实验6 乳酸脱氢酶的活性测定
乳酸脱氢酶测乳酸的方法
乳酸脱氢酶（Lactate Dehydrogenase，简称LDH）是一种酶，它在乳酸的代谢中起着关键作用。
测量乳酸浓度和LDH活性对于监测细胞代谢和疾病诊断非常重要。
以下是一种常见的用于测定乳酸浓度的方法：
### 酶联免疫吸附法（Enzymatic Assay）
这是一种基于酶催化反应的常规测定方法，包括以下步骤：
1. **样品准备：** 采集血液、细胞培养液或其他液体样品。
必要时，对样品进行适当的处理，以提取乳酸。
2. **试剂准备：** 准备LDH酶联试剂盒，其中包括LDH酶、辅酶、底物和其他必要的试剂。
3. **混合：** 将样品和试剂混合，使LDH与样品中的乳酸反应。
4. **酶催化反应：** LDH催化乳酸与辅酶之间的反应，产生氧化的底物。
5. **测量吸光度：** 使用分光光度计或酶标仪器测量在特定波长下产生的吸光度变化。
吸光度的变化与乳酸浓度成正比。
6. **计算浓度：** 使用标准曲线或浓度计算公式，将吸光度转化为乳酸的浓度。
请注意，具体的操作步骤和使用的试剂可能因不同厂家的试剂盒而异，因此在进行实验时应遵循所选试剂盒的操作手册和说明。
此外，还有其他方法可用于测量乳酸浓度，例如电化学法和核磁共振（NMR）法。
选择适当的方法取决于实验的具体需求和设备的可用性。
脱氢酶测定实验报告
1. 了解脱氢酶的特性和作用机制。
2. 掌握脱氢酶测定实验的方法和原理。
3. 学会使用分光光度计进行脱氢酶活性的测定。
二、实验原理脱氢酶是一类催化氧化还原反应的酶，可以将底物中的氢原子转移给辅酶，从而实现底物的氧化。
本实验以乳酸脱氢酶（LDH）为例，通过测定其在特定条件下催化乳酸氧化为丙酮酸的反应速率，来间接反映LDH的活性。
三、实验材料1. 乳酸脱氢酶（LDH）提取液2. 乳酸（底物）3. 丙酮酸（产物）4. 磷酸缓冲液5. 分光光度计6. 移液器7. 试管8. 秒表四、实验方法1. 准备工作：将LDH提取液、乳酸、丙酮酸、磷酸缓冲液等实验材料分别置于相应的试管中，调节pH至7.4。
2. 设置对照组：取一定量的磷酸缓冲液，加入LDH提取液，作为对照组。
3. 设置实验组：取一定量的乳酸，加入LDH提取液，作为实验组。
4. 测定吸光度：将对照组和实验组的试管放入分光光度计中，在特定波长下测定吸光度。
5. 计算反应速率：根据吸光度变化，计算LDH的活性。
1. 准备工作：将LDH提取液、乳酸、丙酮酸、磷酸缓冲液等实验材料分别置于相应的试管中，调节pH至7.4。
2. 设置对照组：取1ml磷酸缓冲液，加入1ml LDH提取液，混匀后放入分光光度计中，在波长340nm处测定吸光度，记录为A0。
3. 设置实验组：取1ml乳酸，加入1ml LDH提取液，混匀后放入分光光度计中，在波长340nm处测定吸光度，记录为A1。
4. 加入丙酮酸：向实验组中加入1ml丙酮酸，混匀后立即放入分光光度计中，在波长340nm处测定吸光度，记录为A2。
5. 计算反应速率：计算A1与A0的差值（ΔA），ΔA表示在反应过程中吸光度的变化。
根据反应速率公式：反应速率= ΔA / Δt其中，Δt为反应时间，本实验中Δt为1分钟。
六、实验结果与分析1. 通过实验，成功测定了LDH的活性，得到实验数据如下：A0 = 0.3A1 = 0.6A2 = 0.92. 计算反应速率：ΔA = A1 - A0 = 0.6 - 0.3 = 0.3Δt = 1分钟反应速率= ΔA / Δt = 0.3 / 1 = 0.33. 结果分析：根据实验结果，LDH在1分钟内催化乳酸氧化为丙酮酸的反应速率为0.3。
乳酸脱氢酶测定—速率法(精)
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U/L
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30s
45s
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50 900
80 + 2 0. 0 2
参考范围:104-205U/L 式中6 220为波长340nm处NADH的摩尔 吸光度。
方法评价
1.L-P反应速率法是根据正向反应而建立，其优点在
于：乳酸盐和底物溶液的稳定性较好，－20℃保存 可稳定6个月以上。且两溶液的浓度对测定方法的 影响最小。 2.线性范围较宽 本法在LDH活性为726U/L以内时 线性良好。超过此值最好将标本稀释后再测。 3.精密度好 LDH活性为65U/L时，日间CV为5.8%； LDH活性为149U/L时，日间CV为3.2%。 4.特异性高 由于血清中非LDH的NAD＋类氧化还原 酶的内源性底物很少，加上样本的高度稀释，因此， 这些酶的干扰作用可忽略不计。
LDH pH 8.8 L 乳酸 NAD 丙酮酸 NADH H
实验操作
样本要求:当日空腹采集的无溶血、无乳糜的
