环境微生物学实验报告实验一到三

实验一

显微镜油镜的使用和细菌形态的观察

一、实验目的

1、了解显微镜的基本构造和使用方法

2、掌握油镜的原理和使用方法

3、了解细菌的三种基本形态

二、显微镜的基本构造

三、油镜使用的原理

油镜，即油浸物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（其折射率与玻片的相近），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量和显微镜的分辨率从而使物象更加清晰。

四、实验器材

1、细菌三态装片

2、显微镜

3、香柏油

4、擦镜纸等

五、操作步骤

1. 放置好显微镜

2. 调节光源

3. 低倍镜观察

4. 高倍镜观察

5. 油镜观察

6. 清洁和还原显微镜

显微镜观察细菌涂片（细菌三型涂片、枯草杆菌涂片）使用油镜：

低倍镜（10×）高倍镜（40×）油镜（100×）

1. 放置好显微镜

置显微镜于平稳的实验台上。镜检者姿势要端正。

（不论使用单筒显微镜或双筒显微镜均应双眼同时睁开观察，以减少眼睛疲劳，也便于边观察边绘图或记录

2. 调节好光源

接通电源，打开光源。

3. 低倍镜的观察

观察任何标本都必须先用低倍镜观察，因为低倍镜视野范围大，容易发现观察目标，确定观察部位。

将标本片放在载物台上，用标本夹夹住，调节标本移动螺旋，使观察的目的物处于物镜的正下方。

调节粗调螺旋，使物镜（10×）与标本靠近，眼睛在测向注视物镜，防止物镜和载玻片相碰。

张开双眼向目镜里观察，如果见到目的物，但不十分清楚，可用细准焦螺旋调节，至目的物清晰为止。

通过玻片夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部分，找到合适的目的物，仔细观察并记录所观察到的结果。

4.高倍镜的观察

（1）用低倍镜找到标本并调节清晰后，将欲放大的观察部位用推进器调到视野中央。

（2）.旋动转换器换高倍镜。如果高倍镜下观察目的物有点模糊，调节细准焦螺旋，直到视野清晰。调节细准焦螺旋时要注意旋转方向与载物台上升或下降的关系，防止镜头与载玻片强力接触，损坏镜头或载玻片。

5.油镜的观察

（1）如果用高倍镜目的物未能看清，可用油镜。先用低倍镜和高倍镜检查标本片，将目的物移到视野正中。

下降载物台，在载玻片上滴一滴香柏油，将油镜移至正中，缓慢调节粗调螺（2）旋使油镜头浸没在油中，刚好贴近载玻片。然后再用细准焦螺旋微微向上调（切忌用粗准焦螺旋）即可。

（应特别注意不要在升降载物台时用力过猛，或者调焦时误将粗调节螺旋向反方向转动而损坏镜头及载玻片）

6. 清洁显微镜和还原显微镜

. 观察结束后，调节光源到最小再关掉电源开关。调节粗调螺旋，使载物台下降到最低，取下玻片。

. 把油镜转离光轴，擦镜纸擦1～2次，去油，用二甲苯滴湿的擦镜纸擦2次，

再用擦镜纸擦1～2次，顺镜头直径方向擦，不要圆周擦和来回擦。擦干净镜体，罩上防尘罩，然后放回原处。

. 用擦油镜头的方法擦玻片。

六、显微结构图的绘制

⏹严格按光学显微镜的操作方法，依低倍、高倍及油镜的次序观察细菌装片，

并绘出其形态图。

⏹生物绘图中绘出的图要清楚，并正确的表示出形态构造的特点，绘图注意

事项如下：

(1) 绘图要用黑色硬铅笔，不要用软铅笔或有色铅笔，一般用2H 铅笔为宜。

(2) 图的大小及在纸上分布的位置要适当。

(3) 画图时先用轻淡小点或轻线条画出轮廓，再依照轮廓一笔画出与物象相符

的线条。线条要清晰，比例要准确。

(4) 绘出的图要正确，观察时要把混杂物、破损、重叠等现象区别清楚，不要

把这些现象绘上。

(5) 图的明暗及浓淡，应用细点表示，不要采用涂抹方法。点细点时，要点成

圆点，不要点成小撇。

(6) 整个图要美观、整洁，还要特别注意准确性。

七、思考题

1、使用油镜时，为什么要先用低倍镜观察？

2、油镜使用原理是什么？

3、绘出细菌三型图。

实验二细菌的简单染色

虽然各种类型的显微镜能够观察到微生物的各种形态结构，但一般实验室常用的是普通光学显微镜。由于细菌体积小且透明，在活体细胞内又含有大量的水分，因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与周围背景没有显著的明暗差，难于看清它们的形状，更谈不上识别其细微结构。而经过染色，就可借助颜色的反衬作用比较清楚地看到菌体形态，亦即菌体表面及内部结构着色与背景形成鲜明对比，这样便可在普通光学显微镜下清晰地观察到微生物的形状和结构，因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。

本实验通过对细菌的染色观察，使同学们在掌握细菌染色技术的基础上，了解各种其他的染色制片技术；观察微生物的各种形态结构，以巩固课堂知识，增强感性认识。

一、目的要求

1．学习微生物涂片、染色的基本技术，掌握细菌的单染色方法及无菌操作技术。

2．巩固显微镜的使用方法。

二、基本原理

1.简单染色法：所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。

在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电

荷的细菌结合而使细菌着色。例如，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐，它可被电离成正、负离子：

带正电荷的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫（crystal violet）、碱性复红（basicfu-chsin）、番红（又称沙黄，safranine）等。

细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。

三、器材

1、活材料：培养24小时的大肠杆菌、葡萄球菌。

2、染色液和试剂：草酸铵结晶紫、番红、蒸馏水、无菌水、二甲苯、香柏油等。

3、器材：废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。

四、操作步骤

（1）涂片：取干净载玻片一块，左手持菌液试管，右手持接种环在火焰上灼烧灭菌，待接种环冷却后在火焰旁从试管中取一环菌液，在洁净无脂的载玻片上涂直径约

0.5-1cm的均匀薄膜。如果从斜面或平板上取菌，用无菌环挑取少量菌体，涂在预先

滴有一小滴无菌水的载玻片上，使其薄而均匀。

（2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。

（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜），使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁坏。

（4）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加一滴草酸铵结晶紫染色1-2min （5）水洗：用洗瓶或滴管缓慢冲洗涂片上的染色液，直至冲下之水无色时为止。

（6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。

（7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。

（8）改用番红染色，重复以上过程。

实验完毕后的处理：

①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，

a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。

b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2-3次。

c.再用干净的擦镜纸将镜头擦2-3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。②观察后的

染色玻片用废纸将香柏油擦干净，放入回收容器内。

五、注意事项

（1）要有对数生长期的菌种

菌龄过小或过大均影响细菌的正常形态，菌龄太小还没有分化完整，而菌龄过大，往往会发生自溶。

（2）涂片不宜过厚，以免造成菌体重叠，不利于观察形态。

（3）火焰固定不宜过热，否则会使细菌变形。

六、实验报告

1．结果

绘出葡萄球菌和大肠杆菌的形态图。

2．思考题

简单染色应注意哪些，为什么？