菌种的衰退复壮和保藏
食用菌菌种保藏原理以及衰退菌种的菌种复壮
食用菌菌种保藏原理以及衰退菌种的菌种复壮今天要和大家介绍的是食用菌菌种保藏原理以及衰退菌种的菌种复壮，这是食用菌生产过程中少不了的步骤。
一、菌种贮藏原理食用菌菌种是国家重要的种质资源。
菌种保藏是食用菌生产中的一项必不可少的环节。
食用菌和其他生物一样，都具有遗传性和变异性。
遗传性保证了子代遗传特征的相对稳定，为菌种贮藏提供了条件；变异性使子代的性状与亲本相比会发生某些改变，给菌种的保藏带来了困难。
食用菌菌种在长期的栽培和保藏过程中，由于传代次数过多或不利环境条件的影响，常常会导致菌种衰退，丧失其优良性状。
因此，要想在一定时间内使菌种的生活力、纯度和优良性状稳定地保存下来，就应该采取一定的措施，进行菌种保藏工作。
菌种保藏的目的是在特定条件下，降低菌种的代谢速度，使其处于休眠或半休眠状态，在一定的保藏期内，确保菌种的纯度，防止病虫害感染，以保持菌种的优良性状，当条件适宜时又可以重新恢复生长繁殖。
菌种保藏的基本原理是采用低温、干燥、饥饿、缺氧等方法，以抑制菌丝生长，降低代谢速度，使菌丝处于休眠或半休眠状态，并保证菌种的纯度。
二、菌种复壮从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，进行分离、培养，从而达到恢复菌种优良性状的过程就叫菌种复壮。
在实际生产中，多是在菌种尚未退化之前进行菌种复壮。
(一)菌种复壮原理生物以遗传变异为基础，通过自然选择和人工选择得以进化。
变异提供了选择的基础，选择保存了适应环境的个体，保存的个体使遗传特征得以遗传。
如此再变异、再选择、再遗传，循环往复，使生物得以不断进化。
菌种复壮就是依据这个原理进行的。
(二)菌种复壮方法1.挑选健壮菌丝进行接种：每次转接菌种时都挑选健壮菌丝进行接种是防止菌种衰退的有效、简便的措施。
2.进行分离复壮：从衰退的群体中找出尚未衰退的个体，通过分离进行复壮。
如菌丝分离，用无菌水将斜面上的菌丝稀释，再将菌丝体放入装有无菌蒸馏水的三角瓶中摇匀，然后转接到平板培养基上，使菌丝分布均匀，适宜条件培养至萌发成菌落。
菌种的保藏与复壮
(二)低温定期移植法
• 把培养好的斜面菌种放在低温干燥处保存，
定期移植，一般3～6个月移植一次(视菌种 特征而定)。也可以用穿刺培养，定期移植 法保藏细菌，其效果也较好。穿刺培养是 将含0.6％～0.8％的琼脂培养基装试管灭 菌后直立冷凝后，用接种针尖挑取少量菌 体，垂直刺入琼脂培养基中心，放在适当 温度下培养，待菌长好后即可放低温保存， 此法较斜面保存有利，大肠杆菌可保藏2年 以上不发生明显变异。
• (2)保护剂 不同种类的保护剂对不同
微生物的作用是不同的，如个别菌种在 脱脂乳作保护剂的情况下死亡率高达 99.99%，而采用葡聚糖等混和保护剂时 死亡率大大减少。一般情况下，那些容 易保存的菌种对保护剂的要求不很严格， 而不易保存的菌种对保护剂的要求却很 苛刻。因此，选择好的保护剂是冷冻干 燥保存菌种的关键因素。
(六)真空冷冻干燥法
• (3)菌种准备及分装 菌种要求为生长良好
的纯种，菌龄以处于稳定期为好，孢子是 新鲜的。每支长好的斜面加2～3ml保护剂， 用接种环将菌苔轻轻刮起(注意勿刮起培养 基)，制成菌悬液。如用液体培养的菌种， 则需经离心收集和用灭菌生理盐水洗涤细 胞，收集的菌体用保护剂悬浮制成菌悬液。 悬液中菌数要求达到10 8～10 10cfu/ml 为宜。悬液制备完成尽快分装和冻结。分 装安瓿时可用灭菌的长滴入安瓿管底部， 装量可依据冷冻干燥机效能而定。
(六)真空冷冻干燥法
• (4)预冻 分装好的安瓿管需要进行预冻，即放在-
30～40℃下冻结20～60min，也可以用干冰和无水 乙醇冻5～10min。
• (5)冷冻干燥 经预冻的安瓿放入干燥箱中开始
抽真空干燥。此时干燥箱温度控制在-30℃以下， 并尽快使真度达到66Pa以下。此后可还渐升温以加 速水分升华，但升温不宜过快，以免引起样品融化。 干燥时间视冻干机效率、样品装量及性质等而寂， 以样品最终水分含量达到1%～3%为准。具体操作时 是根据冻干样品呈酥块工松散片状；真空度接近空 载时最高真空；样品温度与管外温度接近。 完毕将安瓿管在真空下用火焰烧熔密封，并用高频 真空检测真空度。
四节菌种退化复壮与保藏
（3）利用不易衰退的细胞传代：霉菌、放线菌： 无性孢子或有性孢子
（4）采用有效的菌种保藏方法
