常用诱变育种技术在我国真菌育种上的应用_马少丽

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青海畜牧兽医杂志2014年第44卷第1期（总第229期）

常用诱变育种技术在我国真菌育种上的应用*

马少丽，刘欣

（青海省畜牧兽医科学院，西宁，810016）

中图分类号：S813．8文献标识码：A文章编号：1003-7950（2014）01-0042-03

自然选育是获得优良菌株最基本的方法，从自发突变的菌株中选择优良菌株，这种方法被一直沿用下来，由于自发突变率较低，要从自然界筛选到理想的菌株，需要很长的时间，花费很大的人力财力，在科技飞速发展的今天已经满足不了需要。诱变育种则补充了自然选育的不足，能够在较短的时间内，通过改变微生物的遗传特性，获得能够满足需要的理想菌株。

真菌诱变育种，是以人工诱变手段诱发真菌基因突变，改变遗传结构和功能，通过筛选分离，从众多的变异株中挑选出产量提高、性状优良的品系。以人工诱变为基础的真菌诱变育种，具有速度快、收效大、方法简便等优点，是菌种选育的一个重要途径，常用的诱变方法根据诱变剂的不同可分为化学诱变、物理诱变和复合诱变〔1〕。

1化学诱变方法

1．1烷化剂烷化剂是最有效、也是用得最广泛的化学诱变剂之一。这类诱变剂具有一个或多个活性烷基，烷化剂基团会使DNA分子上的碱基及磷酸部分被烷化，DNA复制时导致配对错误而引起突变。依靠NTG诱发的突变主要是GC－AT转换，另外还有小范围切除、移码突变及GC对的缺失〔2〕。常用的烷化剂有亚硝基胍（NTG）、乙基硫酸甲烷（又称甲基磺酸乙酯，简称EMS）、硫酸二乙酯（DES）、乙烯亚胺等。王璋等〔3〕使用亚硝基胍处理萌发状态的链霉菌WZFF 孢子悬浮液，结果得到1株转谷氨酰胺酶活比出发菌株提高1．2倍的突变菌株。徐同宝等〔4〕以黑曲霉XE6为出发菌株，经微波（MW）和硫酸二乙酯（DES）诱变处理，选育出一株遗传性状稳定的高产木聚糖酶菌株mAn1。所产木聚糖酶的酶活为81151U/g，比出发菌株的酶活60165U/g提高了34．88%。

1．2碱基类似物这类诱变剂主要是在微生物细胞处于代谢旺盛时期时掺入到DNA分子中，并在DNA 进行复制时由于本身分子结构式产生酮式→烯醇式变化而引起变异。碱基类似物是一类与天然的嘧啶嘌呤等4种碱基分子结构相似的物质，是1种既能诱发正向突变，又能诱发回复突变的诱变剂。对于处在静止或休眠状态的细胞不适合。用于诱发突变的碱基类似物有5－氟尿嘧啶（5－FU）、5－溴尿嘧啶（5－BU）、5－碘尿嘧啶（5－IU）、2－氨基嘌呤（AP）、6－巯基嘌呤（6－MP）等。程世清等〔5〕用5－氟尿嘧啶（5－BU）对产色素菌（分歧杆菌T17－2－39）细胞和原生质体进行诱变，生物量分别平均提高22．5%和16．4%。1．3移码突变剂移码诱变剂与DNA结合后，引起碱基增添或者缺失，在DNA复制时造成点突变以后的所有碱基都往后或往前移动，引起全体三联密码转录、翻译错误而引起菌种性状的变异。这类化合物的平面三环结构可插入DNA双螺旋的临近碱基对之间，使DNA链拉长，2个碱基间距离拉宽，造成DNA链上碱基的添加或缺失，从而造成碱基突变点之后的全部遗传密码转录和翻译错误。移码突变剂主要包括吖啶橙、吖啶黄、原黄素（2，8－二氨基吖啶）、ICＲ－171、ICＲ－191等化合物。王世梅等〔6〕通过吖啶橙对阿扎霉素B产生菌NND－52菌株进行诱变处理，筛选到1株突变菌株，其产量达到了1100mg/mL，比出发菌株提高3倍以上，且传代稳定。

