福林-酚测定蛋白质

应用生化设计实验论文

学院：漓江学院

专业：生物技术

组员： 吴玉芳 200913007010

陆艺中 200913007009

指导老师:刘晓灿

2011年10月23日

广西师范大学

福林-酚试剂法测定鸡蛋中的酪蛋白含量

吴玉芳,陆艺中

摘要:本实验采用福林-酚试剂分光光度法测定鸡蛋中酪蛋白的含量。试样用PH4.6乙酸钠缓冲液0.2mol/L将酪蛋白从鸡蛋细胞破碎液中分离出来,用体积比为1:1的乙醇、乙醚混合液提取,再用95%乙醇来将酪蛋白粗制品中的脂类杂质除去,在表面皿上摊开除去乙醚后即为酪蛋白纯品。将酩蛋白纯品溶于蒸馏水后,取1ml样液先加入试剂甲，混合后于室温下放置10min，再加入试剂乙，混匀。室温下反应30min，于500nm波长下测定其密度。以牛血清蛋白标准溶液(250ug/ml)为标样,取6支试管将其进行梯度稀释后,各加入5ml试剂甲，混合后于室温下放置10min，再加入试剂乙，混匀。室温下反应30min，于500nm波长下测定其密度，以OD500为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制标准曲线,得曲线方程为y=0.2x+0.233。从标准曲线查出1ml样品酪蛋白的含量为2.185mg。计算出每100g鸡蛋中酪蛋白含量为43.70mg，从而对人体营养摄取进行指导。

关键词:酪蛋白、定量测定、福林酚试剂法、深蓝色复合物、标准曲线

福林—酚试剂法最早是由Lowry确定的测定蛋白质浓度的基本方法。此后在生物化学领域得到广泛的应用。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即福林—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。福林—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。

酪蛋白目前主要作为食品原料或微生物培养基使用，利用蛋白质酶促水解技术制得的酪蛋白磷酸肽具有防止矿物质流失、预防龋齿，防治骨质疏松与佝偻病，促进动物体外受精，调节血压，治疗缺铁性贫血、缺镁性神经炎等多种生理功效，尤其是其促进常量元素与微量元素高效吸收的功能特性使其具有“矿物质载体”的美誉，它可以和金属离子，特别是钙离子结合形成可溶性复合物，一方面有效避免了钙在小肠中性或微碱性环境中形成沉淀，另一方面还可在没有VD 参与的条件下使钙被肠壁细胞吸收。［1］

酪蛋白在其等电点时由于静电荷为零，同种电荷间的排弃作用消失，溶解度很低，利用这一特性，将过滤得到的滤液调到PH4.6，酪蛋白就能从滤液中分离出来。

酪蛋白由于与脂质结合比较牢固，难溶于水，稀盐溶液，稀酸溶液中，因此必须有机溶剂提取，酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制品中将脂类杂质除去。［2］

蛋白质与福林-酚试剂反应，生成深蓝色复合物，蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用分光光度计与500mm波长下进行测定，与标准曲线对照，而确定蛋白质含量。

1 材料与试剂，仪器：

1.1 原材料:市场销售的鸡蛋

1.2 试剂

2.95%乙醇、乙醚,

PH4.6乙酸钠缓冲液0.2mol/L,

乙醇、乙醚混合液:乙醇:乙醚=1：1(体积比)

牛血清蛋白标准溶液(250ug/ml):称取0.0025g加蒸馏水配置成10ml。

福林-酚试剂甲：吸取试剂A（0.2mol/L NAOH溶液与4%无水碳酸钠溶液等

体积混合）100ml，加试剂B（2%酒石碳酸钠溶液与1% CuSO4.5H2O溶液等体积

混合）2ml，混合而成。

福林-酚试剂乙：吸取5ml苯酚试剂加入5ml蒸馏水稀释而成。

1.3 仪器:

匀浆器，滤纸，布氏漏斗，玻璃棒，烧杯，PH试纸，抽滤瓶,量筒,表面皿,

电子天平,恒温水浴槽,分光光度计，电炉,纱布。

2 方法和过程

2.1 组织细胞破碎

将100g鸡蛋捣碎成糊状置于匀浆器内，再套入研杆用手工来回研磨，或把

研杆连接在电动搅拌器上，用手握住管，上下移动，即可将组织细胞破碎。

2.2 酪蛋白等电点沉淀

将上述细胞破碎液放到500ml烧杯中，加热至40℃左右的乙酸钠溶液中，

直到PH4.6。将上述悬浮液冷却至室温，然后放置5min，用纱布过滤，收集沉淀。2.3 除脂类杂质

将上述沉淀用少量水洗数次，然后悬浮于30ml 95%乙醇中，将此悬浮液放

于布氏漏斗中，抽滤除去乙醇溶液，再倒入乙醇乙醚混合液洗涤沉淀两次，最后

再用乙醚洗涤沉淀两次，抽干，将沉淀从布氏漏斗中移去，在表面皿上摊开以除

去乙醚，干燥后得到的是酪蛋白纯品。

2.4 标准曲线的制作

分别吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0,ml标准牛血清溶液于小试管中，分

别加入不同量的蒸馏水，补足到1ml，各加入5ml试剂甲，混合后于室温下放置

10min，再加入0.5ml试剂乙，混匀。室温下反应30min，于500nm波长下测定

其密度，以OD500为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制标准曲线。

2.5 样品蛋白质含量的测定

取第四步干燥后的蛋白质纯品加蒸馏水溶解,定容至20ml,吸取1.0ml样液

于小试管中,加入5ml试剂甲，混匀，于25℃放置10分钟，再加入0.5ml试剂乙，立即混匀，于25℃下反应30min，测定OD500。从标准曲线查处样品酪蛋白

的含量。

2.6 计算100g鸡蛋中酪蛋白的含量为多少克

3 实验结果

根据标准曲线（如图1）,得知标准曲线方程为y=0.2x+0.233 1ml样品蛋白质反应液的吸光值为1.981,那么,l.981=0.2x+0.233

得x=8.74(ml)

则1ml样液中的蛋白质含量为8.74(ml)x0.25(mg/ml)=2.185(mg) 那么总共的20ml待测样品蛋白液的酪蛋白含量为20mlx2.185mg/ml=43.7mg 即100g鸡蛋酪蛋白的含量为47.30克

（注：图1上方的表格数据为图2从左边起各管标准液依次对应的吸光值，