微生物分子生态学研究方法

4. ERIC (肠杆菌基因间保守重复序列) -PCR 指纹图谱技术
• Di Giovanni 等用ERIC-PCR分析6种纯菌组成的混合 菌的组成，获得了高重复性的指纹图谱，比常规 RAPD-PCR相比更能反映菌群的组成特征。
• 在微生物群落中，各细菌数量占1-10%时，其特征性 ERIC-PCR主条带就可以在指纹图中表现出来。ERICPCR指纹图中，每一条带可以是来自若干种不同微生 物的基因组DNA片段，条带的数目反映微生物类群的 多少，条带的亮度反映该类群微生物种群数量的高低。
• “TA的过程： • 1.Amp抗性，挑选出含有质粒 的克隆 • 2.蓝白斑筛选，挑出带有插入 片段的克隆 • 3.PCR筛选，挑出带有正确长 度插入片段的克隆
ARDRA分型与测序
变性梯度凝胶电泳（DGGE）
• 变性梯度凝胶电泳（Denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是Lerman 等人于20 世纪80 年代初期发明的，起初主要用来检测DNA 片段中的点突变。 • Muyzer 等人在1993 年首次将其应用于微生物群落 结构研究 。后来又发展出其衍生技术，温度梯度凝 胶电泳（Temperature gradient gel electrophoresis， TGGE）。 • 此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学 研究的各个领域，目前已经发展成为研究微生物群 落结构的主要分子生物学方法之一 。
• 这一方法目前已经广泛运用于土壤、海洋、湖泊、肠 道等多种生态系统中微生物多样性的调查，揭示了环 境当中前所未知的微生物的行16S rDNA PCR扩增：把环境中几 乎所有微生物基因组上的16S rDNA扩增并收集到一起。 • universal primers: 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (Esherichia coli bases 8 to 27) 和 5’-TACCTTGTTACGACTT3’ (E.coli bases 1507 to 1492)
微生物分子生态学的一些研究方法
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分子生态学是应用分子生物学的原理和 方法来研究生命系统与环境系统相互作用 的生态机理及其分子机制的科学。它是生 态学与分子生物学相互渗透的形成的一门 新兴交叉学科，其研究内容包括种群在分 子水平的遗传多样性及遗传结构，生物器 官变异的分子机制，生物体内有机大分子 对环境因子变化的响应，生物大分子结构、 功能演变与环境长期变化的关系以及其他 生命层次生态现象的分子机理等。
5. 以PCR为基础的rRNA及rDNA的分析方法
• 用于微生物群落结构分析的基因组DNA的序列包 括：核糖体操纵子基因序列(rDNA)、已知功能基 因的序列、重复序列和随机基因组序列等。
• 最常用的标记序列是核糖体操纵子基因(rDNA)。 rRNA(rDNA)在细胞中相对稳定，同时含有保守序 列及高可变序列，是微生物系统分类的一个重要 指标。
醌指纹法(Quinones Profiling) 呼吸醌广泛存在于微生物细胞膜中，在电子传递链 中起重要作用，主要有泛醌(ubiquinone辅酶Q) 和甲基 萘醌(menaquinone维生素K)。醌可以依据侧链含异戊 二烯单元的数目和侧链上使双键饱和的氢原子数进一 步区分。
每一种微生物都含有一种占优势的醌，而且不同的 微生物含有不同种类和分子结构的醌。因此，醌的多 样性可定量表征微生物的多样性，醌谱图（即醌指纹） 的变化可表征群落结构的变化。
具体而言，CLPP就是通过检测微生物样品对多种不同 的单一碳源的利用能力，来确定哪些基质可以作为能源， 从而产生对基质利用的生理代谢指纹。
BIOLOG鉴定系统
在96孔细菌培养板上检测微生物对不同发酵性碳源（95种） 利用情况。 干膜上都含有培养基和氧化还原染料四唑 微生物利用碳源进行呼吸时（产生的NADH），会将四唑从无 色还原成紫色。 每个孔中含有 不同的底物 菌悬液或 无菌水
1、传统的微生物培养法
虽然可以检测环境中的活细胞，并且对微生物生态 学的发展起了很重要的作用。 采用配比简单的营养基质和固定的培养温度，还忽 略了气候变化和生物相互作用的影响，这种人工环境 与原生境的偏差使得可培养的种类大大减少 （不到1 % ）。 Amann 等人报道在自然环境样品中可培养的微生物 占总的微生物数量的比例范围从0.001%（海水）到 0.3%（土壤）。 不能全面地反映微生物区系组成状况，烦琐、耗时。
微生物不可培养的原因
培养条件
营养限制
失去生态位
2、群落水平生理学指纹方法(CLPP)
微生物所含的酶与其丰度或活性是密切相关的。 如果某一微生物群落中含有特定的酶可催化利用某特 定的基质，则这种酶-底物可作为此群落的生物标记分子 之一。 由Garlan和Mills于1991年提出的群落水平生理学指纹 方法(CLPP)，通过检测微生物样品对底物利用模式来反 映种群组成的酶活性的分析方法。
自动化、快速
可鉴定细菌有1140多 种、酵母菌267种、目前 已经可用于丝状真菌。
仅能鉴定快速生长的微生物，误差较大（pH），拥有的标准数据 库还不完善
3、生物标记物法（Biomakers ）
• 生物标记物通常是微生物细胞的生化组成成分，其 总量通常与相应生物量呈正相关。 • 特定的标记物标志着特定的微生物，一些生物标记 物的组成模式(种类、数量和相对比例)可作为指纹 估价微生物群落结构。 • 首先使用一种合适的提取剂直接把生物标记物从环 境中提取出来，然后对提取物进行纯化，后用合适 的仪器加以定量测定。 优点：不需要把微生物的细胞从环境样中分离， 能克服由于培养而导致的微生物种群变化，具有 一定的客观性。
微生物群落结构和多样性是微生物生态学 研究的热点内容。
群落结构决定了生态功能的特性和强弱。 群落结构的高稳定性是实现生态功能的重要因素。 群落结构变化是标记环境变化的重要方面。