1．4其他化学诱变剂还有一些其他的化学诱变剂，如脱氨剂、羟化剂、金属盐类、秋水仙素和抗生素等。脱氨剂可直接作用于正在复制或未复制的DNA分子，脱去碱基中的氨基变成酮基，改变碱基氢键的电位，引起转换而发生变异。羟化剂具有特异诱变效应，专一地诱发G：C→A：T的转换。用于诱变处理的金属诱变剂主要与其他诱变剂复合处理，如氯化锂（LiCl）又称为助诱变剂。秋水仙素是诱发细胞染色体多倍体的诱变剂。抗生素一般也与其他诱变剂复合使用。李春丽等〔7〕利用秋水仙素染色体加倍技术构建的纯合的二倍体糖基化酵母，糖基化酶活性比其单倍体亲株有不同程度的提高，幅度在17% 244%。白先放等〔8〕用亚硝酸诱变选育黄原胶高产菌株，筛选得到1株黄原胶高产突变株S－126菌株，其黄原胶产胶率为2．35g/L，产胶率比出发菌株提高了9．3%。

化学诱变剂在真菌育种中的应用较多，其诱变效果较为理想。但因化学诱变剂对人体的致畸致癌作用，实际应用中也受到一定的限制。

2物理诱变方法

2．1紫外线紫外诱变技术是诱变优良菌株的常规育种方法。由于其设备简单，诱变效率高，操作安全简便等特点而被广泛应用。DNA和ＲNA的嘌呤和嘧啶有很强的紫外光吸收能力，最大的吸收峰在260nm，因此在260nm的紫外辐射是最有效的致死剂。紫外线被吸收后引起突变的原因一般认为：DNA与蛋白质交联〔9〕；胞嘧啶与尿嘧啶之间的水合作用；DNA分子内或分子间发生交联反应，使DNA分子中相邻的嘧啶碱基形成嘧啶二聚体，二聚体的出现会引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而引起突变或死亡，同时二聚体的形成还会妨碍双链的解开，因而影响DNA的正常复制和转录，从而使子代DNA形成缺口，

*收稿日期：2013-12-20

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碱基错误插入该缺口，造成新链的碱基序列与母链不同而引起突变。紫外辐射还可以引起转换、颠换、移码突变或缺失等〔10〕。石一珺等〔11〕采用紫外线2次复合诱变处理内生真菌哈茨木霉，获得了突变株UV－5－3，大大提高了原始菌株发酵液的活性。崔培梧〔12〕等采用紫外线对野生型柚苷酶产生菌青霉P－M1进行诱变处理，筛选出一株较理想的柚苷酶高产菌株青霉PU－15，酶活达到334．3U/mL，比出发菌株提高了137．4%，连续传代10次测定遗传稳定性结果显示稳定性良好。

2．2快中子、χ射线、γ射线快中子、χ射线、γ射线都是高能电磁波，具有很强的穿透能力，只要强度适当可以使真菌分子发生电离，从而使生物体遭受破坏性损伤，直接或间接地改变DNA结构。直接作用是物理作用，指染色体吸收辐射能量后发生畸变；间接作用是电离辐射使水或有机分子产生自由基，这些自由基与细胞中的溶质分子起作用，发生化学变化，作用于DNA引起缺失和损伤而引发突变〔13〕。蒋世春等〔14〕将抗肿瘤抗生素柔红霉素产生菌———天兰淡红链霉菌激光株经N+等离子体诱变处理后再经摇瓶筛选，获得1株高产柔红霉素突变株，其柔红霉素效价较亲株提高了25．8%。杜润泮等〔15〕用快中子对灰色链霉菌进行诱变，得到链霉素产量提高26．7%的高产菌株。刘健等〔16〕以耐酒精高活性干酵母为原始出发菌株进行60Co－γ辐射诱变处理，经逐级筛选确定了最佳诱变菌种H13，其乙醇得率为4．23g/100g鲜秸秆，较原始菌株提高了19．5%，乙醇转化率为51%。

2．3激光激光是一种光量子流，又称光微粒。其生物学的效应是光、电、热、压力和磁效应的综合作用〔17〕。各效应的累积使细胞DNA分子吸收、聚积能量并进行能量再分配，使细胞DNA处于一种易于突变的状态，继而发生一系列的诸如断键、聚合、交联等物理和化学变化，导致DNA分子的损伤和突变，最终引起突变株这样的生物学属性变化〔18〕。如果是控制某种代谢途径的酶系基因水平上的改变，则有可能增加某一特定代谢产物的积累〔19〕。相对于传统的紫外诱变技术，激光诱变具有高效、稳定、高选择性、回复突变率低、定向变异率高、辐射损伤轻、当代变异、无污染等优点。郭爱莲等〔20〕采用He－Ne激光技术对白腐真菌L1原生质体诱变，选育出一株木质素降解率达43．03%的菌株Lx，比出发菌株L1提高了50%。孙毅〔21〕利用激光技术进行纤维素酶产生菌绿色木霉的育种研究，选育出的菌株酶活提高了103．2%。

