第三章-细胞生物学的研究方法_PPT课件

embryo.
（四）其它光学显微镜
相差显微镜（phase-contrast microscope）
一种将相位差转变成振幅差（明暗差）的显微镜，可观 察不染色的活细胞。
利用样品的不同位点的密度差，形成肉眼可见的明暗区 别。
微分干涉显微镜（differential-interference microscope）
激光共聚焦扫描显微镜（Confocal laser scanning microscope， CLSM）：
用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫 描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光 的聚焦点，也是瞬时成像的物点。
特点：排除焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率 (1.4-1.7)， 可重构样品的三维结构, 主要用来研究细胞亚结构。
荧光显微镜的应用
• B：不同荧光素所需激发波长与所产生的荧光波长比较 • C：细胞有丝分裂中期的观察。
由于荧光显微镜的暗视野为荧光信号提供了强反差 背景，非常微弱的荧光信号亦可得以分辨。
WT
∆cdc15
CM
MDFA/4 d /DAPI stain (400×) 荧光显微镜观察真菌的细胞核
（三）激光共焦点扫描显微镜
荧光显微镜的光路图
The optical system of a modern fluorescence microscope. A filter set consists of two barrier filters (1 and 3) and a dichroic (beam-splitting) mirror (2). In this example the filter set for detection of the fluorescent molecule fluorescein is shown.
如何实现光学显微镜一般配置的最大放大倍数？其原理？
使用油镜，即在100×物镜和载玻片之间滴加香柏油；
普通光学显微镜
分辨率与所用 波长成反比！
用浸没油取代空气的作用?
介质折射率提高
分辨率得到提高
改变光折射角度
增加照明亮度
浸没油与玻璃的折射率相近
很多原来由于在透镜及载片表面的反射和折射而损失的 光线可以进入物镜，使照明亮度提高，改善观察效果。
第一节 细胞形态结构的观察方法
一、光学显微镜 二、电子显微镜 三、扫描隧道显微镜
一、光学显微镜技术
☆ 基本构造：光学放大系统、照明系统、机械和支架系统
普通光学显微镜成像原理
物镜得到物体放大的 实像; 目镜把物镜成的像进 一步放大。
（一）普通复式光学显微镜
分辨率 指区分开两个质点间的最小距离。
embryo that has been stained with a fluorescent probe for actin filaments. The conventional, unprocessed image (A) is blurred by the presence of fluorescent structures above and below the plane of focus. In the confocal image (B), this out-offocus information is removed, which results in a crisp optical section of the cell in the
激光扫描共焦显微镜的原理图
原理：激光束经双色 镜反射后，通过物镜 聚集到样品某一焦点； 从焦点发射的荧光经 透镜汇聚成像，被检 测出；其他部位发射 的荧光不聚焦成像， 不能检测到。
荧光显微镜（A）和激光扫描共焦显微镜 （B）所观察图像的比较
小鼠肾小球的厚切片
Figure 3-14. Comparison of conventional and confocal fluorescence microscopy. These two micrographs are of the same intact gasБайду номын сангаасrula-stage Drosophila
荧光染料分子
Fluorescent dyes. The structures of fluorescein and tetramethylrhodamine, two dyes that are commonly used for fluorescence microscopy. Fluorescein emits green light, whereas the rhodamine dye emits red light.
D=0.61λ/N×sin (a/2)
两个质点之间的距离取决于光源波长λ ，物镜镜口 角a和介质折射率N
空气（N=1.0）、水（N=1.33）、香柏油（N=1.52）
显微镜的种类及原理
普通光学显微镜 光学显微镜一般配置的最大放大倍数是多少？为什么？
目镜：10 ~ 15 ×；物镜： 100 ×；总放大倍数1000~1500 ×；
普通光镜的观察
步 骤：
取材－固定－脱水－包埋－切 片－脱蜡－复水－染色－脱水 －透明－封片－观察
Making tissue sections. How an embedded tissue is sectioned with a microtome in preparation for examination in the light microscope.
一种将样品厚度上的微小区别转化成明暗区别相差显微镜。
录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy）
观察结果
（二）荧光显微镜技术
是光镜水平对特异蛋白质等生物大分子定性定位的最有力的工具。
• 主要是用于检测细胞上的特异荧光材料； • 与普通光学显微镜不同的是增加了两套滤光片。
第一套称为激发光滤片，装在光源和样品之间，只有那 些能激发荧光材料发光的特定波长的光才能通过。
第二套称为阻断滤片，装在物镜和目镜之间，只让燃料 所发出的荧光通过。在黑暗背景的衬托下，发出荧光的样 品很容易被观察。