实验6 乳酸脱氢酶的活性测定

利用上述原理，改变不同基质液可测定相应脱氢酶反应过程中 A340nm的改变，定量测定酶活力，如苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛 脱氢酶、甘油－3－3磷酸脱氢酶等，适用范围很广。
实验步骤
1）制备肌肉匀浆 称取1g 鸡肌肉, 剪碎，置10ml离心管中，编号；加入 4℃预冷的0.01 mol/L pH6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾 缓冲液4ml；匀浆，每次10s，连续3次。放置10min， 3000r/min，离心5min。
实验步骤
2）LDH活力测定 取1只比色杯中加入0.1m mol/L pH 7.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓 冲液3ml，置于紫外分光光度计中，在340nm处将光吸收调节至零。
取1只比色杯，依次加入丙酮酸钠溶液2.9ml, NADH溶液0.1ml，加 盖摇匀后。加入经稀释的酶液10μl，加盖摇匀后，在A340nm，连续 测定3min，以 A对时间作图，取反应最初线性部分，计算 A340nm/min减少值。 注意：加入酶液的稀释度（或加入量）应控制 A340nm/min下降值 在0.1－0.2之间。
LDH可溶于水或稀盐溶液。组织中LDH含量测定方法很多，其中紫外 分光光度法更为简单、快速。鉴于NADH, NAD+ 在340nm及260nm 处有各自的最大吸收峰，因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通 过340nm光吸收值得改变，定量测定酶的含量。本实验测定LDH活 力，基质液中含丙酮酸及NADH，在一定条件下，加入一定量酶液， 观察NADH在反应过程中340 nm 处光吸收减少值，减少越多，则 LDH活力越高。其活力单位定义是：在25℃，pH7.5条件下 A340nm/min下降为1.0的酶量为1个单位。可定量测定每克湿重组 织中LDH单位。定量测定蛋白质含量即可计算比活力（U/mg）。
实验6乳酸脱氢酶的活性测定
1、任务背景 乳酸脱氢酶（LDH）是催化乳酸和丙酮相互转化的同工酶，属 于氢转移酶。该酶存在于所有动物的组织中，在肝脏中活性最 高，其次为心脏、骨骼肌、肾脏，在肿瘤组织及白血病细胞中 也能检测到。在大多数动物组织中，它是由两种肽链按一定比 例组成的5种四聚体。它的每条肽链各由一个基因编码，经转 录、翻译、修饰加工等过程，最后成为有生物学活性的物质。 不同的动物，不同的组织或器官在不同的发育阶段或不同的生 活周期均有其特异性的同工酶酶谱。 2、任务目标 ①掌握LDH活性测定原理； ②学习用比色法测定酶活性的方法。 3、工作原理 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase简称LDH， EC.1.1.1.27, L－乳酸：NAD+氧化还原酶）广泛存在于生物细 胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化下列可逆反应。
实验步骤
3）数据处理 计算每毫升组织提取液中LDH活力单位： LDH活力（U）/mL =
提取液中wk.baidu.comDH总活力单位＝LDH活力（U）/ml 总体 积