金属硫蛋白的分离与纯化

L iver
K idney
1. 5
2. 4
3. 0
1. 5
2. 4
3. 0
1. 5
40. 7 60. 0 83. 8 13. 2 14. 6 20. 6 7. 6
5. 27 5. 84 5. 94 2. 85 3. 20 4. 27 3. 11
Lung
2. 4 10. 5 3. 35
3. 0 12. 7 3. 82
精品生产工艺对金属硫蛋白粗品进行纯化, 结果令人满意。
关键词: 诱导; 金属硫蛋白; 纯化
中图分类号: O658. 1+ 3
文献标识码: A
1957 年, Margoshoes 等[ 1] 在研究金属生物学作用时, 从动物器官中分离出一种新物质。它是一种低分 子量、高巯基含量, 能大量结合重金属离子的蛋白质, 因此将该物质称为金属硫蛋白( Metallothionein, MT ) 。 从发现 MT 到现在, 人们对其应用进行了大量的研究[ 2- 4] 。但 MT 粗品中还含有大量的杂蛋白, 故在一定程 度上对 MT 的进一步开发和应用造成了不利的影响, 因此研究和开发 MT 的精品工艺成为必然。
收稿日期: 2007 11 20
修 回日期: 2008 04 11
* 通讯联系人: 蔡震峰, 男, 博士研究生, 研究 方向为金属硫蛋白的印迹聚合物研究.
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第5期
蔡震峰等: 金属 硫蛋白的分离与纯化
第 24 卷
3 羟甲基氨基甲烷 H Cl 溶液
兔肝
提取、匀浆
变性液
离心液 !
有机溶剂变性
离心 !
Sample( g) M T(mg/g)
L iver
39. 76 1. 80
K idney
9. 16 1. 83
Blo od
5. 17 0. 93
L ung
9. 79 1. 95
In t es t in es
29. 38 1. 10
M eat
87. 95 0. 07
2. 5 金属硫蛋白粗品的层析 图 1 是 M T 粗品经溶解、离心, 并经 DAEA Sepharose 离子交换柱的层析图。图中出现的两个峰分别
表 1 诱导后不同体重 下兔肝、兔肾和兔肺中 MT 的含量 Table 1 The contents of MT in liver, kidney and lung after inducement
Weig ht of rabbit ( kg ) Weig ht of sample ( g ) M T ( mg/ g)
( 1. 中南大学化学化工学院, 长沙 410083; 2. 湖南麓谷生物技术有限公司, 长沙 410008)
摘 要: 金属硫蛋白( M T ) 是一类低分子量、高巯基含量, 能大量结合重金属离子的蛋
白质。本文从诱导剂的注射次数、家兔体重以及不同诱导剂等因素对家兔体内金属硫
蛋白含量的影响进行了分析。金属硫蛋白氨基酸组分分析结果与文献报道一致。利用
M T 粗品溶液
层析
紫外监控
离心液 上清液 层析液
M T 峰段层析液
脱盐
浓缩 M T 脱盐液 冷冻干燥 M T 精品
1. 5 测定方法
通常采用的巯基法检测是参照文献[ 9] 。取 10 L 匀浆加入 10 L 1. 2 mo l/ L H Cl, 200 L 0. 1 mo l/ L EDT A 反应 10 m in 后, 加入 200 L 巯基试剂, 用 pH 7. 2 的 0. 1 mo l/ L PBS 加至体积为 4 mL , 摇匀,
第 24 卷第 5 期 Vo l. 24 No . 5
分析 科学学 报 JOU RN A L OF AN A L YT ICAL SCIENCE
文章编号: 1006 6144( 2008) 05 0527 04
2008 年 10 月 O ct . 2008
金属硫蛋白的分离与纯化
蔡震峰* 1, 任凤莲1, 曹醴承2 , 江冠群2
表 3 不同体重、不同注射次数家兔内脏 MT 的含量
Table 3 The contents of MT with different weight and injection times
