核酸提取经验及原理总结

核酸纯化-核酸的浓缩
• 应用最广的核酸浓缩法是乙醇沉淀法。 在中等浓度单价阳离子存在下，加入一 定量的乙醇后，所形成有核酸沉淀可经 离心而回收，甚至对低至pg量的DNA或 RNA，也可定量回收。回收的核酸可按 所需浓度，再溶于适当的缓冲液中。
核酸质量的检测问题
• 关于紫外分光光度仪的检测 • 关于电泳检测
细胞裂解-样品与裂解液的比例
• 裂解液的用量原则是：确保能彻底裂解 样品，同时使裂解体系中核酸的浓度适 中。浓度过低，将导致沉淀效率低，影 响得率；浓度过高，去除杂质的过程复 杂且不彻底，导致纯度下降。另外，裂 解液的用量是以样品中蛋白质的含量为 基准的，而不是以核酸含量为基准，这 一点务必牢记。
核酸中杂质的去除
• • • • 肝糖元、淀粉及粘多糖 蛋白质的除去 不同类型核酸的分离 同类核酸的分离
核酸中除杂质-肝糖元、淀粉及粘多糖
• ①取材前尽量减少组织中多糖的含量，如先使 动物饥饿数天然后杀死，可使细胞内肝糖元大 大减少。②加入淀粉酶，将大分子多糖分解为 小分子，在以后纯化步骤中逐渐被除去。③在 浓磷酸盐存在下，以2-甲氧基乙醇抽提核酸提 取液，使多糖溶于下层水相，核酸在上面有机 层中。④以钙盐沉淀DNA，再以草酸钾处理， 使之形成DNA钾盐回收，然后用离子交换法吸 附DNA，使之与多糖分离。
核酸纯化-核酸的溶解
• 其中 RNA 以水为主，DNA 则多以弱碱 性的 Tris 或者 TE 溶解。
核酸纯化-核酸保存
• 核酸在保存中的稳定性，与温度成反比， 与浓度成正比。一般的我们选择，-20℃ 或70℃ 保存的稳定。如果温度不合适， 保存中核酸发生降解或者消失，首要原 因是酶残留导致的酶解，第二个原因则 是保存核酸溶液的 pH 值不合适导致的水 解 。还有一个不为人重视的，就是 EP 管对核酸的影响。
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细胞裂解-细胞的裂解方法
• • • •
机械方法 化学试剂法 反复冻融法 酶解法
细胞裂解-裂解方法的评价
• 含蛋白酶的裂解方法，可以认为是抽提基因组 DNA 的首选 。 • 高浓度蛋白质变性剂 (如 GIT、GuHCl 等) 的裂 解方法，是抽提 RNA 的首选 。 • 含 CTAB 的裂解液，几乎成为富含多糖的样品， 如细菌、植物的基因组 DNA 抽提的首选裂解 方法。 • SDS 碱裂解法是质粒抽提的首选裂解方法，具 有快速、得率高、几乎无基因组 DNA 污染的 特点。
核酸中除杂质-不同类型核酸的分离
• 在RNA制品中除去DNA，苯酚水溶液抽提 是较有效和常用的方法 。 • 在DNA中加核糖核酸酸酶选择地破坏RNA， 是除RNA比较有效的方法 。
核酸中除杂质-同类核酸的分离
• DNA混合物的分离：主要是变性或降解 的DNA和天然的分离。 • RNA混合物的分离经过提取的初步纯化 的RNA制品中含有各类RNA和某些已降 解的RNA混杂物。进一步纯化时，多应 用柱层析、梯度离心及逆流分溶等方法。
关于紫外分光光度仪的检测
• 在核酸分子中，由 于嘌呤碱和嘧啶碱 具有共轭双键体系， 因而具有独特的紫 外线吸收光谱，一 般在260nm左右有 最大吸收峰，可以 作为核酸及其组份 定性和定量测定的 依据。
关于电泳检测
• 观察琼脂凝胶中DNA的 最简单方法是利用荧光 染料溴化乙锭进行染色。 该物质含有一个可以嵌 入DNA的堆积碱基之间 的一个平面基团，这个 基团的固定位置及其与 碱基的密切接近，导致 染料与DNA结合并呈现 荧光，其荧光产率比游 离染料溶液有所增加。
脱氧核糖核酸（DNA）
DNA分子含有生物物 种的所有遗传信息， 分子量一般都很大 （除RNA病毒外）。 DNA为双链分子，其 中大多数是链状结构 大分子，也有少部分 呈环状结构。
核糖核酸（RNA）
RNA主要是负责DNA遗传信息 的翻译和表达，分子量要比 DNA小得多。RNA为单链分子， 根据RNA的功能，可以分为三 种： 信使核糖核酸（mRNA）； 转运核糖核酸（tRNA）； 核蛋白体核糖核酸（rRNA）。
• • • • 裂解原理 细胞的裂解方法 裂解方法的评价 样品与裂解液的比例
细胞裂解-裂解原理
