激光共聚焦显微镜

胰腺细胞悬浮液样品适当离心后加入荧光染色剂，用专业的细胞培养皿，中间凹陷，可在激光共聚焦载物台上拍片，扫描，观察钙离子变化情况

目的：监测细胞胞浆中游离钙的动态变化

原理：正常细胞内游离钙浓度[Ca2+]i为0.1 umol/L，胞外钙离子浓度为

1.2-1.3 mmol/L，相差达10000倍。胞外钙内流和胞内钙库动员形成的钙

震荡(钙峰或钙波)在各种生理过程中起重要作用；病理状态下细胞内钙超负荷将造成一系列代谢紊乱，直至细胞坏死或凋亡；钙离子通道阻断剂已广泛应用于临床。显而易见，测定[Ca2+]在生理学、病理学和药理学等研究工作中均具有重要意义。

Fluo-3/AM等钙离子荧光染料以脂溶性的乙酰甲氧基酯（AM酯）的形式导入细胞，在胞内水解酶的的作用下水解成游离酸，与钙离子的结合物在激发光作用下能产生特异的荧光。荧光信号的强弱随钙离子浓度的变化而变化。

方法：

1.预先用二甲基亚砜(DMSO)将Fluo-3/AM配制为1 mmol/L原液，-20℃

避光保存。F127用DMSO配制成20%溶液(W/V)。用无血清无酚红培养液将Fluo-3/AM稀释成终浓度为10 umol/L，并加入0.1%的Pluronic

F-127备用。

2.移去培养皿中的原培养液，用PBS液冲洗心肌细胞2遍，加入10 umol/L

染料液1 ml，置于37℃的CO2孵箱里避光温育30 min。

3.将染色后的心肌细胞用PBS液冲洗3遍，加入1 ml DMEM液后置于

20倍光学显微镜观察区域及层面，用LSCM观察Fluo-3染色的细胞的某一层面的荧光图像。

4.启动LSCM，选择488 nm 氩离子激光，启动计算机，运行lasersharp

2000软件，选择time-course程序，设置扫描间隔时间（30 sec）、扫

描次数（300次），开始扫描。

5.将数据输入excel进行整理、统计、分析。

1)如果直接做活细胞观察,可以把细胞直接seed在放在6 well中的盖玻片上,然后培养,等观察时用镊子把盖玻片取出,倒扣在载玻片上就行了.

2)需要做免疫荧光染色的,可以做完染色,然后把细胞悬浮起来,滴一滴到载玻片上,盖上玻片观察. 如果是用探针孵育活细胞，可以先做成细胞爬片，在相关处理后，探针避光孵育，完毕后，用镊子把细胞爬片取出,倒扣在载玻片上就行了. 买国产玻片就可以，不过要泡酸过夜后再灭菌，之前可以按自己需要切片，根据大小，然后在30mm培养皿，中间打孔，用泡酸洗好的大玻片粘好，用时细胞种在切片上，切片放在皿小孔中，罐流都可以的。我们实验室十几年这种方法，不过如果活细胞工作站要求皿可以订制，很便宜，细胞可种在大玻片上，这样透光好。1、盖玻片买国产的就可以，不过有时背景较脏。你最好拿弱酸，如稀盐

酸浸泡。

2、然后灭菌，比如紫外照射，两面都照射，然后放于合适的孔板中，接种合适密度的细胞于孔板中，一般较稀一些，那样容易有单个的细胞，得到较好的图片。

3、加抗体时最好能在封口膜上操作，那样很节约抗体，样品可以放到一个湿盒中，饭盒加水就可以了。一定要记住接种细胞的玻片面，别弄反了。

4、在载玻片加上一滴，防淬灭剂，用甘油配制的DABCO，将含细胞的盖玻片那一面朝向载玻片放置，周围再用指甲油或其它胶固定。用锡箔纸报住，避光4c保存，最多一个月。

5、最好染核，核好染，同时也便于观测。

6、先在普通荧光显微镜下观测你的结果，实验理想的话再去看激光共聚焦。毕竟激光共聚焦很贵。我做过confocal，我个人觉得用confocal来看细胞的亚结构非常好。我用的OLYMPUS的FV1000,我看过说明书介绍，confocal可以做离子浓度的测定，但是我没有做过。组织的切片一样可以做confocal,我的一个朋友就是做的组织，方法和做细胞的荧光一样，结果不错。

我当时做的是细胞的免疫荧光，方法和基本的免疫荧光一样，细胞种在载玻片上，60%融合就好，不要长满，因为细胞太多，挤在一起的话，会影响成像。一抗，荧光二抗，依次孵育。我把我毕业论文中的一张图贴上来给大家看看。我做的是双染，一个抗体用的FITC（绿色），是一种微管蛋白；另一个用的是TRITC，是一种结构蛋白。黄色是两种融合的图像，结果发现这两种蛋白结构上共地位。是否要confocal和免疫组化都做要取决于实验的具体检测指标和实验的目的，比如检测核因子等转录因子，静息状态时核因子kb 存在于细胞浆，刺激时进入细胞核，这样用激光共聚焦的共定位技术就可以很清楚的指示出来，而免疫组化只能粗略的看出。

组织切片的自发荧光应该是限制了荧光标记技术在这一方面的应用，所以不做任何处理，在荧光显微镜下都可以看到荧光，处理这样的情况一是选用不同的标记荧光尽量避开自发荧光，也有些去除自发荧光的措施，要具体情况具体使用了。

当然不排除有些文章纯粹为了confocal而confocal，其实能用简单的实验说明问题了就不要选用复杂的了，免疫组化的定位显示在发国外论文的时候还是很受重视的。免疫荧光组织化学技术

一、免疫荧光组织化学技术的发展史概述……………………………………………………

二、免疫荧光组织化学的原理…………………………………………………………………

（一）直接方法……………………………………………………………………………

1．检查抗原方法……………………………………………………………………

2．检查抗体方法……………………………………………………………………

（二）间接方法……………………………………………………………………………

1．检查抗体(夹心法)方法……………………………………………………………

2．检查抗体方法……………………………………………………………………

3．检查抗原法………………………………………………………………………

（三）补体法………………………………………………………………………………

1．直接检查组织内免疫复合物方法………………………………………………

2．间接检查组织内抗原方法………………………………………………………

（四）双重免疫荧光组织化学标记方法…………………………………………………

（五）对照试验……………………………………………………………………………

1．直接方法…………………………………………………………………………

2．间接方法…………………………………………………………………………

3．补体方法…………………………………………………………………………

三、荧光抗体的制备………………………………………………………………………………

（一）荧光素………………………………………………………………………………