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二. 菌种的复壮 rejuvenation
狭义复壮 在菌种已发生衰退
的情况下，通过纯种分离和 测定典型性状、生产性能等 指标，从已衰退的群体中筛 选出少数尚未退化的个体， 以达到恢复原菌株固有性状 的相应措施；
结（-25—-40℃）→抽真空（至0.01mmHg） → 真空封口 → 检 查真空度 → 保藏
措施：低温、干燥，缺氧，有保护剂 适用：各大类 保藏期：5-15年或更长
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5.甘油悬液低温冷冻保藏法 ▪ 方法：菌种培养 → 15-30%甘油缓冲液悬浮 → 加入保藏管中
→ 置 -70℃冰箱保藏 措施：低温（-70℃）、保护剂（15~50%甘油） 适用：细菌、酵母菌 保藏期：约10年 6.液氮保藏法 ▪ 方法：菌种培养 → 保护剂悬浮 → 加入保藏管中 → 置液氮瓶
中国工业微生物菌种保藏中心CICC(归口轻工业总会) 中国食品发酵工业研究所(IFFI)
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中国医学微生物菌种保藏中心CMCC(归口卫生部) 中国医学科学院皮肤病研究所(ID)，南京 卫生部药品生物制品检定所(NICPBP) 中国预防医学科学院病毒研究所
中国抗生素微生物菌种保藏中心CACC(国家医药管 理局) 中国医学科学院医药生物技术研究所 四川抗生素研究所(SIA)，四川 华北制药厂抗生素研究所(IANP), 石家庄
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三. 菌种的保藏
（一）目的 使微生物菌种保持原来的性状和活力不退化、
不死亡、不被污染，便于研究、交换和使用 。 （二）原理
挑选典型培养物（typical culture）的优良纯 种，并创造最有利于休眠的环境条件，使微生物处于 代谢不活泼、生长受抑制的休眠状态。
菌种的衰退、复壮和保藏
菌种的衰退、复壮和保藏1. 内容1.菌种的衰退：菌种退化是指由于自发突变的结果，而使某一物种有一系列生物学性状发生量变或质变的现象（群体中退化细胞在数量上占一定数值后，表现出菌种生产性能下降的现象）。
具体表现为：⏹原有的形态性状变得不典型了；⏹生长速度变慢，产生的孢子变少，或颜色改变，甚至变形；⏹代谢产物生产能力下降，在生理上常指产量的下降；⏹致病菌对宿主侵染力的下降；⏹对外界不良条件包括低温、高温或噬菌体侵染等抵抗能力的下降；等等。
2.衰退菌种的复壮狭义的复壮仅是一种消极的措施，指的是在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施。
广义的复壮则应是一项积极的措施，即在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择自发的正变个体。
（1）衰退的防止:⏹控制传代的次数⏹创造良好的培养条件⏹利用不易衰退的细胞传代⏹采用有效的菌种保藏方法（2）菌种的复壮⏹纯种分离法⏹通过宿主体复壮对于因长期在人工培养基上移种传代而衰退的病原菌，可接种到相应的昆虫或动、植物宿主体中，通过这种特殊的活的“选择性培养基”一至多次选择，就可从典型的病灶部位分离到恢复原始毒力的复壮菌株。
⏹淘汰已衰退的个体（3）菌种的保藏⏹原理人为地创造合适的环境条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。
这些人工环境主要从低温、干燥、缺氧三方面设计。
⏹常用的方法：冷冻干燥保藏法、液氮保藏法、斜面保藏法、液体石蜡覆盖保藏法、载体保藏法、悬液保藏法、寄主保藏法等。
2. 练习一．填空1.某纯种微生物群体中的个别个体由于发生自发突变的结果，而使该物种原有一系列生物学性状发生衰退性的量变或质变的现象，叫做_____。
答案：衰退2. ______属于第三代的生物武器，包括高致病力的病原体和抗药菌等。
10菌种的衰退复壮和保藏_PPT课件
菌种保藏的具体方法
2.隔绝空气保藏法： 该法保藏的原理主要是通过限制
氧的供应以削弱微生物的代谢作用， 故不适用于厌氧菌。
石蜡油保藏法 橡皮塞密封保藏法 琼脂柱穿刺封口保藏法
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菌种保藏的具体方法