• 经典的裂解液几乎都含有去污剂 和盐 。盐的 作用，除了提供一个合适的裂解环境 ，还包括 抑制样品中的核酸酶在裂解过程中对核酸的破 坏 、维持核酸结构的稳定 等。去污剂则是通 过使蛋白质变性，破坏膜结构及解开与核酸相 连接的蛋白质，从而实现核酸游离在裂解体系 中。裂解体系中还可能加入蛋白酶，利用蛋白 酶将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白 质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及 获得更纯的核酸。
核酸纯化-纯化方法评价
• 针对不同的用途，选择不同的纯化方法， 任何一种方法他都有其优缺点，在试验 中，没有错误的方法，只是选择的方法 不正确。
核酸纯化-醇的沉淀
• 沉淀的原理目的 • 沉淀剂的选择 • 沉淀温度的选择
核酸纯化-醇的沉淀-目的
• 目的是使核酸从裂解体系中沉淀下来， 从而实现核酸与其它杂质–主要是盐的分 离。
核酸的理化性质
• RNA的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA 则为白色类似石棉样的纤维状物。 DNA、 RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都 溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂， 它们的钠盐比游离核酸易溶于水，RNA 钠盐在水中溶解度可达40g/L，DNA钠盐 在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。
细胞裂解
核酸提取
• 提取是使样品中的核酸游离在裂解体系 中的过程。
DNA提取的几种方法
• • • • 1 浓盐法 2 阴离子去污剂法 4 水抽提法 3 苯酚抽提法
RNA提取
• 总RNA的试剂盒快速提取 • 蛋白酶－热酚法 • 氯化锂法提取总RNA
核酸纯化-方法
• • • • 经典的使用苯酚/氯仿抽提的纯化技术 使用离子交换介质的纯化技术 密度梯度离心法 使用吸附介质的纯化技术
核酸中除杂质-蛋白质的除去
• ①加入去污剂如硫酸十二脂钠，从提取到分离 纯化各阶段均可反复使用此法。去污剂与氯仿 法或苯酚法结合使用，效果更加理想。②氯仿戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提，蛋白质在氯仿水界面形成凝胶，离心后除去，核酸留在水溶 液中。此法在分离纯化中也常反复使用。③苯 酚水溶液抽提，在对氨基水杨酸等阴离子化合 物存在下，DNA或RNA都可以进入水相，蛋白 质则沉淀于酚层，然后取水相加入乙醇或2-乙 氧基乙醇沉淀RNA或DNA，残余的酚可用葡聚 糖凝胶G-10或G-25除去。
核酸提取经验及Βιβλιοθήκη Baidu理总结
主办单位：螺旋网 主讲人：wsuquan 时 间：2008.4.21
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主要内容
• 一、核酸的发现 、核酸的分类和功能 、 核酸的理化性质 • 二、细胞裂解 • 三、核酸提取 • 四、核酸纯化 • 五、核酸检测 • 六、核酸除杂质
核酸的发现 核酸是1869年米 歇尔(F.Miescher)在脓液 的白细胞中发现的，他 当时称之为核素。阿尔 特曼(R.Altmann)于1889年 认识其酸性后，定名为核 酸。核酸分为核糖核酸 (RNA)和脱氧核糖核酸 (DNA)两大类。
核酸纯化-醇的沉淀-温度
• 如果核酸抽提的起始样品是杂质比较多 时，原则上不要使用低温沉淀。低温沉 淀能提高沉淀效率：当核酸浓度很低时， 效果明显；当核酸浓度比较高时，效果 不明显，但却会导致杂质的大大增加。
核酸纯化-核酸的洗涤
洗涤目的方法 • 首先一定要将沉淀悬浮起来； • 第二就是要控制一定的时间，尤其是当 核酸沉淀比较大时 (使核酸沉淀最终蓬 松)； • 第三是少量多次； • 第四则是去上清要彻底。
核酸纯化-醇的沉淀-沉淀剂
• 醇沉淀使用异丙醇还是乙醇，我们没有发现这 二者对质量有大的影响，虽然许多人“发现” 乙醇沉淀的核酸纯度更高。异丙醇沉淀的核酸 比较紧凑，帖壁紧，颜色不是很白；乙醇沉淀 的核酸比较蓬松，容易从壁上移动，颜色比较 白。这是现象，提示结论：异丙醇沉淀的核酸 不容易丢掉，但比较难洗涤。因此，少量核酸 用异丙醇沉淀 ，大量核酸用乙醇沉淀 。