流加和间歇流加
直接控制流加、间接控制流加 定值控制流加、程序控制流加、最优控制流 加
2. 采用流加发酵应该解决的关键问题
(1) 流加什么物质？
①补充微生物能源和碳源，如在发酵液中添加 葡萄糖、 饴糖、液化淀粉。作为消泡剂的天然油 脂，有时也能同时起到补充碳源的作用
在菌体生长阶段采用指数速率流加法的
几点假设如下： (a) 发酵罐内为理想混合； (b) 葡萄糖为唯一限制性碳源； (c) 残留菌体对葡萄糖的产率系数(YX/s)为常 数； (d) 菌体生长遵循Monod方程。
对底物葡萄糖进行衡算，则：
d(VS ) dt
FS0
(
Yx / s
ms ) VX
在采用流加发酵技术之前要考虑的两个 问题
一、何时采用流加发酵方式？
二、如何进行底物的流加？
一、何时采用流加发酵方式？
• 所用底物在高浓度时对菌体生长有抑制 作用
• 高菌体浓度培养即高密度培养系统
• 非生长耦联性次级代谢产物(如产物的合 成需要某些营养物质或前体)
• 利用营养突变体的系统(过量加入营养物只能使菌体
d (VX
细胞平衡： dt
)
Vrx
碳平衡：
d (VS) dt
VrsΒιβλιοθήκη FS0产物平衡：dVP
dt
Vrp
体积平衡：dV F dt
恒流速流加过程中的流量F的确定： (a)预试验中所得出的流加时刻菌体对
所流加基质的消耗速率 (b)发酵液中残留基质浓度 (c)流加后需要控制的发酵液中的基质
浓度
(2) 指数速率流加
②补充菌体所需要的氮源，有机氮或氨水
③加入某些微生物生长或合成需要的微量 元素或无机盐
④加入酶合成诱导物或前体物质
(2) 如何流加？ a.底物流加速率 b.流加开始时间及总流加时间 c.需控制的底物浓度
3. 流加发酵过程中某些重要参数的确定 a. 最佳底物浓度的确定
(包括菌体生长阶段和产物合成阶段) b. 底物的消耗速率 c. 菌体比生长速率() d. 菌体对底物的产率系数(Yx/s)
流加发酵最优化的研究内容包括：
（1）状态方程的建立 （2）目标泛函的确定 （3）最优化底物流加方式的求解
流加发酵的物料衡算式可以表达为：
d ( XV ) XV
dt
d (SV dt
)
XV
SF
F
d (PV ) XV
dt
dV F dt
流加发酵的最优化理论有：格林原理、庞特里金最小值 (最大值)原理等
及产物对底物的产率系数(Yp/s)
4. 合适的流加发酵类型的确定 a.恒速流加(包括单一速率和分阶段恒速流加) b.指数速率流加 c.底物在线测定后的反馈流加
(如葡萄糖反馈流加) d. pH-stat e. DO-stat
5. 流加方式的应用 (1) 恒速流加
采用恒流速流加培养时，可得到如下 的物料平衡方程式：
1.非生产时间长 2.需较多的操作人员或计算机控制系统 3.操作人员接触一些病原菌和有毒产品的可 能性大
流加发酵的研究进展
在20世纪70年代以前流加发酵的理论研 究几乎是个空白，流加过程控制仅仅以 经验为主，流加方式也仅仅局限于间歇 或恒速流加
1973年日本学者Yoshida等人首次提出了 “Fed-Batch Fermentation”这个术语， 并从理论上建立了第一个数学模型，流 加发酵的研究才开始进入理论研究阶段
流加发酵所取得的三个方面的重大进展
20世纪70年代中后期对流加发酵过程的 动力学解析
结合发酵过程的可测参数对流加过程进 行反馈控制（如DO法、CO2法、RQ(呼吸 商)法、pH法、代谢物法、萤光法等）
流加发酵的最优化研究
流加发酵最优化研究的核心问题是找出 最佳的底物流加方式，以维持发酵过程 始终处于最佳状态
4.产品质量稳定 5.操作人员接触毒害物质的可能性 小 6.测量仪器使用寿命长 1.操作灵活 2.染菌、退化的几率小 3.可获得高的转化率
4.对发酵过程可实现优化控制 5.因经常灭菌会降低仪器使用寿命
缺点 1.因放罐、灭菌等原因，非生产时间长 2.经常灭菌会降低仪器寿命 3.前培养和种子的花费大
4.需较多的操作人员或较多的自动控制系统 1.操作不灵活 2.因操作条件不易改变，原料质量必须稳定 3.若采用连续灭菌，加上控制系统和自动化 设备，投资较大 4.必须不断地排除一些非溶性的固型物 5.易染菌，菌种易退化
F为体积流加速率(L/h)，S0为流加液中基质浓 度(g/L)，Yx/s为菌体对底物的产率系数(g/g)， ms 为细 胞比维 持系数 (g/g/h) ， X为菌体 浓度 (g/L)，V为培养液体积(L)，μ为菌体比生长速 率(h-1)。
V
dS dt
S dV dt
F S0
(
迅速生长，而目的代谢产物的产量会减少。而当营养物严重缺乏 时，菌体生长受抑制，代谢产物的产量也会减小 )
• 营养缺陷型菌株的培养
二、如何进行流加发酵操作？ 1. 流加发酵类型 2. 采用流加发酵应该解决的关键问题？ 3.流加发酵过程中某些重要参数的确定 4.合适的流加发酵类型的确定 5. 流加方式的应用