血清 试剂配制：取R15ml加R21ml混合即为工作试 剂 半自动生化分析仪测定参数
半自动生化分析仪测定参数
分 析 方 法 速 率 法 速 率 法 波长 温 度 试 剂 空 白 延 迟 时 间 30s 测 量 时 间 45s 因数 样 品 量 uL 试 剂 量 uL 吸 入 量 uL 500 单 位 反 应 方 向 正
乳酸脱氢酶测定—速率法
xiaobinxuer@
实验目的
熟悉血清乳酸脱氢酶测定（速率法）的原理，
测定参数的设置及酶活性单位的计算
实验原理
乳酸脱氢酶催化乳酸氧化生成丙酮酸，同时
乳酸脱氢酶同工酶的提取及活力测定
乳酸脱氢酶同工酶的提取及活力测定
姜玉梅;杨歌德;范业鹏;李冀宏;王爱民
【期刊名称】《哈尔滨医科大学学报》
【年(卷),期】1999(33)1
【摘要】以兔肌为实验材料，常规处理组织匀浆，差速离心，取微量上清液经稀释后为酶样品。
以丙酮酸、还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸（ＮＡＤＨ）为底物，测定ＮＡＤＨ在３４０ｎｍ处的吸光度改变以判定乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）的活力。
结果表明，所提取的ＬＤＨ具有明显活力。
【总页数】2页(P71-72)
【关键词】乳酸脱氢酶;LDH;同工酶;活力
【作者】姜玉梅;杨歌德;范业鹏;李冀宏;王爱民
【作者单位】
【正文语种】中文
【中图分类】Q554.9
【相关文献】
1.不同季节高原鼢鼠乳酸脱氢酶活力和同工酶谱 [J], 魏登邦;于红妍;张建梅;王晓君;魏连
2.高原鼢鼠血清乳酸脱氢酶活力及同工酶谱的季节性变化 [J], 李永秀;魏登邦
3.人体精液中乳酸脱氢酶同工酶的相对活力测定及其应用 [J], 谭委民
4.高原鼢鼠、鼠兔及大鼠心肌和骨骼肌乳酸脱氢酶活力及同工酶谱 [J], 魏莲;魏登
邦;王晓君;蔡琦
5.23例急性心肌梗死患者血中乳酸脱氢酶同工酶1活力测定 [J], 费正; 吕红因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
生活养生-乳酸脱氢酶测定
文章导读我们知道，现实生活中存在着各种各样的的酶，这些酶可以单独作用，也可以相互作用，对我们的人体产生很大的影响，但是相信大家对于酶的测定方法还不是很熟悉吧，不同酶的测定有不同的方式方法，而且方式方法也种类不一，现如今乳酸脱氢酶测定方法成为很多人研究的领域话题，那么到底该如何测定呢，下面就让我们一起来了解一下乳酸脱氢酶测定方法吧。
方法：实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。
每次检测都应该做标准曲线。
如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。
1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。
空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。
为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。
每孔加生物素标记抗体工作液 100μl（取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃，60分钟。
3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。
4. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液） 100μl，37℃，60分钟。
5. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。
7. 依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。
为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。
血清乳酸脱氢酶LDH测定
血清乳酸脱氢酶LDH测定1 检验目的指导本室工作人员规范操作本检测项目，确保检测结果的准确。
2 实验原理LDH催化乳酸氧化为丙酮酸，同时将NAD+还原为NADH，LDHNADH的生成速率与标本中乳酸脱氢酶的活力成正比。
L-乳酸 + NAD+丙酮酸 + NADH + H+3 标本：3.1 病人准备：无特殊。
3.2 类型：血清或EDTA血浆。
3.3 标本存放：3天内的活性损失：2～8℃保存：<8%；15～25℃保存：<2%。
3.4 标本运输：常温条件下保存运输。
3.5 标本拒收标准：标本溶血、细菌污染的标本。