3.干燥保藏法：断绝对微生物的水分供应，能 使微生物的代谢活动强度明显减弱。
最后，衰退还表现在抗不良环境条件 （抗噬菌体、抗低温等）能力的减弱 等。
菌种的衰退是一个由量变到质变的逐 步演变过程，必须及时采取有效措施 进行复壮。
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菌种的复壮
1.纯种的分离： 通过纯种分离可把退化菌种中的一部
分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来， 经过扩大培养就可恢复原菌株的典型性状。 粗放的方式：只能达到“菌落纯”的水平， 即从种的水平来说是纯的。 较精细的方式：单细胞或单孢子分离方法。 它可以达到“细胞纯”即“菌株纯”的水 平。
菌种的保藏
菌种是国家的重要自然资源，菌 种保藏是微生物学的重要基础工作。 菌种保藏的目的是使之不混乱、不死 亡、不污染，并稳定保持原有特性。 农业微生物学国家重点实验室－－
国内唯一的、代表我国农业微生 物科研领域最高水平的实验室。
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菌种保藏的具体方法
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常见活菌制剂成品的 保存条件及适宜储存时间？
成品种类 冻干乳酸菌 冻干红假单胞菌 液态乳酸菌 液态红假单胞菌 复合芽孢杆菌粉 粪肠球菌
保存条件
密封、常温、避光、阴凉 密封、常温、避光、阴凉 密封、常温、避光、阴凉 密封、常温、避光、阴凉 密封、常温、避光、阴凉 密封、常温、避光、阴凉
9-2菌种的衰退、复壮和保藏
衰退的原因： 大量群体中的自发突变
菌种衰退的表现
• 对产量性状来说，菌种的负变就是衰退。 • 其他原有的典型性状变得不典型时，也是衰退。 最易觉察到的是菌落和细胞形态的改变。 • 生长速度缓慢，产孢子越来越少。 • 代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降。 • 衰退还表现在抗不良环境条件（抗噬菌体、抗 低温等）能力的减弱等。
实践中复壮方法
• 1．纯种分离 。
• 2．通过宿主体内生长进行复壮 。
• 3．淘汰已衰退的个体
三、菌种的保藏
基本要求： 在一定时间内使菌种不死、不变、不乱
原理：
采用低温、干燥、缺氧、缺乏营养、添加保护剂或酸 度中和剂等方法，挑选优良纯种，最好时候它们的休 眠体，使微生物生长在代谢不活泼、生长受抑制的环 境中。
载体法
原理：使生长合适的微生物吸附在一定的载体上进行干燥。 常用的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、磁珠 和滤纸片等。 操作方法（砂土管保藏法） （1）河砂处理 取河砂若干加入盐酸10% ，加热煮沸30min除去有机机质。 倒去盐酸溶液，用自来水冲洗至中性，最后一次用蒸镏水冲洗， 烘干后用40目筛子过筛，弃去粗颗粒，备用。 （２）土壤处理 取非耕作层不含腐殖质的痩黄土或红土，加自来水浸泡洗 涤数次，直至中性。烘干后碾碎，用100目筛子过筛，粗颗粒部 分丢掉。 (3)砂土混合 处理妥当的河砂与土壤按3：1的比例掺合(或根据需要而 用其他比例，甚至可全部作砂或土)均匀后，装入10x100mm的小 试管或安瓿管中，每管分装1g左右，塞上棉塞，进行灭菌(通常 采用间歇灭菌2--3次)，最后烘干。
从生长斜面制备菌悬液 从液体培养制备菌悬液
2．控速冷冻
致冷速度为1℃/min
(三)复苏
迅速将安瓿置于37-40℃水浴中，并轻轻摇动以加速解；用巴 氏吸管将安瓿中贮存培养物移接入含有2m1无菌液体培养 基的试管中，用同一支吸管反复抽吸数次，然后取0.10.2ml (约4、8滴)转接入琼脂斜面上。
菌种的衰退、复壮和保藏
第五节菌种的衰退、复壮和保藏性状稳定的菌种是微生物学工作最重要的基本要求，否则生产或科研都无法正常进行。
影响微生物菌种稳定性的因素有变异、污染、死亡。
由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种方法能被证明对所有的微生物均适宜。
因此，在具体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。
