微生物学[第十章微生物与基因工程]山东大学期末考试知识点复习

第十章微生物与基因工程

一、要点提示

1．基因工程，又称基因操作或重组DNA技术，是体外对DNA分子进行加工、剪切、操作及施工，把不同来源的DNA分子重新组合构建载体后，导入宿主细胞内，使其扩增和表达，获得大量基因产物，或者使生物体表现出新的形状。基因工程是在分子生物学、微生物学基础上结合有关现代科学和工程学原理和方法而开拓的技术领域。它的出现改变了生物科学的面貌，促使现代生物技术迅猛发展，并带动了现代生物技术产业的兴起。

2．基因工程的基本过程是目的基因的获得→重组载体的构建→重组载体导入宿主细胞→阳性重组子的筛选→基因的测序和鉴定→基因的控制表达。基因工程的每一个环节都离不开微生物的参与。

3．基因工程给人类带来的正面影响是十分巨大的，基因工程产品及其技术在医学、工业、农业及其他领域的应用愈来愈广泛，并已经带来了令人可喜的结果。但是基因工程潜在的危害性也不容忽视，任何滥用和非和平的开发(生物战争)都会给人类带来毁灭性的灾难。

二、重点、难点剖析

1．微生物和微生物学在基因工程的产生和发展中占据了十分重要的地位，可以说一切基因工程操作都离不开微生物。从以下6个方面可以说明。

(1)微生物的多样性，尤其是抗高温、高盐、高碱、低温等基因，为基因工程提供了极其丰富而独特的基因资源；目的基因的获得可以是通过构建基因文库或cDNA文库来筛选目的基因片段；或通过PCR技术进行基因的体外扩增，包括对活的不可培养微生物基因的体外扩增，并对基因进行定点诱变和分子定向进化。

(2)基因工程所用克隆载体主要是用病毒、噬菌体和质粒改造而成。

(3)基因工程所用千余种工具酶绝大多数是从微生物中分离纯化得到的。

(4)微生物细胞是基因克隆的宿主，基因工程中最重要、最广泛应用的克隆载体宿主是原核生物的大肠杆菌及真核生物的酿酒酵母。即使植物基因工程和动物基因工程也要先构建穿梭载体，使外源基因或重组体DNA在大肠杆菌中得到克隆并进行拼接和改造，才能再转移到植物和动物细胞中。

(5)大规模表达各种基因产物，从事商品化生产，通常都是将外源基因表达载体导人大肠杆菌、酵母菌或哺乳动物细胞中，构建成工程菌，然后利用微生物发酵工程来实现。

(6)有关基因结构、性质和表达调控的理论主要也是来自对微生物的研究，或者是将动、植物基因转移到微生物中后进行研究而取得的，因此，微生物学不仅为基因工程提供了操作技术，同时也提供了理论指导。

2．微生物与基因克隆载体。

(1)克隆载体的基本要求。

①载体在细胞中必须能够独立自主地复制。

②载体必须具有若干限制酶的单一切割位点，即多克隆位点，位于载体复制的非必需区，便于外源DNA的插入。

③载体必须具有可供选择的遗传标记，例如：具有抗生素的抗性基因，便于对阳性克隆的鉴别和筛选。

④载体DNA须易于生长和操作。

(2)基因工程中使用的载体。到目前为止，基因工程中使用的载体基本上均来自微生物，主要包括6大类：质粒载体，λ噬菌体载体，柯斯质粒载体，M13噬菌体载体，真核细胞的克隆载体，人工染色体等。原核生物大肠杆菌的克隆载体比较见表10-1。

真核生物的克隆载体主要是酵母质粒载体(穿梭载体)、真核生物病毒载体和人工染色体。酵母质粒载体都是利用其2μm质粒与细菌质粒pBR322构建而成的，主要有附加体质粒(较高拷贝数)、复制质粒(中等拷贝数)和整合质粒(整合到酵母染色体上)3种。人工染色体是一类目前能容纳最大外源DNA片段(1 000 kb)人工构建的载体，目前有酵母人工染色体(YAC)和细菌人工染色体(BAC)。