4 实验材料4.1 试剂：上海复星长征医学科学有限公司LDH试剂盒（沪食药监械（准）字2014第2400166号 YZB/沪 1546-40-2014）4.1.1 试剂组成氯化钾 190mmol/L 试剂1（R1）乳酸62.5mmol/LTris缓冲液 100mmol/L试剂2（R2）NAD+ 30mmol/L Tris缓冲液 100mmol/L 4.1.2试剂准备试剂为即用式。
4.1.3 试剂稳定性与贮存：2～8℃避光、密封的储存条件下，试剂（盒）自生产之日起有效期为12个月。
试剂1 与试剂2 启用后，在2～10℃避光的条件下可稳定14天。
4.1.4 变质指示当试剂有看得见的微生物生长，有浊度，或者未开盖的液体有沉淀时，表明试剂已变质，不能继续使用。
4.1.5 注意事项试剂中含叠氮钠为防腐剂。
不可入口！避免接触皮肤及粘膜。
应采取必要的预防措施使用试剂。
4.2 校准品：使用上海复星长征医学科学有限公司提供的LDH校准品对自动分析仪进行校准。
4.3 质控品：使用正常值、病理值复合控制品。
5 仪器AU2700生化分析仪，罗氏P800生化分析仪, 西门子ADVIA-2400生化分析仪，东芝TBA-120生化分析仪6 操作步骤6.1 样品的准备：将标好号的样品离心后放到仪器规定的位置。
6.2 试剂的检测：仪器开机后，检查各种试剂的位置，体积等确认无误后方可进行测定。
乳酸脱氢酶测定—速率法(精)
乳酸脱氢酶测定—速率法
xiaobinxuer@
实验目的
熟悉血清乳酸脱氢酶测定（速率法）的原理，
测定参数的设置及酶活性单位的计算
实验原理
乳酸脱氢酶催化乳酸氧化生成丙酮酸，同时
使NAD＋还原为NADH，引起340nm处吸光 度的增加，吸光度的增加速率与样品中LDH 活性成正比。
LDH pH 8.8 L 乳酸 NAD 丙酮酸 NADH H
实验操作
样本要求:当日空腹采集的无溶血、无乳糜的
血清 试剂配制：取R15ml加R21ml混合即为工作试 剂 半自动生化分析仪测定参数
半自动生化分析仪测定参数
分 析 方 法 速 率 法 速 率 法 波长 温 度 试 剂 空 白 延 迟 时 间 30s 测 量 时 间 45s 因数 样 品 量 uL 试 剂 量 uL 吸 入 量 uL 500 单 位 反 应 方 向 正
430
37 要
4920
20 600
U/L
430
37
800
U/L
正
计算
0 0. 6. 0 + 2 0. 0 2
参考范围:104-205U/L 式中6 220为波长340nm处NADH的摩尔 吸光度。
方法评价
1.L-P反应速率法是根据正向反应而建立，其优点在
于：乳酸盐和底物溶液的稳定性较好，－20℃保存 可稳定6个月以上。且两溶液的浓度对测定方法的 影响最小。 2.线性范围较宽 本法在LDH活性为726U/L以内时 线性良好。超过此值最好将标本稀释后再测。 3.精密度好 LDH活性为65U/L时，日间CV为5.8%； LDH活性为149U/L时，日间CV为3.2%。 4.特异性高 由于血清中非LDH的NAD＋类氧化还原 酶的内源性底物很少，加上样本的高度稀释，因此， 这些酶的干扰作用可忽略不计。
乳酸脱氢酶(LDH)测定操作规程(SOP)
乳酸脱氢酶(LDH)测定操作规程（SOP）一、用途本产品用于体外定量测定血清、血浆样品中乳酸脱氢酶（LDH）的活性。
二、临床意义（一）概述乳酸脱氢酶（LDH），又称L－乳酸－NAD+氧化还原酶，酶编号为EC 1.1.1.27，分子量约为34000道尔顿。
LDH是一种细胞质酶，存在于所有组织细胞中。
由于组织中的LDH 浓度比血浆高约500倍，即使组织的轻微损伤也将导致血清中活性的明显增高，在肝、心肌、骨骼肌和肾中发现高度组织特异性活性的酶。
（二）临床意义乳酸脱氢酶增高主要见于心肌梗死、肝炎、肺梗死、某些恶性肿瘤、白血病等。
某些肿瘤转移所致的胸腹水中乳酸脱氢酶活力往往升高。
目前，常用于心肌梗死、肝病和某些恶性肿瘤的辅助诊断。
（三）医学决定水平170U／L:此值在参考范围以内，等于或低于此值可排除许多与LDH升高有关的疾病，而考虑其他的诊断。
此值还可作为病人自身的对照，用来与以前或将来的测定值作比较。
300U／L：高于此水平时，应考虑到可能引起LDH升高的各种疾病，如心肌梗塞、肝病变、传染性单核细胞增多症、进行性肌营养不良等。
因此，应作其他各种试验，以作出明确诊断。
血清溶血可使测定值增高，应予以注意。
500U／L：高于此值，常见于巨幼细胞性溶血，急性白血病、慢性粒细胞性白血病、转移癌和肝昏迷等，此时应作其他多种检测来作出正确诊断。
三、检验原理L-乳酸＋NAD+−−LDH丙酮酸＋NADH＋H+−→NADH的生成速率与样品中LDH活性成正比，在340nm波长处，通过连续监测吸光度的上升速率(△A／min)，即可计算出样品中LDH的活性。
四、样品血液样品原则上采集晨起空腹血（禁食12小时）；患者处于平静、休息状态，减少患者由于运动、饮食带来的影响；静脉采血时患者应取坐位或卧位；止血带使用后1分钟内采血，回血后立即松开；正确使用抗凝剂；防止溶血；防止过失性采样。