对于一些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而导致菌种的丧失。
一、斜面冰箱保藏法一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰满于4℃冰箱保存。
保存期3月到6月。
二、沙土管保藏法适合于产孢子或芽孢的微生物。
首先，将沙与土洗净、烘干、过筛，按沙与土的比例为1—2：1混合均匀，分装于小试管中，料高1厘米左右，121C间歇灭菌三次，烘干备用。
一般沙80目，土80一100目。
其次，将孢子制成悬浮液，接入沙土管。
或将斜面孢子刮下直接与沙土混合，置干燥器中用真空泵抽干，冰箱内保存。
保存期1年左右。
三、菌丝速冻法不产孢子或芽孢的M可用甘油菌丝速冻法。
该法保藏温度为-20℃，为避免M受损伤致死，需甘油作保护剂。
甘油最终浓度为25％。
操作：①、配制浓度为50％的甘油溶液，121℃灭菌后备用；②、制备菌悬液，一般浓度为108～1010个/mL；③、菌悬液和甘油溶液等体积混合均匀，置-20℃保藏。
四、石蜡油封存法向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石蜡油，量高出斜面1cm，然后保存在冰箱中。
此法适于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、酵母等M的保存。
保存期约1年五、真空冷冻干燥保藏法是目前国内外较理想的常用方法。
其基本原理是在较低温度下(-18℃)，快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。
在这样的环境中，M的生长和代谢暂时停止，不易发生变异。
菌种可保存5年左右。
菌种的退化与保藏
• •
• •
• 3.经常进行菌种纯化 • 所谓菌种纯化就是对菌种进行自然分离。首先将菌种 制成单细胞或单孢子悬浮液，经稀释后将其涂布与琼脂平 板上培养，待平板上单菌落培养成熟后挑取单菌落移种斜 面，再经摇瓶 试验后测定其生产能力，从中选出高水平 的菌种。 • 4.采用良好的培养基和培养条件 • 培养基和培养条件可以从多方面影响菌种的性状，因 此，为了防止菌种退化，要选择合适的培养基和培养条件 。 • 5.采用科学的保藏方法 • 在菌种保藏过程中也会发生菌种退化现象，尤其是不 良的保藏条件更易引起菌种退化。因此，要采取科学和有 效的菌种保藏方法以防止菌种优良性状的退化。
• 复壮的方法：
• （1）纯种分离法（pure
稀释分离法 平板划线法 组织分离法
culture isolation）
• （2）通过宿主体复壮
寄生型微生物的退化菌株可接种到相应寄主体内以提高菌株的 活力。
（3）联合复壮
对退化菌株用高剂量的紫外线辐射和低剂量的亚硝基胍（NT藏
二、菌种的复壮
• 定义 • 狭义的复壮： • 是指菌种已发生衰退后，通过纯种分离和测定典型性状、生产性 能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢 复原菌株固有性状的相应措施。 • • 广义的复壮： • 在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取 纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择到自发的正变个体。 • 一种积极的措施 一种消极的措施
• 菌种（culture，stock culture）
是一种极其重要和珍贵的生物资源。
• 菌种保藏（preservation，conservation，maintenance）
是一项十分重要的基础性工作。
菌种的衰退、复壮及保藏
一、菌种的衰退与复壮
1. 衰退 菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某些 原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象。 衰退的原因：①基因突变 ②菌种不纯 ③ 培养条件不当 常见的衰退现象：
菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少； 代谢产物生产能力下降；
2. 原理： 选用优良的纯种（最好是休眠体，如分生孢子、芽胞
等），创造降低微生物代谢活动强度，生长繁殖受抑制，难 以发生突变的环境条件。（其环境要素是干燥、低温、缺氧、 缺营养 以及添加保护剂等）