2．4微波微波作为一种高频电磁波，能刺激水、蛋白质、核普酸、脂肪和碳水化合物等极性分子快速震动。在2450MHz频率作用下，水分子能在1s内来回震动24．5ˑ108次。这种震动能引起摩擦，因此可以使得单孢子悬液内DNA分子间强烈摩擦，孢内DNA 分子氢键和碱基堆积化学力受损，使得DNA结构发生变化，从而发生遗传变异。微波具有传导作用和极强的穿透力，在引起细胞壁分子间强烈震动和摩擦时，改变其通透性，使细胞内含物迅速向胞外渗透〔22〕。但是微波辐射直接作用于微生物DNA引起变异，还是其穿透力使细胞壁通透性增加，导致核质变换而引起突变，目前尚不明了，有待进一步研究。李永泉〔23〕采用微波辐照，对黑曲霉聚糖酶产生菌进行诱变处理，结果选育到1株产量较高的生产菌A．nigerHD－3．6，发酵单位从15000U/mL提高到21500U/mL，提高了43．3%。朱传合等〔24〕利用微波诱变阿维拉霉素产生菌SV获得1株阿拉维霉素诱变株SV－15，其产量达到21．5mg/L，较出发菌株提高119．4%。

2．5离子注入离子注入方法是利用离子注入设备产生高能离子束（40 60kev）并注入生物体引起遗传物质的永久改变。离子注入诱变育种的特点，表明其是一种集化学诱变、物理诱变为一体的综合诱变方法〔25〕。但是生物效应是个连续变化的过程，很难截然分开，离子注入的同时向受照射机体内输入能量、离子和电荷，其原初过程极为复杂且有特异性〔26〕。离子注入对生物体的作用是集动量传递、能量、质量沉积和电荷的中和与交换于一体的联合作用的观点〔27，28〕。能量沉积是注入的离子与生物体大分子发生一系列碰撞并逐步失去能量，而生物大分子逐步获得能量进而发生断键、原子被击出位、生物大分子留下断键或缺陷的过程，动量传递会在分子中产生级联损伤，电荷交换会引起生物分子电子转移造成损伤，从而使生物体死亡、自由基间接损伤、染色体重复、易位、倒位或使DNA分子断裂、碱基缺失等生物学效应〔29 31〕。袁仲等〔32〕采用10Kev低能N+注入啤酒酵母，经筛选获得一菌株Lz37，其凝聚性很强（本斯值1．4/ml），适合于在小麦汁中发酵啤酒，其发酵度为66% 68%，双乙酰含量低于口味阀值，遗传稳定性良好。

2．6空间诱变自空间探索以来，人们一直致力于研究空间特殊环境中，诸如微重力、高能粒子辐射等诱变因素对微生物的复合影响，其中微重力和空间辐射是主要的诱变因素。在空间特殊条件中，微生物的变异频率较高。DNA和生物膜是射线作用的靶子，DNA 结构的损伤主要有单、双链断裂，碱基和糖的损伤，DNA与DNA、DNA与蛋白质交联等。其中单、双链断裂较多见，富含胸腺嘧啶的区域最易受到破坏。膜损伤有膜结构的改变、膜结合酶活性和膜受体功能降低等〔33〕。白骅等〔34〕通过空间诱变选育毒三素链霉菌，正变率达到39%，产量提高19．2%。王璋等〔35〕利用“神舟”4号无人飞船搭载生产微生物转谷氨酰胺酶的链霉菌进行空间诱变，得到1株高产酶菌株，酶活性提高了40%以上，达到3．62U/mL。

利用物理诱变技术筛选高效菌株，提高菌株的产量和质量，已被证明有广阔应用前景。但物理诱变技术也存在着无法控制诱变方向、工作量大、诱变产物安全性不确定等问题。如何克服其缺点，发挥其优势，将是微生物学工作者的努力方向。

3复合因子诱变方法

复合因子诱变是指采用两种以上诱变因子共同起作用来诱发菌体突变。由于不同的诱变因子的作用机理不同且不同诱变剂具有各自的特异性作用位点，这些诱变技术单独使用时效果不甚理想，但与其他诱变源相结合，则能起到很好的诱变效果。因此，在诱变育