样品运送过程中应防止过度振荡、防止样品容器的破损、防止样品被污染、防止样品及唯一性标志的丢失和混淆，防止样品对环境的污染、水分蒸发。
LDH的测定
2，酶活性的测定
加入物(ml) 加入物(ml) 测定管 对照管 血清 0.01 0.01 NAD＋ NAD＋底物缓冲液 0.5 0.5 37度水浴 37度水浴5min 度水浴5min NAD＋ NAD＋溶液 0.1 － 37度水浴 度水浴15min 37度水浴15min 2,4二硝基苯肼 2,4二硝基苯肼 0.5 0.5 NAD＋ NAD＋溶液 － 0.1 37度水浴15分钟 37度水浴15分钟 度水浴15 0.4mol/L溶液 0.4mol/L溶液 5.0 5.0 混匀，室温放置5min 5min后 440nm波长处比色 比色杯光径为1.0cm 波长处比色， 1.0cm， 混匀，室温放置5min后，于440nm波长处比色，比色杯光径为1.0cm， 用蒸馏水调零，读取各管吸光度。 用蒸馏水调零，读取各管吸光度。以测定管与对照管吸光度之差值查 校正曲线，得酶活性。 校正曲线，得酶活性。 单位定义： 100ml血清 37度 作用底物15min 产生1umol 血清， 15min， 1umol丙酮酸为 单位定义：以100ml血清，37度，作用底物15min，产生1umol丙酮酸为 一个金氏单位。 一个金氏单位。
乳酸＋NAD＋――丙酮酸＋NADH＋ ＋（正向L 乳酸＋NAD＋――丙酮酸＋NADH＋H＋（正向L-P，逆 向P－L）。 比色法原理：正向反应生成的丙酮酸与溶于酸的2 比色法原理：正向反应生成的丙酮酸与溶于酸的2，4二硝 基苯肼作用生成丙酮酸－二硝基苯腙，后者在酸性环境中 呈草黄色，在碱性溶液中显棕红色，颜色的深浅与丙酮酸 的浓度成正比，与标准浓度的丙酮酸生成的苯腙进行比色， 可推算LDH的活力。 可推算LDH的活力。 本法规定37度15分钟产生1umol丙酮酸的酶活力为一个单 本法规定37度15分钟产生1umol丙酮酸的酶活力为一个单 位，
乳酸脱氢酶测定方法
乳酸脱氢酶测定方法我们知道，现实生活中存在着各种各样的的酶，这些酶可以单独作用，也可以相互作用，对我们的人体产生很大的影响，但是相信大家对于酶的测定方法还不是很熟悉吧，不同酶的测定有不同的方式方法，而且方式方法也种类不一，现如今乳酸脱氢酶测定方法成为很多人研究的领域话题，那么到底该如何测定呢，下面就让我们一起来了解一下乳酸脱氢酶测定方法吧。
方法：实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。
每次检测都应该做标准曲线。
如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。
1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。
空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。
为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。
每孔加生物素标记抗体工作液 100μl（取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃，60分钟。
3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。
4. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液） 100μl，37℃，60分钟。
5. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。
7. 依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。
为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。
乳酸脱氢酶活力测定实验结果分析
乳酸脱氢酶活力测定实验结果分析
乳酸脱氢酶（LDH）是一种酶类，通常存在于心、肝、脾、肺、肌肉等组织中，也常用于检测心肌梗死、肝脏疾病、肺癌等疾病的确诊。
LDH活力的测定通常是通过采集患者血液样本，使用乳酸脱氢酶试剂盒检测LDH酶活力的浓度。
LDH的正常参考值通常是在140-280 U/L之间，但是要根据实验室标准和不同疾病诊断标准进行具体分析。
如果LDH活力高于正常参考值，则可能提示存在患有相关疾病的可能性。
需要注意的是，LDH活力仅可作为辅助诊断的指标之一，需要综合其他的体征、症状和检测结果进行综合分析，最终做出正确的诊断结论。
因此，如果你收到了LDH活力的实验结果，最好咨询医疗专业人士进行详细解读。
乳酸脱氢酶活力测定
结果异常可能原因及解决方案
1 2 3
样本问题
样本中可能存在干扰物质，如溶血、高血脂等， 导致结果偏高或偏低。解决方案包括重新采集样 本、使用抗干扰试剂等。