3. 国内外菌种保藏机构 菌种保藏机构的任务 广泛收集科研和生产菌种、菌株，并加以妥善保管，使之达 到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。
菌种的复壮措施
①纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑 取法等）。 ②通过寄主体内生长进行复壮（如杀螟杆菌的复壮）； ③淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理 ，以杀死生命力较差的已衰退个体）。 ④联合复壮，用高剂量的紫外线辐射和低剂量的亚硝基胍 联合处理
二、菌种保藏
1. 目的： ①存活，不丢失，不污染 ②防止优良性状丧失 ③随时为生产、科研提供优良菌种
2、 菌种的复壮
狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分 离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的 个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施； 广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经 常进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产 性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从 生产中选种。
菌种保藏机构 中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所（NCTC） 法国里昂巴斯德研究所（IPL）
菌种保存方法和菌种的衰退复壮
菌种保存方法和菌种的衰退复壮菌种保存方法微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生活能力。
低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，所以，菌种保藏方法虽多，但都是根据这三个因素而设计的。
保藏方法大致可分为以下几种：1．传代培养保藏法又有斜面培养、穿刺培养、疱肉培养基培养等（后者作保藏厌氧细菌用），培养后于4—6℃冰箱内保存。
2．液体石蜡覆盖保藏法是传代培养的变相方法，能够适当延长保藏时间，它是在斜面培养物和穿刺培养物上面覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。
3．载体保藏法是将微生物吸附在适当的载体，如土壤、沙子、硅胶、滤纸上，而后进行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和滤纸保藏法应用相当广泛。
4．寄主保藏法用于目前尚不能在人工培养基上生长的微生物，如病毒、立克次氏体、螺旋体等，它们必须在生活的动物、昆虫、鸡胚内感染并传代，此法相当于一般微生物的传代培养保藏法。
病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法5．冷冻保藏法可分低温冰箱（-20—-30℃，-50—-80℃）、干冰酒精快速冻结（约-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。
6．冷冻干燥保藏法先使微生物在极低温度（-70℃左右）下快速冷冻，然后在减压下利用升华现象除去水分（真空干燥）。
有些方法如滤纸保藏法、液氮保藏法和冷冻干燥保藏法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，以防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。
保护性溶质可通过氢和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。
保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等。