通过对环境微生物群落结构和多样性进行解析并研究 其动态变化，可以为调节群落功能和发现新的重要微 生物功能类群提供可靠的依据。
微生物群落结构和多样性研究方法：
• 20世纪70年代以前：传统的培养分离方法，依靠形态 学、培养特征、生理生化特性的比较进行分类鉴定和 计数，认识是不全面和有选择性的，方法的分辨水平 低。 • 在70和80年代：对微生物化学成分的分析，建立了一 些微生物分类和定量的方法（生物标记物方法），对 环境微生物群落结构及多样性的认识进入到较客观的 层次上。 在80和90年代：现代分子生物学技术以DNA为目标物， 通过rRNA基因测序技术和基因指纹图谱等方法，比较 精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性，并给出了 关于群落结构的直观信息。
16S ribosomal RNA
Present in all life • molecular chronometer – taxonomy (large database) – evolution one active bacterial cell: – ~ 104 copies – ~ 15 rRNA genes (i.e., rDNA) (Mycobacterium tuberculosis, Mycoplasma pneumoniae, Sulfolobus solfataricus with 1 copy, Clostridium paradoxum with 15 copies) ~1500 nt (enough information) – four different domains – conserved regions (no variation among all life) – variable regions (V1-V9)
醌指纹法具有简单快速的特点。
磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid, PLFA）、甲基脂肪 酸酯（Fatty acid methyl ester, FAME）谱图分析
• 磷脂是构成生物细胞膜的主要成分，约占细胞干重的5%。在 细胞死亡时，细胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速的代谢 掉，因此它只在活细胞中存在，十分适合于微生物群落的动 态监测。 • 脂肪酸具有属的特异性，特殊的甲基脂肪酸已经被作为微生 物分类的依据。 • 磷脂脂肪酸谱图分析法首先将磷脂脂肪酸部分提取出来，然 后用气相色谱分析，得出PLFA谱图。 • 甲基脂肪酸酯是细胞膜磷脂水解产物，气相色谱分析系统分析 出全细胞的FAME谱图。
• 分析不同环境样品中微生物混合DNA的ERIC-PCR指 纹图谱的差异，就可比较不同生态系统微生物群落的 差异，或者同一个群落在不同功能状态下的结构变化。
ERIC-PCR引物20 pmol/μl
E1: 5'-ATgTAAgCTCCTggggATTCAC-3' E2Cg-3'
Diversity estimation based on molecular markers
实验原理
• 16S rDNA是基因组的“biomarker” • – 核糖体RNA是蛋白质合成必需的，16S rDNA 广泛存在于所有原核生物的基因组中。 • – 16S rDNA的序列中包括保守区和可变区。 • – 序列变化比较缓慢，与物种的形成速度相适应， 而且一般不发生水平转移。 • – GeneBank和RDPⅡ（Ribosomal DatabaseProject ） 数据库中已经登录了超过97,128个经过比对和注释 的16S rDNA序列，可供进行比对。
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PLFA方法适合跟踪研究微生物群落的动态 变化,能够快速有效的从环境样品种提取大部分脂 肪酸,但是也有其局限性。 第一,他不能从种的水品上鉴定微生物,只能 鉴定到属; 第二,这种方法强烈的依赖于标记脂肪酸,标 记脂肪酸变化导致错误的群落变化估计,因此操作 过程需要十分谨慎,防止人为因素的干扰。 第三,细菌和真菌在不同的生长时期以及环境 压力下的脂肪酸含量有所变化,给监测带来困难。 另外，不同微生物种属之间脂肪酸组成有重 叠，外来生物污染也限制了脂肪酸谱图法对种群 结构解析的可靠性。
• 显示的是一个234bp 长的DNA 片段的解链区域，横坐标是该DNA 片段的序列，依次从第一个碱基到第234 个碱基；纵坐标是解链 温度。该DNA 片段共有3 个解链区域。 • MD1 是解链温度最低的一个解链区域，MD3 是温度最高的一个 解链区域。
• 不同的双链DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区 域及各解链区域的解链温度也是不一样的。
原理
• 双链DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决 定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA 片段能够被区分开， 但同样长度的DNA 片段在胶中的迁移行为一样，不能被区分。 • DGGE/TGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变 性剂（尿素和甲酰胺）梯度或是温度梯度，从而能够把同样长 度但序列不同的DNA 片段区分开来。 • 一个特定的DNA 片段有其特有的序列组成，其序列组成决定 了其解链区域(melting domain, MD)和解链行为(melting behavior) 。 • 一个几百个碱基对的DNA 片段一般有几个解链区域，每个解 链区域有一段连续的碱基对组成。当变性剂浓度逐渐增加各区 域依次发生解链。

Source: Louis, B., Gene IV年，Giovannoni等首先用这一方法分析马尾藻海 海面上浮 • 发现了一个新的且在该环境中占优势的微生物类群； • 与传统的分离培养的方法相比，更全面得揭示了微生 物多样性；