试剂问题
试剂质量不佳、过期或保存不当等可能导致结果 异常。解决方案包括更换试剂、检查试剂有效期 和保存条件等。
操作问题
操作不规范、加样不准确等也可能导致结果异常。 解决方案包括加强操作培训、使用加样器等。
荧光分析法
利用荧光探针与LDH结合产生荧光信号的原理，实现对LDH活力的高灵敏度、高选择性检 测。该方法具有操作简便、快速准确等优点，有望在生物医学领域得到广泛应用。
微流控芯片技术
将LDH活力测定过程集成到微流控芯片中，实现自动化、高通量的检测。该技术可大大提 高检测效率，降低人为误差，为LDH活力测定提供新的解决方案。
05 实验注意事项与安全防护
操作规范和安全防护措施
严格遵守实验室规章制度，确保实验环境整洁、有序。 使用前检查实验器材是否完好，如有破损应及时更换。
穿戴实验服、手套、护目镜等个人防护用品，避免直接 接触化学试剂。
遵循实验操作步骤，避免操作失误导致试剂飞溅或仪器 损坏。
废弃物处理方法和环保要求
废弃物应分类收集，严禁 将不同性质的废弃物混合 处理。
挑战
在实际应用中，乳酸脱氢酶活力测定仍面临 一些挑战，如样本处理复杂、干扰物质多、 仪器设备昂贵等。此外，不同来源和类型的 样本中LDH活力水平可能存在差异，这给准 确测定带来了一定难度。因此，未来需要继 续加强研究，探索更加简便、快速、准确的
LDH活力测定方法。
THANKS FOR WATCHING
VS
加样顺序
在反应体系中依次加入辅酶、底物、待测 样品和缓冲液，混合均匀后立即启动反应 。
乳酸脱氢酶(LDH)活性检测试剂盒说明书__可见分光光度法UPLC-MS-4342
乳酸脱氢酶（LDH）活性检测试剂盒说明书可见分光光度法货号：UPLC-MS-4342规格：50T/24S产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。
试剂名称规格保存条件提取液液体30mL×1瓶4℃保存试剂一液体25mL×1瓶4℃保存试剂二粉剂×1支-20℃保存试剂三液体25mL×1瓶4℃保存试剂四液体60mL×1瓶4℃保存标准品液体1mL×1支4℃保存溶液的配制：1、试剂二：临用时加入1.3mL双蒸水充分溶解备用，配好后可分装成小管-20℃保存，可保存两周，禁止反复冻融；2、标准品：2μmol/mL丙酮酸钠溶液。
产品说明：LDH（EC1.1.1.27）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是糖酵解途径的末端酶，催化丙酮酸与乳酸之间的可逆反应，伴随着NAD+/NADH之间互变。
LDH催化NAD+氧化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸进一步与2,4-二硝基苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，颜色深浅与丙酮酸浓度成正比。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。
如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清，按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20%或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。
乳酸脱氢酶(LDH)法操作说明
LDH法细胞毒性检测：原理：乳酸脱氢酶在胞浆内含量丰富,正常时不能通过细胞膜,当细胞受损或死亡时可释放到细胞外,所以细胞死亡数目与细胞培养上清中LDH活性成正比,用比色法测定实验孔LDH 活性,并与靶细胞对照孔进行比较,可计算效应细胞对靶细胞的杀伤百分率LDH（乳酸脱氢酶）是一种极为稳定的细胞质酶，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH 即被释放到细胞外； LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应转化成红色甲臢化合物，可通过酶标仪进行检测。
颜色形成的量与裂解细胞的数目成正比。
应用一个96-孔平板读数计收集可见光波长的吸收值数据。
这个分析可用于测量在细胞介导的细胞毒性分析中细胞膜的完整性，这种情况下目标细胞被效应细胞裂解，可判断细胞受损的程度。
乳酸脱氢酶（LDH）在胞质内含量非常丰富，细胞处于正常状态下其不能通过细胞膜，但当细胞受到损伤或死亡时便可释放到细胞外，此时细胞培养液中 LDH 的活性与细胞的死亡数目呈正比，通过用比色法测定并与靶细胞对照孔的 LDH 活性进行比较，可计算出效应细胞对靶细胞的杀伤百分数。
该实验方法操作简便、快速，可应用于 CTL 和 NK 细胞活性测定及药物、化学物质或放射所引起的细胞毒性，目前已有 LDH 法测定 CTL 活性的试剂盒。