三、器材细菌、酵母菌，放线菌和霉菌；肉膏蛋白胨斜面培养基，灭菌脱脂牛乳，灭菌水，化学纯的液体石蜡，甘油，五氧化二磷，河沙，瘦黄土或红土，冰块、食盐，干冰，95％酒精，10％盐酸，无水氯化钙；灭菌吸管，灭菌滴管，灭菌培养皿，管形安瓿管，泪滴形安瓿管（长颈球形底），40目与100目筛子，油纸，滤纸条（0．5×1．2c m），干燥器，真空泵，真空压力表，喷灯，L形五通管，冰箱，低温冰箱（-30℃），液氮冷冻保藏器。
菌种保藏与复壮
菌种保藏与复壮
一、菌种保藏
（一）保藏目的及原理 （二）常用保藏法 （三）保藏注意
二、菌种复壮
(一）菌种的衰退 （二）复壮方法 （三）防衰措施
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一、菌种保藏
（一）保藏目的及原理 目的 不死亡 不生长 不污染 使菌种 不降低或不丧失其优良性 原理
以尽量延长使用时间
创造不利于菌种生长的一切条件， 使其代谢处于休眠状态。
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口堵胶塞 淹没斜面约1cm
用时转管再转管
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3.自然基质保藏法
麦粒浸透、煮熟 基质的处理 麸皮拌湿 装管
灭菌
接种
培养
干燥器去水
防衰老 特点 保藏时间长 转接后生长旺 易污染，灭菌要彻底
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（三）保藏注意
用保种培养基
及时保藏（菌丝占斜面2/3）
最好换胶塞 用时活化
严防棉塞受潮
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二、菌种的复壮
概念 确保或恢复菌种优良性能的措施
（一）菌种的衰退 表现 形态改变、生长慢、 抗逆性差、产量及质量下降 内因 菌种的遗传物质发生了负变 外因 传代过多，条件不适宜
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根源
（二）复壮法 组织分离 母种 孢子分离
1.繁殖交替法
再生 母种
栽培
子实体
2. 经常改变培养条件 3.转管时只取Leabharlann 端菌丝返回本节低温
缺营养
不利 条件
干燥
无氧
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（二）常用保藏法 以母种形式保藏 1.斜面低温法 斜面菌种置4~6℃冰箱中（3~6个月） 简便 保藏时间短 易污染及退化 不适于草菇等菌类
特点
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菌种的复壮与保藏(陈)
混合分装于冻存管内； • 将培养物在平皿培养，形成菌落后，用无菌打孔
器从平板上切取一些大小均匀的小块（直径约510毫米），真菌最好取菌落边缘的菌块，与保护 剂混匀后加入冻存管内； • 在小安瓿管中装1.2-2毫升的琼脂培养基，接种菌 种，培养2-10天后，加入保护剂，待保藏。
2、连续传代 连续传代是加速菌种衰退的一个重要原因。 一方面，传代次数越多，发生自发突变（尤其是负突
变）的几率越高； 另一方面，传代次数越多，群体中个别的衰退型细胞
数量增加并占据优势越快，致使群体表型出现衰退。
3、不适宜的培养和保藏条件
不适宜的培养和保藏条件是加速菌种衰退的另一个重 要原因。不良的培养条件如营养成分、温度、湿度、pH值、 通气量等和保藏条件如营养、含水量、温度、氧气等，不 仅会诱发衰退型细胞的出现，还会促进衰退细胞迅速繁殖， 在数量上大大超过正常细胞，造成菌种衰退。
➢低温保藏法
•方法：-20℃ •适用：无芽孢厌气菌，放线菌等 •保藏期：1年或更长
➢麸皮保藏法——曲法保藏。
• 措施：以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然后在 低温干燥条件下保存。
• 方法：麸皮：水＝1：（0.8～1.5） →湿热灭菌 →接种→干燥→低温保存
• 适用：产孢子的霉菌和某些放线菌 • 保藏期：1年～数十年
于正常菌株生长，限制退化菌株的数量，防止衰退。
3、利用不易衰退的细胞移种传代
在放线菌和霉菌中，由于它们的菌丝细胞常含几个细胞核，甚至 是异核体，因此用菌丝接种就会出现不纯和衰退，而孢子一般是单核 的，用它接种时，就不会发生这种现象。
另外，有些霉菌（如构巢曲霉）若用其分生孢子传代就易衰退， 而改用子囊孢子移种则能避免衰退。