3．微生物与基因工程操作基本的工具酶。如基因与载体的切割和连接要用各种限制性内切酶和T4连接酶，DNA的体外合成、测序要用Taq酶、pfuDNA 高保真聚合酶，RNA反转录要用反转录酶等。必须提出的是，基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物中分离和纯化而获得的。表10-2列出了部分常用限制性内切酶及其微生物来源。限制性内切酶的命名是根据分离出此酶的微生物学名而定的。即取微生物属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体字母加以表示，遇有株名，再加在后面。如果同一菌株先后发现几个不同的酶，则用罗马数字加以表示。

4．克隆载体宿主是外源基因能够在细胞中大量扩增和表达的基本条件。目前有大量的改造后的大肠杆菌和酿酒酵母菌株可以作为基因克隆宿主。

理想宿主的基本要求是：

①能够高效吸收外源DNA。

②具有使外源DNA进行高效复制的酶系统。

③不具有限制修饰系统，不降解导入的未经修饰的外源DNA。

④不具有DNA重组系统，常用重组缺陷型(RecA-)菌株，使克隆载体DNA 与宿主染色体DNA之间不发生同源重组。

⑤便于进行基因操作和筛选。

⑥具有安全性。宿主细胞应该对人、畜、农作物无害或无致病性等。

5．外源DNA导入宿主细胞。不同的宿主细胞，外源DNA导入的方式不同。

(1)外源DNA导入原核细胞。

转化：重组质粒载体+感受态细胞，效率较低；

转染：重组噬菌体DNA或重组噬菌质粒+感受态细胞，效率较低；

感染：外源DNA被包装成λ噬菌体颗粒+宿主细胞，效率高。

(2)外源DNA导入真核细胞。

①酵母细胞。一般利用蜗牛酶除去酵母细胞壁形成原生质体，再用CaCl2和聚乙二醇处理，重组DNA以转化方式导入酵母细胞的原生质体，最后将转化后的原生质体置于再生培养基的平板中培养，使原生质体再生出细胞壁形成完整酵母细胞。或者采用电转化法(电穿孔法)。电穿孔(electroporation)法是把宿主细胞与外源DNA混合并置于电击槽中。在高压电脉冲作用下，使细胞膜瞬时击穿出现微孔，外源DNA通过微孔进入细胞。

②哺乳动物细胞。最简便的是微量注射法和电转化法。由于有些动物细胞体积较大，如受精卵用微量注射器可将外源DNA注入细胞内。电穿孔法十分成功用于哺乳动物细胞和植物细胞，而且也可用于通常不能进行转化的细菌。大肠杆菌应用电穿孔法也可提高转化率。

③植物细胞。最简便的是微量注射法及电穿孔法。还有两种方法，一种是将含有重组Ti质粒的土壤农杆菌与植物原生质体共培养(即共培养法)或与植物叶片共培养(即叶片培养法)，多数双子叶植物转化常用此法；另一种是基因枪法或称微弹枪(particle guan)法，利用微弹把表面吸附有外源DNA的金属微粒高速射进植物的细胞或组织，可直接将外源基因导入幼苗，此法简便、有效。

6．重组体的筛选与鉴定。

(1)重组体表型特征的鉴定。

①抗生素平板法。如果外源DNA片段插入载体的位点位于抗生素抗性基因之外，则重组体细胞具有抗性。此外，还有一些自身环化的载体和未被酶解的载体，他们的转化细胞也能在含该抗生素平板上生长并形成菌落，而只有作为对照的受体细胞不能生长。此法缺点是假阳性率高。

②插入失活法。外源DNA片段插入载体的位点位于抗生素抗性基因或酶基因之内，则重组体细胞失去抗性或失去酶的活性。

③插入表达法。在某些载体的标记基因(如抗生素抗性)前面连接一段负控制