分子细胞遗传学诊断技术简介[1]

项目概述
产前诊断是避免异常患儿出生的的重要技术 手段。传统的核型分析方法是国内外公认诊断染 色体病的金标准。然而,标准的核型分析必须对细 胞经过数天培养，耗时过长，操作复杂。FISH 解 除了传统细胞学的限制，能够在短至24小时的时 间排除占活婴染色体异常的95%的五种常见异常， 对于检查者无疑是一大福音。

Targeted aCGH
对已知病症提供清晰的 信号


Whole genome aCGH



避免实验室反复用FISH 方法来进行实验诊断 结果易懂 将错失不覆盖区域的基因 缺失和增加 如果病人有明显的综合病 症，染色体分析或FISH 可能更适合


广泛覆盖基因，1MB分 辨率 发现新易感基因 更多的噪信号 数据难以解释和理解
技术方法
检测DiGeorge/VCFS综合征需要22号长 臂上的一组探针，分别为GLP TUPLE1和 GLP ARSA。 该方法只能检测出DiGeorge/VCFS综合 征最常见的缺失，对于少数患者发生其 他缺失或易位不能检出。
应用范围及意义



通过羊水检测判断胎儿发生先心病的情 况。 检测患有先心病的新生儿及儿童，明确 病因。 生育过先天性心脏病患儿父母进行检测， 可以预测下一胎儿患先心病的可能性。

禁忌症

对于一条染色体中发生的倒位、重复、 缺失，因无色彩的变化，SKY不能直接检 出；
不能精确判断染色体畸变的断裂点（即 区带）；

光谱核型分析技术 （spectral karyotyping, SKY）
基本原理 用5种不同的荧光素或其 组合标记出不同的24种人类染色体 涂染探针，然后将不同标记的24种 探针同时与中期染色体进行原位抑 制杂交。通过Fourier分光镜、CCD 成像和光学显微镜捕捉和测量所有 染料被激发后产生的发射光谱，按 照一种光谱分类算法将一特定的分 类色（假颜色）分配到所有的人类 染色体上，然后通过计算机成像软 件分析，使不同的染色体显示出不 同的假颜色，从而进行核型分析 。
a CGH 优越性：
一种极高的分辨率的染色体分 析方法，提供G-带分型不可能的 结果

提供客观和自动分析的结果
DiGeorge/VCFS综合征

DiGeorge 综合征或 Velocardiofacial（VCFS) 综合征，是由于22号染色体长臂近着丝粒端微片 段缺失引起的遗传综合征。 在活产胎儿儿中发生率约1/4 000，是造成小儿 先天性心脏病最常见的单一基因因素。 群体检测证实近90％DiGeorge综合症病人和约85 ％VCFS综合症病人存在22q11微缺失。
靶向芯片的临床应用

在实际的临床分子细胞遗传学领域中， 靶向微阵列最受欢迎，因为它基本涵盖 基因组中所有已知的重大临床意义的特 定区域，在应用中可以达到最佳的平衡： 最大限度地检测与临床有关的染色体不 平衡异常，又能够尽可能地减少涵盖人 类基因组中多态性拷贝数变异（CNVs） 的数量。
靶向芯片可检测40几种微缺失综合征
光谱核型分析技术检测染色体异常
项目概述
染色体畸变80%为染色体数目异常，其次 为染色体结构重排、丢失、重复、平衡或非 平衡易位、嵌合体、标记染色体等。染色体 病患者大多有严重的智力障碍、生长发育迟 缓和某些组织器官畸形等，同时染色体畸变 也是导致妊娠早期自然流产和不孕不育的重 要原因，且目前尚无有效地治疗方案。准确 地对染色体病进行诊断和产前诊断，有利于 控制出生缺陷，指导遗传咨询和评估预后。
aCGH快速检测间期细胞全基因 组拷贝数
21世纪细胞遗传学的革命 – aCGH
简称：aCGH
英文名：array-comparative genomic hybridization； Microarray based Comparative Genomic Hybridization ） 中文名：微阵列 - 比较基因组杂交
项目概述
此外，该综合征还经常合并智力障碍及认 知功能障碍和精神行为异常，严重影响生活 质量，给社会和家庭造成的经济和精神损失 是巨大的。为此常推荐终止妊娠。进行22q11 微缺失检测，可以帮助准确产前咨询，为孕 妇决定终止妊娠提供全面充分的证据。目前 国外此项检查常规开展，国内也有部分单位 已经开展。
技术优势