发酵工程——菌种的衰退、复壮和保藏
国外菌种保藏机构 1）美国典型菌种保藏中心（ATCC）
位于马里兰州，现藏细菌8000株，丝状真菌
4400株，酵母菌606株及其他菌种千余株。保藏 方法主要以冷冻干燥和液氮超低温冻结法。 2）荷兰真菌中心收藏所（CBS） 位于荷兰巴尔恩市，现藏细菌1000株，丝状
斜面保藏法
• 因此要求在基本培养基上传代为好，目的是能 淘汰突变株；同时转接菌量应保持较低水平。 • 斜面培养物应在密闭容器中于4℃保藏，以防止 培养基脱水并能降低代谢活性。 • 保存期2个月到6个月
穿刺保藏法 • 斜面保藏法的改进 • 常用于好气性细菌的保藏，真菌、放线菌等 • 1~2cm高的穿刺培养物上覆盖2 ~3mm的液体 石蜡
举例： 产链霉素放线菌菌种分离（从退化菌 种中筛选）
取工业发酵液（含孢子）样品1环 放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀
采用稀释法制平板，获取单菌落
斜面保藏
高产菌恢复
根据高产菌的特点，选择目的菌落
放大培养，发酵液性能测试
三、 菌种保藏的原理和方法
菌种保藏的意义 菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材 料，特别是利用微生物进行有关生产如抗生素、 氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种 保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重 要组成部分。其任务首先是使菌种不致死亡，同 时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而 不致向坏的方面转化。
国内菌种保藏机构 2）林业微生物菌种保藏中心 1985年成立，由林科院负责，侧重林业微生物
的菌种保藏，现保藏菌种690余株；
国内菌种保藏机构 3）中国科学院典型培养物保藏管理中心
菌种的衰退、复壮和保藏
冷冻干燥保藏法 液氮保藏法 CCCCM采用的菌种保藏法 采用的菌种保藏法： 采用的菌种保藏法
（ China Committee for Culture Collections of Microorganism，中国微生物菌种保藏委员会） 中国微生物菌种保藏委员会） 中国微生物菌种保藏委员会
斜面传代法 冷冻干燥保藏法 液氮保藏法
赤潮或红潮（ 赤潮或红潮（red tides）： ）：
在海洋中，某些甲藻类大量繁殖也可形成水花， 在海洋中，某些甲藻类大量繁殖也可形成水花，从而使 海水出现红色或褐色。 海水出现红色或褐色。
引起水体富营养化的藻类除通过消耗水中的氧气危害养殖 业外，很多藻类还能产生各种毒素，使动物得病或死亡， 业外，很多藻类还能产生各种毒素，使动物得病或死亡， 因此由于富营养化作用致死的鱼等水产品不能食用
由于微生物的多样性，不同的微生物往往对不同 不同的微生物往往对不同 的保藏方法有不同的适应性， 的保藏方法有不同的适应性，迄今为止尚没有一种 方法能被证明对所有的微生物均适宜。因此，在具 方法能被证明对所有的微生物均适宜 体选择保藏方法时必须对被保藏菌株的特性、保藏 物的使用特点及现有条件等进行综合考虑。对于一 些比较重要的微生物菌株，则要尽可能多的采用各 种不同的手段进行保藏，以免因某种方法的失败而 导致菌种的丧失。
微生物生态系统： 微生物生态系统： 微生物与其周围的环境（包括动植物） 微生物与其周围的环境（包括动植物）组成的具有一定 结构和功能的开放系统。在自然界的任何生境中， 结构和功能的开放系统。在自然界的任何生境中，微生物之 微生物与其它生物之间、微生物与环境之间彼此影响、 间、微生物与其它生物之间、微生物与环境之间彼此影响、 相互依存构成一个稳定的系统关系 。
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2、菌种保藏方法
1）斜面菌种低温保藏法---利用低温对微生 物生命活动有抑制作用的原理进行保藏。 把斜面菌种、固体穿刺培养物或菌悬液 等,直接放入4～5℃冰箱中。保藏时间一 般不超过3个月,到时必须进行移接传代, 再放回冰箱。
