植酸酶活性测定应注意的几个问题

植酸酶活性测定的影响因素

北京昕大洋科技发展有限公司周良娟

现在，使用植酸酶的厂家越来越多，但一些使用厂家在测定含量时，容易出现测定偏差大，平行样间变异大的情况，这与植酸酶测定步骤繁多，测定条件严格有紧密的关系。现在对影响其测定的关键过程做一探讨。

1 温度

植酸酶作为一种酶制剂，对温度非常敏感，温度低会降低它的生物活性；温度高也会降低其生物活性，甚至完全失活。因此，在检测过程中对温度的控制则显得非常重要，国标要求植酸酶活性测定时的温度为（37±0.1）℃。在33℃时植酸酶不能很好地发挥其活性，酶活与其真实值相比约低10%；在40℃时，部分植酸酶会失活，酶活与其真实值相比约低8%。另外，水浴加热时，水浴液面要超过试管内反应液液面，使其在规定时间内充分反应。

2 溶解度

植酸酶测定中要保证植酸酶被完全溶解。在样品处理中使用乙酸缓冲液，一般都会加入一些表面活性剂保证其溶解，并降低在所用容量瓶、试管中的黏附挂壁现象。目前大肠杆菌来源的植酸酶分子量较小，约为40KD，比黑曲霉来源的分子量（约为8OKD）小，所以更容易出现黏附挂壁现象。表面活性剂的类型较多，包括Tween ，Triton 等产品，尤其是Triton ×-100能够明显减少黏附挂壁现象，是植酸酶测定中比较理想的活性剂。

植酸酶在测定过程中被溶解之后，非常容易受测定过程中搅拌、离心等过程影响，牛血清白蛋白（BSA）是酶制剂良好的稳定剂，保证测定的准确性。

3 样品处理中的搅拌过程

样品处理中的搅拌过程是为了保证植酸酶的充分溶出，搅拌过程一般使用磁力搅拌器来进行，如简单使用玻璃棒人工搅拌，溶出不完全，偏差甚至达到50%。同时，搅拌时，尽量保证较高的搅拌速度。

4 pH

pH值在酶活测定时影响很大，除了准确调整缓冲液中的PH外，特别要注意在配置底物溶液时也要进行调整。根据本实验室的测定，如果底物配制过程没有调酸度4，pH一般为6.1-6.4，距离规定的pH条件较远，而植酸酶测定中pH影响较大，将无法保证测定的准确性。

5 底物植酸钠的型号

植酸钠有两种型号，一种是Sigma p-3168或Sigma p-0109，分子量为923.8；另一种是Sigma p-8810，分子量为660.03。根据国标要求，植酸

钠应为Sigma p-3168或Sigma p-0109，笔者在实验中发现Sigma p-3168或Sigma p-0109植酸钠底色浅，且作磷标准曲线时梯度较好（见表1、表2）。

由表1、表2可以看出检测植酸酶活性时用Sigma p-3168为反应底物较好。

6 离心速度和时间

当水浴30min终止酶解反应后，需要进行离心。国标要求4 000r/min，离心10min。若以3 000r/min离心10min，则离心不彻底，测吸光度时发现标准曲线吸光度不呈梯度；以5 000r/min离心10min时，发现标准曲线各梯度的吸光度与以4 000r/min离心10min时相比偏低。如果应用国标改进法，乙酸缓冲液中加入了牛血清白蛋白，离心时间需要15min。有实验表明，用国标改进法进行了时间对比实验，测定酶活时离心10min和15min后样品的吸光度（见表3）。

由表3可见，离心时间对测定结果影响很大。

7 公式换算

在整个实验过程中即使做得再成功，若公式换算出错，将会前功尽弃。植酸酶绝对法测定酶活时，计算公式如下：

植酸酶活性（U/g）= (C×F/m×30)

式中：C——根据实际样液的吸光值由曲线回归方程计算出的y值（U）；

F——试样溶液反应前的总稀释倍数；

m——试样质量（g）；

30——反应时间（min）。

其中F所代表的总稀释倍数换算时容易出现错误，现在我们举例说明：称取500IU植酸酶1.000 0g，用乙酸缓冲液溶解并稀释定容至100ml，从其中取出1ml继续稀释至12.5ml，稀释倍数为1 250；若称取1 000IU植酸酶0.500

0g，用上述方法进行稀释，则稀释倍数为2 500，计算时若写成C × 2

500/0.500 0× 30则错误，这样就多乘了2倍。应写成C × 1 250/0.500 0×30，这是在公式换算时应注意的问题。