T hr ee t imes ( 1. 01 kg)
Liver K idney Blood Lung In t es t in es M eat
实行紫外监控, 其目的在于控制金属硫蛋白流出的时间以及监测层析液中金属硫蛋白的浓度。采用自动 部分收集器收集含金属硫蛋白的部分, 然后对金属硫蛋白的峰段进行脱盐层析, 脱盐液经低温冷冻干燥,
得到金属硫蛋白精品的冻干粉。金属硫蛋白精品生产工艺流程如下:
3 羟甲基氨基甲烷 H Cl 溶液
离心
M T 粗品
将新鲜的兔肝经过打碎成匀浆后( 在工艺图中简称兔肝) , 加入 Tris H Cl 缓冲液提取, 匀浆液中加入变性 液( 等体积氯仿 乙醇( 0. 08 1) ) 搅拌均匀后高速冷冻离心分离, 除去非蛋白和杂蛋白物质, 离心液经加热变性 3~ 5 min 再迅速冷冻, 经离心分离除去大部分的杂蛋白, 经浓缩和分子筛凝胶过滤层析, 离子交换层析, 收集 含金属硫蛋白的部分, 经低温冷冻干燥, 得到金属硫蛋白的冻干粉。生产工艺流程如下:
Fiv e times ( 1. 75 kg)
sample ( g )
55. 25 12. 26 53. 76 13. 30 19. 95 71. 18*
M T ( mg/ g)
4. 55 1. 91 1. 76 2. 26 1. 20 0. 56*
2. 4 生理盐水对家兔体内金属硫蛋白含量的影响 为了考察 ZnSO4 注射液对诱导金属硫蛋白的有效性, 在实验中我们采用注射 6 针 0. 9% 生理盐水, 对家兔
2. 2 诱导次数对家兔体内金属硫蛋白含量的影响 分别对家兔注射 0、1、2、3、4、5、6、7 针, 研究了注射次数对兔肝诱导后金属硫蛋白含量的影响, 实验数
据如表 2。由表可看出, 随着注射次数的增加, 金属硫蛋白在家兔肝中的含量也逐渐增大, 但从第五针到 第七针, 金属硫蛋白含量的变化较小, 逐渐达到一个近似平衡的状态。
羟甲基氨基甲烷( T r is) 、盐酸胍、乙二胺四乙酸二钠( EDT A) 及其它试剂均为分析纯。 1. 2 动物的处理
参考 Onsaka 等[ 8] 的方法, 给家兔皮下注射 ZnSO 4 共 4 次, 第 1 天注射 60 m g/ sing le( 约 15 mg Zn/ kg) , 第 2、4 天注射 90 m g/ sing le, 第 7 天注射 120 mg/ single, 第 8 天处死动物后取其内脏。在工业生产 中, 为了提高诱导产生的金属硫蛋白的含量, 一般对家兔注射 7 次。 1. 3 金属硫蛋白粗品的生产工艺
3 min后测定波长 412 nm 处吸光度, 根据简化公式: c =
9. 56A 20
计算
MT
的含量。
2 结果与讨论
2. 1 诱导后家兔体内不同部位金属硫蛋白含量比较 诱导后家兔体内不同部位金属硫蛋白含量见表 1。从表 1 可以看出, 诱导后肝、肾和肺中 M T 的平均
含量分别为 5. 67 mg/ g、3. 44 mg / g、3. 76 mg/ g。很明显, 诱导后家兔肝内的 M T 的含量远远大于肾和 肺, 而且在相同诱导条件下, 体重增加, M T 含量也同样增加。尽管家兔肺中金属硫蛋白的含量在诱导后 含量也比较高, 但是肺作为软质组织, 很难象硬质组织一样制成理想的匀浆, 提取过程中不易完全打碎, 容 易缠在打碎机或者搅拌机上, 给生产带来很多不必要的麻烦。
为 M T 1 和 M T 2 的吸收峰。在溶液中由于 M T 1 比 M T 2 少一个负电荷, 所以 M T 1 比 M T 2 先出峰。 为了得到纯度更高的 MT 精品, 通常收集图 2 中吸光度在 2. 0 以上的部分进行冻干, 这样得到的金属硫蛋 白含量可以达到 95% 以上。
图 1 MT 精品离 子交换色谱图 Fig. 1 Ion exchange chromatogram of purif ied MT
1 实验部分
1. 1 仪器及试剂 UV 2501PC 型紫外可见分光光度计( 日本, Shimadzu) ; CR 21G 高速离心机( 日本, H IT ACH I) ; DE