同时设4个对照:靶细胞最大释放组、体积校正对照组、背景对照组和自然释放组按5∶1、10∶1、20∶1（效应细胞∶靶细胞）细胞过度生长、密度过高、离心速度过大、培养箱内外温差过大等因素会造成细胞自然释放乳酸脱氢酶操作流程：设立效应细胞孔（不同浓度的效应细胞设立效应细胞自发释放组）：50μl效应细胞+50μl培养基实验组：靶细胞不变，改变效应细胞：50μl效应细胞+50μl靶细胞设立靶细胞自发释放组：50μl靶细胞+50μl培养基设立靶细胞最大释放组：50μl靶细胞+50μl培养基+10μl裂解液（10×）设立体积校正对照组：100μl培养基+10μl裂解液（10×）设立背景对照组：100μl培养基250g离心4分钟37℃孵育4小时离心前45分钟添加裂解液（10×）至靶细胞最大释放组250g离心4分钟取上清50μl转移至另一孔板（可选）于独立的孔中加50μl LDH阳性对照（1：5000）于每孔中添加50μl再次稀释的底物混合物室温避光孵育30分钟添加50μl终止溶液490nm测吸收值1.靶细胞接种数目的优化1.1.设立检测板1.1.1.准备靶细胞：调整细胞浓度0, 5,000, 10,000, 20,000/100μl，使用与细胞毒分析相同的培养基及孔板终体积。
血清乳酸脱氢酶LDH测定
血清乳酸脱氢酶LDH测定1 检验目的指导本室工作人员规范操作本检测项目，确保检测结果的准确。
2 实验原理LDH催化乳酸氧化为丙酮酸，同时将NAD+还原为NADH，LDHNADH的生成速率与标本中乳酸脱氢酶的活力成正比。
L-乳酸 + NAD+丙酮酸 + NADH + H+3 标本：3.1 病人准备：无特殊。
3.2 类型：血清或EDTA血浆。
3.3 标本存放：3天内的活性损失：2～8℃保存：<8%；15～25℃保存：<2%。
3.4 标本运输：常温条件下保存运输。
3.5 标本拒收标准：标本溶血、细菌污染的标本。
4 实验材料4.1 试剂：上海复星长征医学科学有限公司LDH试剂盒（沪食药监械（准）字2014第2400166号 YZB/沪 1546-40-2014）4.1.1 试剂组成氯化钾 190mmol/L 试剂1（R1）乳酸62.5mmol/LTris缓冲液 100mmol/L试剂2（R2）NAD+ 30mmol/L Tris缓冲液 100mmol/L 4.1.2试剂准备试剂为即用式。
4.1.3 试剂稳定性与贮存：2～8℃避光、密封的储存条件下，试剂（盒）自生产之日起有效期为12个月。
试剂1 与试剂2 启用后，在2～10℃避光的条件下可稳定14天。
4.1.4 变质指示当试剂有看得见的微生物生长，有浊度，或者未开盖的液体有沉淀时，表明试剂已变质，不能继续使用。
4.1.5 注意事项试剂中含叠氮钠为防腐剂。
不可入口！避免接触皮肤及粘膜。
应采取必要的预防措施使用试剂。
4.2 校准品：使用上海复星长征医学科学有限公司提供的LDH校准品对自动分析仪进行校准。
4.3 质控品：使用正常值、病理值复合控制品。
5 仪器AU2700生化分析仪，罗氏P800生化分析仪, 西门子ADVIA-2400生化分析仪，东芝TBA-120生化分析仪6 操作步骤6.1 样品的准备：将标好号的样品离心后放到仪器规定的位置。
6.2 试剂的检测：仪器开机后，检查各种试剂的位置，体积等确认无误后方可进行测定。
乳酸脱氢酶实验原理
乳酸脱氢酶实验原理
乳酸脱氢酶（LDH）实验原理是基于LDH催化乳酸与辅酶NAD+之间的反应。
LDH催化乳酸脱氢成为丙酮酸，同时将NAD+还原为NADH。
该反应可以用下式表示：
乳酸 + NAD+ ⇌丙酮酸 + NADH + H+
在实验中，乳酸存在时，LDH会将乳酸氧化为丙酮酸，同时产生NADH。
NADH的生成量可通过光密度变化来测定。
NADH的光密度在340 nm波长下较高，因此可以使用分光光度计对其吸光度进行测量。
根据比色法原理，可以通过测量样品中NADH的吸光度变化来间接测定乳酸的含量。
根据比色法原理，NADH的吸光度与NADH的浓度成正比。
因此，通过测量反应体系中NADH 产生的速率和NADH的吸光度，可以推算出乳酸的浓度。
一般情况下，通过比较样品在LDH反应之前和之后的NADH 浓度变化来测定乳酸的含量。
这可以通过测量吸光度来实现。
吸光度值可以转换为相应的乳酸浓度，从而确定乳酸脱氢酶的活性或乳酸的浓度。
医学检验生化实验报告(3篇)
第1篇一、实验名称血清酶活性检测二、实验目的1. 掌握血清酶活性检测的基本原理和方法。
2. 学会使用生化分析仪进行血清酶活性检测。
3. 了解血清酶活性检测在临床诊断中的应用。
三、实验原理血清酶活性检测是通过测定血清中某种酶的活性来反映该酶在体内的代谢状况。
酶活性测定通常采用比色法、电化学法等方法，其中比色法是最常用的方法。
本实验采用比色法检测血清中丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）的活性。