2）砂土管保藏法---将干燥砂粒与细土混合 后灭菌制成砂土管,然后接种保藏 。若把 砂土管放在低温或抽气后密封,效果更佳。 此法适用于产孢子及芽孢菌种的保藏。 保藏期1～10年 3）石蜡油封藏法---向培养好的菌种斜面上, 加入灭菌石蜡油,高出斜面1cm,然后蜡封 管口,放入冰箱。该法既可防止培养基水 分蒸发,又能使菌种与空气隔绝。保藏期 1～ 2年
美国的“美国典型菌种收藏所”(ATCC)，保藏 方式主要采用冷冻干燥和液氮超低温冻结法。
2、衰退的防止
（1）控制传代次数 （2）创造良好的培养条件 （3）利用不易衰退的细胞传代 （4）采用有效的菌种保藏方法
二、菌种的复壮
1、复壮的定义：
狭义复壮：指的是在菌种已在发生衰退的情况下，通 过纯种分离和测定典型性状，生产性能等指标，从 已衰退的群体中筛迁出少数尚未退化的个体，以达 到恢复原菌株固有的性状的相应措施。 广义的复壮：是一项积极的措施，即在菌种的典型特 征或生产性状尚未衰退前，主经常有意识地采服纯 种分离和生产性状的测定工作，以期众中选择到自 发的正变个体。
第五节 菌种的衰退、复壮和保藏
一、菌种的衰退及其防治 1、衰退：是指由于自发突变的结果，而使某种 原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。 如原有形态性状变得不典型了，生长速度变慢， 代谢产物生产能力下降，致病菌对宿主侵染力 的下降，对外界不良条件包括低温、高温或噬 菌体侵染等抵抗能力的下降等。
3、菌种保藏中心
我国由于1979年7月成立了中国微生物菌种 保藏管理委员会(CCCCM),
----普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)--中 科院微生物所,北京(AS),真菌、细菌;中科院武 汉病毒研究所,武汉(AS-IV), ----农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)---中国 农业科学院土壤肥料研究所,北京(ISF) ----工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)---轻 工业部
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
3）淘汰已衰退的个体 ----例如对“5406”放线菌的分生孢子,采 用-10～-30℃处理5～7天,其死亡率达 80%,在抗低温的存活个体中,留下了未
三、菌种的保藏 1、菌种保藏的原理
首先要挑选典型菌种的优良纯种,最好采 用它们的休 眠体(如分生孢子、芽孢等); 其次,创造一个最有利休眠的环境条件, 如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养 以及添加保护剂等。
4）真空冷冻干燥法---是目前较理想的一种 方法。在低于-15℃下,快速将细胞冻结, 并保持细胞完整,然后在真空中使水分升 华致干。在此环境中,微生物的生长和代 谢都暂时停止,不易发生变异,故可长时间 保存,一般为5～10年,最多可达15年之久。 此法兼备了低温、干燥及缺氧几方面条 件,使微生物可以保存较长时间,但手续较 麻烦,需要一定的设备。
2、复壮的方法
1）纯种分离 通过纯种分离,可把退化菌 种细胞群体中一部分仍保持原有典型性 状的单细胞分离出来,经扩大培养,就可 恢复原菌株的典型性状。常用的分离纯 化的方法有平板稀释法、单细胞或单孢 子分离法等。
2）通过寄主体进行复壮 ----对于寄生性的退化菌株,可回接到相 应寄主体上,以恢复或 提高其寄 生性能。 例如,根瘤菌属经人工移接,结瘤固氮能 力减退,将其回接到相应豆科寄主植物上, 令 其侵染结瘤,再从根瘤中分离出根瘤 菌,其结瘤固氮性能就可恢复甚至提高。
----工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)---轻 工业部食品发酵工业科学研究所, 南京(ID),真 菌;卫生部药品生物制品检定所,北京(NICPBP), 细菌；中国医学科学院病毒研究所,北京(IV), 病毒。/ ----抗菌素菌种保藏管理中心(CACC)---中国医 学科学院抗菌素研究所北京(IA)；四川抗菌素 工业研究所,成都(SIA),新抗菌素菌种;华北制 药厂抗菌素研究所,石家庄(IANP),生产用抗菌 ----兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)农业 部兽医药品监察所,北京(CIVBP) 。