AE Sepharose( 瑞典, Pharmacia) ; BSZ 100 自动部分收集器( 上海沪西分析仪器厂) 。 金属硫蛋白由湖南麓谷生物技术有限公司提供; 5, 5 二硫二( 2 硝基苯甲酸) ( DT NB, Sigm a 公司) ; 三
表 2 注射不同次数兔肝中 MT 的含量 Table 2 The contents of MT based on different injection times
Injection times M T(mg/g)
0 0. 26
1 0. 98
2 1. 72
3 2. 69
4 3. 09
5 5. 37
6 5. 38
加热变性 变性液 离心 ∀ 离心液 ∀ 离心 # 离心液 # 超滤浓缩 浓缩液 层析 层析液
脱盐
层析 冷冻干燥 M T 冻干粉 1. 4 金属硫蛋白精品的生产工艺
根据金属硫蛋白粗品的生产工艺, 对金属硫蛋白的精品生产工艺进行了研究。将金属硫蛋白的粗品 加入 T ris H Cl 缓冲液溶解, 高速冷冻离心分离后收集上清液, 经 DAEA Sepharose 离子交换柱层析, 同时
sample ( g)
65. 86 14. 45 33. 49 15. 66 42. 19 31. 85
M T (mg/g)
2. 88 1. 15 1. 21 1. 79 1. 13 0. 08
* N ote: inject ing six t imes , t he w eight of rabb it is 1. 53 kg.
的肝、肾、血、肺、肠及兔肉中 MT 含量进行检测, 家兔的体重为 1. 36 kg, 实验结果如表 4。家兔体内各部位产生 的 MT 较低, 主要是由于在体内存在 MT 与重金属离子结合, Na+ 无法置换重金属离子形成更稳定的 MT 。
表 4 注射 6 针 0. 9%生理盐水 MT 的含量
Table 4 The contents of MT after injecting rabbit six times with sodium chloride injection ( 0. 9%)
7 5. 42
2. 3 不同体重、不同注射次数对金属硫蛋白含量的影响 不同体重、不同注射次数对 M T 含量的影响见表 3。从表 3 可看出, 家兔肝、肾、肺中 MT 的含量比较高,
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第5期
分析科学学报
第 24 卷
ห้องสมุดไป่ตู้
达到 0. 18% , 兔肉中 MT 含量很低。注射 6 针诱导后 M T 含量比注射 3 针诱导后增加了约 7 倍。但是, 随着 受试兔子体内锌含量的增加, 兔子的存活力降低就较为明显, 导致生产成本提高。因此, 为了提高家兔体内 金属硫蛋白的含量, 不但要增强诱导效果, 同时要注意延长受试兔子的存活时间, 增加诱导剂的加入量。
图 2 图 1 中的主峰脱盐图 Fig. 2 The desalinating profile of the highest peaks in Fig. 1
采用不同浓度的缓冲溶液( T ris H Cl+ N aCl, pH = 8. 4) 进行梯度洗脱, 分管收集洗脱液, 可以得到 M T 1 和 MT 2 的两个峰( 如图 3 中, 分别对应 a 和 b) , 分开收集, 然后浓缩、用凝胶柱进行脱盐, 冻干后可 以得到 M T 1 和 MT 2 的精品。 2. 6 金属硫蛋白的氨基酸组分分析
金属硫蛋白的提取以及纯化方法很多, 包括层析法[ 5] 、高效液相色谱法[ 6] 、毛细管电泳法[ 7] 等, 但是多 数只能用于实验室研究, 在工业生产中仍采用层析法。本文在原有粗品的生产工艺基础上采用进一步离 子交换层析和脱盐, 研究了精品的生产工艺, 同时对诱导后家兔肝、肾和肺中金属硫蛋白的含量进行了比 较, 对诱导次数以及采用生理盐水作为诱导剂进行了研究。利用研究的纯化工艺对粗品进行纯化实验, 实 验结果令人满意。本文的研究对扩大 M T 的原料来源及更进一步开发利用提供理论基础。