重复性好、稳定； 高灵敏性及特异性； 可用于间期细胞，不需要细胞培养； 目前，FISH已成为一种常见检测手段，国外 广泛地用于产前、产后遗传病诊断及血液肿瘤、 实体瘤等方面的检测。在欧美发达国家应用 FISH产前诊断检测染色体异常占30-40%。
技术原理与方法
产前诊断检测非整倍体需要21、13、 18、X和Y染色体上的五种探针。其中21 号和13号染色体检测探针列为一组，为 位点特异探针，分别用Rhodamine (红色 和FITC (绿色)标记。18号、X和Y染色体 探针列为一组，为染色体着丝粒特异性 重复序列探针,分别用DEAC(蓝色) FITC (绿色)和Rhodamine (红色)标记。
检测正常结果
异常结果
21三体
18三体
技术难点
试剂的离子成分和PH值对杂交的好坏 有直接的影响。因而在实验的试剂配臵 准备过程中要注意使用超纯水进行配臵， 同时配好的试剂要使用PH试纸或PH仪校 准。 细胞质较多时也会引起杂交率低下， 信号弱，因而在实验操作时应特别注意 消化时间的掌握。
荧光原位杂交技术检测 DiGeorge/VCFS综合征
工作原理示意图

直接比较两个经过不同标记基因组之间DNA拷贝数的差异。
a CGH 提供客观和定量的结果
SpectralWare® software provides a visual representation of the data generated from the microarray
项目概述
SKY在诊断标记染色体、复杂的染色体易 位或重排，以及微小的染色体结构畸变等方 面有较大的优势，逐渐在临床疑难染色体病 的诊断和产前诊断、植入前遗传学诊断以及 肿瘤遗传学领域得到了广泛应用,为临床染 色体病的诊断、处理、预后评估和遗传咨询 提供依据。
适应症

wk.baidu.com
常规G显带染色体检查显示复杂染色体易 位、标记染色体、衍生染色体； 具有临床表现而常规核型分析技术未发 现异常的病例
t(9;11)
G-band
SKY
技术难点
玻片标本质量的好坏和玻片变性时间 的控制是SKY实验成功的关键。制备本 底干净、核型分布好、没有胞浆的标本， 选择较好的变性时间。
技术局限


对微小的标记染色体进行检测时，由于荧光 闪烁可能会出现颜色混杂现象，需要相应的 FISH进行进一步鉴定，以明确诊断。 试剂及设备成本高。
aCGH适用范围

aCGH将作为染色体分析的一种选择方法，替代 FISH和许多标准染色体组型分析，其也可用于 检测各种样本上的拷贝数变化。 aCGH是一种高尖端技术，广泛应用于产前和产 后诊断、植入前诊断、癌症诊断和预后、个体 化治疗、干细胞和细胞系研究、药物发现等领 域。

aCGH 革命
客观的
出生缺陷是影响人口素质的重大问题，每年 估计有80～100万出生缺陷儿诞生，给家庭和社 会带来沉重的负担。70%的出生缺陷是遗传因素 所致，染色体非整倍体异常最常见，如常染色体 异常13、18、21 三体等及性染色体异常 Turner 综合征、Klinefelter 综合征等。其中最常见的 是21三体综合征又称唐氏综合征(DS)，新生儿的 发病率高达1/800 。
项目概述

传统的染色体畸变诊断方法为G显带染色体核
型分析，可以观察染色体的数目和整套染色体
的主要带形，其分辨率约为350—450个染色体
条带。但对于标记染色体（来源不明的染色
体）、复杂的染色体易位或重排，以及微小的
染色体结构畸变则难以进行准确的分析。
项目概述



光谱核型分析技术（spectral karyotyping, SKY）是1996年发展起来的一种将光谱干涉成 像技术与FISH相结合的细胞遗传学检查的新技 术； 使24种染色体同时以不同的颜色显示出来，染 色体之间的易位可以很直接地观察到； SKY的分辨率较高，可达1.5Mb DNA；而常规的 G显带核型分析技术对小于5-10Mb DNA则难以 分辨了。
临床指征（包括儿童及胎儿）