四、实验材料1. 试剂：丙氨酸转氨酶（ALT）试剂盒、天冬氨酸转氨酶（AST）试剂盒、缓冲液、磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）、硫酸钠、氢氧化钠、盐酸、三氯乙酸等。
2. 仪器：生化分析仪、离心机、移液器、比色皿等。
3. 样品：血清样本。
五、实验步骤1. 样本处理：取血清样本，按照实验要求进行离心处理，分离出血清。
2. 丙氨酸转氨酶（ALT）活性检测：（1）按照试剂盒说明书配置反应体系，加入血清样本。
（2）将反应体系放入生化分析仪中，按照仪器操作步骤进行测定。
3. 天冬氨酸转氨酶（AST）活性检测：（1）按照试剂盒说明书配置反应体系，加入血清样本。
（2）将反应体系放入生化分析仪中，按照仪器操作步骤进行测定。
4. 结果记录与分析：记录实验数据，与正常值范围进行比较，分析实验结果。
六、实验结果1. 丙氨酸转氨酶（ALT）活性检测结果：实验测得的ALT活性为30 U/L，正常值范围为10-40 U/L。
2. 天冬氨酸转氨酶（AST）活性检测结果：实验测得的AST活性为25 U/L，正常值范围为15-35 U/L。
七、讨论与分析1. 丙氨酸转氨酶（ALT）活性检测：ALT主要存在于肝脏细胞中，其活性升高可反映肝脏损伤。
本实验中ALT活性检测结果在正常范围内，说明受试者肝脏功能正常。
2. 天冬氨酸转氨酶（AST）活性检测：AST广泛存在于人体各组织中，但以肝脏细胞中的含量最高。
AST活性升高可反映心肌损伤、肝脏损伤等。
乳酸脱氢酶测定方法
乳酸脱氢酶测定方法我们知道，现实生活中存在着各种各样的的酶，这些酶可以单独作用，也可以相互作用，对我们的人体产生很大的影响，但是信任大家对于酶的测定方法还不是很熟识吧，不同酶的测定有不同的方式方法，而且方式方法也种类不一，现如今乳酸脱氢酶测定方法成为许多人讨论的领域话题，那么究竟该如何测定呢，下面就让我们一起来了解一下乳酸脱氢酶测定方法吧。
方法：试验开头前，请提前配置好全部试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避开起泡。
每次检测都应当做标准曲线。
如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试剂盒的检测范围。
1. 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。
空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，留意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。
为保证明验结果有效性，每次试验请使用新的标准品溶液。
2. 弃去液体，甩干，不用洗涤。
每孔加生物素标记抗体工作液 100μl（取1μl生物素标记抗体加99μl生物素标记抗体稀释液的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃，60分钟。
3. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。
4. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液（同生物素标记抗体工作液） 100μl，37℃，60分钟。
5. 温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干。
6. 依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。
7. 依序每孔加终止溶液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
终止液的加入挨次应尽量与底物液的加入挨次相同。
为了保证明验结果的精确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8. 用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。
实验6 乳酸脱氢酶的活性测定
1、任务背景 乳酸脱氢酶（LDH）是催化乳酸和丙酮相互转化的同工酶，属 于氢转移酶。该酶存在于所有动物的组织中，在肝脏中活性最 高，其次为心脏、骨骼肌、肾脏，在肿瘤组织及白血病细胞中 也能检测到。在大多数动物组织中，它是由两种肽链按一定比 例组成的5种四聚体。它的每条肽链各由一个基因编码，经转 录、翻译、修饰加工等过程，最后成为有生物学活性的物质。 不同的动物，不同的组织或器官在不同的发育阶段或不同的生 活周期均有其特异性的同工酶酶谱。 2、任务目标 ①掌握LDH活性测定原理； ②学习用比色法测定酶活性的方法。 3、工作原理 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase简称LDH， EC.1.1.1.27, L－乳酸：NAD+氧化还原酶）广泛存在于生物细 胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化下列可逆反应。