圆锥动脉干畸形,如法洛四联症,肺动脉 闭锁/室间隔缺损,右室双出口,永存主动 脉干,以及B 型主动脉弓离断； 异常面容； 胸腺发育不良； 腭裂； 低钙血症；
DiGeorge/VCFS综合征
DiGeorge/VCFS 综合征临床特征包括心 脏畸形（锥干部畸形为主）、T细胞功能 缺陷、腭裂、异常面容和低钙血症。 该综合征涉及多个基因的缺失,而TBX1基 因可能是主要致病基因。这些基因的丢 失影响了胚胎期心脏神经嵴细胞的正常 功能,从而造成出生后神经嵴相关组织 (胸腺,腭,圆锥动脉干)的畸形 。
适应症
（1）孕妇年龄大于等于35岁。 （2）孕妇曾经生育过染色体异常患者史。 （3）夫妇一方有染色体结构异常者。 （4）母血清生化筛查高风险。 （5）超生检查发现胎儿异常。

技术原理
荧光原位杂交技术（flourescence in situ hybridization FISH）为分子 生物学（探针）与细胞遗传学（染色体） 的结合。FISH技术是指将荧光标记的染 色体区带特异性的DNA作为探针，与分裂 期或间期细胞原位杂交于荧光显微镜下 观察染色体畸变的技术。
aCGH = 高分辨率 + 全基因组 =
劳动强度大， 耗时
FISH = 高分辨率 + 靶基因 =
G-Banding = “低”分辨率 + 全基因组 =
主观的
aCGH工作流程



步骤1：从质控和实验组织上提取基因组DNA。 必要时扩增。 步骤2：使用青色素-3 dCTP和青色素-5dCTP以 区分标记检测DNA和参考DNA。 步骤3：将标记DNA与芯片R杂交。 步骤4：使用扫描仪和软件对芯片信号进行扫描和分析。 试验方案要求时间为小于两个工作日。结果可在36hr 内收到。不需要细胞培养，也不需要在载玻片上进行冗长 的中期染色体制备。
1p36 先天性肾上腺发育不良症 Alagille综合征 安琪儿综合征 无精子因子A 无精子因子B 无精子因子C Bruton酪氨酸激酶 巨大舌-脐膨出综合征 1A型腓骨肌萎缩症 猫鸣症侯群 DiGeorge 1/VCF综合征 DiGeorge 2 = 10p13 唐氏综合征 Duchenne肌肉萎缩症 甘油激酶缺乏症 Greig综合征 [GLI3] 遗传性压迫易感性神经病 甲状旁腺功能不全、感音神经性聋和肾发育不良 卡尔曼综合征 Langer-Giedion综合征 [EXT1 and TRPSI] 敏-迪综合征 Potocki-Shaffer症侯群[包括多发性外生软骨瘤 2] 神经纤维瘤病1 佩-梅病 I型多囊肾疾病 Prader-Willi综合征 视网膜母细胞瘤1 Rubinstein-Taybi氏症侯群 Saethre-Chotzen综合征 Y染色体性别决定区 Smith-Magenis综合征 Sotos综合征 固醇硫酸酶缺乏症 毛发-鼻-指（趾）综合征 结节性硬化症1 威廉斯综合征 肾母细胞瘤 威尔姆氏肿瘤 Wolf-Hirschhorn症侯群


项目概述
目前世界上唯一有效的方法就是手术治疗。 DiGeorge/VCFS综合征综合征除了先心病 （CHD） 最容易早期发现外，其他异常(如低钙血症、细 胞免疫功能缺陷、气管支气管畸形等) 则相对隐 匿。此类CHD患者如不能早期诊断与适当干预， 手术时则可能发生难以预测的感染、心脏停搏、 呼吸衰竭等，手术风险大大增加，预后不良。因 此，如能通过本项目确诊早期干预，其社会和经 济效益是显而易见的。
分子细胞遗传学诊断 技术简介
荧光原位杂交技术（FISH)快速产前诊断 常见非整倍体 荧光原位杂交技术(FISH)诊断 DiGeorge/VCFS综合征 光谱核型分析技术（SKY)检测染色体异 常 aCGH快速检测间期细胞全基因组拷贝数

荧光原位杂交技术快速产前诊 断常见非整倍体
项目概述