利用上述原理，改变不同基质液可测定相应脱氢酶反应过程中 A340nm的改变，定量测定酶活力，如苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛 脱氢酶、甘油－3－3磷酸脱氢酶等，适用范围很广。
实验步骤
1）制备肌肉匀浆 称取1g 鸡肌肉, 剪碎，置10ml离心管中，编号；加入 4℃预冷的0.01 mol/L pH6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾 缓冲液4ml；匀浆，每次10s，连续3次。放置10min， 3000r/mLeabharlann n，离心5min。实验步骤
2）LDH活力测定 取1只比色杯中加入0.1m mol/L pH 7.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓 冲液3ml，置于紫外分光光度计中，在340nm处将光吸收调节至零。
取1只比色杯，依次加入丙酮酸钠溶液2.9ml, NADH溶液0.1ml，加 盖摇匀后。加入经稀释的酶液10μl，加盖摇匀后，在A340nm，连续 测定3min，以 A对时间作图，取反应最初线性部分，计算 A340nm/min减少值。 注意：加入酶液的稀释度（或加入量）应控制 A340nm/min下降值 在0.1－0.2之间。
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LDH可溶于水或稀盐溶液。组织中LDH含量测定方法很多，其中紫外 分光光度法更为简单、快速。鉴于NADH, NAD+ 在340nm及260nm 处有各自的最大吸收峰，因此以NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通 过340nm光吸收值得改变，定量测定酶的含量。本实验测定LDH活 力，基质液中含丙酮酸及NADH，在一定条件下，加入一定量酶液， 观察NADH在反应过程中340 nm 处光吸收减少值，减少越多，则 LDH活力越高。其活力单位定义是：在25℃，pH7.5条件下 A340nm/min下降为1.0的酶量为1个单位。可定量测定每克湿重组 织中LDH单位。定量测定蛋白质 3）数据处理 计算每毫升组织提取液中LDH活力单位： LDH活力（U）/mL =
提取液中LDH总活力单位＝LDH活力（U）/ml 总体 积
实验6乳酸脱氢酶的活性测定
1、任务背景 乳酸脱氢酶（LDH）是催化乳酸和丙酮相互转化的同工酶，属 于氢转移酶。该酶存在于所有动物的组织中，在肝脏中活性最 高，其次为心脏、骨骼肌、肾脏，在肿瘤组织及白血病细胞中 也能检测到。在大多数动物组织中，它是由两种肽链按一定比 例组成的5种四聚体。它的每条肽链各由一个基因编码，经转 录、翻译、修饰加工等过程，最后成为有生物学活性的物质。 不同的动物，不同的组织或器官在不同的发育阶段或不同的生 活周期均有其特异性的同工酶酶谱。 2、任务目标 ①掌握LDH活性测定原理； ②学习用比色法测定酶活性的方法。 3、工作原理 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase简称LDH， EC.1.1.1.27, L－乳酸：NAD+氧化还原酶）广泛存在于生物细 胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化下列可逆反应。
实验步骤
2）LDH活力测定 取1只比色杯中加入0.1m mol/L pH 7.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓 冲液3ml，置于紫外分光光度计中，在340nm处将光吸收调节至零。
取1只比色杯，依次加入丙酮酸钠溶液2.9ml, NADH溶液0.1ml，加 盖摇匀后。加入经稀释的酶液10μl，加盖摇匀后，在A340nm，连续 测定3min，以 A对时间作图，取反应最初线性部分，计算 A340nm/min减少值。 注意：加入酶液的稀释度（或加入量）应控制 A340nm/min下降值 在0.1－0.2之间。
利用上述原理，改变不同基质液可测定相应脱氢酶反应过程中 A340nm的改变，定量测定酶活力，如苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛 脱氢酶、甘油－3－3磷酸脱氢酶等，适用范围很广。
实验步骤
1）制备肌肉匀浆 称取1g 鸡肌肉, 剪碎，置10ml离心管中，编号；加入 4℃预冷的0.01 mol/L pH6.5磷酸氢二钾－磷酸二氢钾 缓冲液4ml；匀浆，每次10s，连续3次。放置10min， 3000r/min，离心5min。