微生物产赖氨酸的研究进展_刘晓飞

微生物产赖氨酸的研究进展收稿日期：2009-09-09基金项目：黑龙江省科技厅项目（GA07B401-5）作者简介：刘晓飞（1980-），女，博士研究生，研究方向为农业微生物。

E-mail:liuxiaofei72@ *通讯作者：高学军，教授，博士生导师，研究方向为生物化学与分子生物学。

E-mail:gaoxj5390@刘晓飞1，高学军1*，刘营2，敖金霞2，王青竹1（1.乳品科学教育部重点实验室，东北农业大学，哈尔滨150030；2.东北农业大学生命科学与生物技术研究中心，哈尔滨150030）摘要：赖氨酸是人和动物营养的9种必需氨基酸中的第一必需氨基酸，广泛应用于医药、食品和饲料等领域。

发酵法是目前生产赖氨酸最主要的方法。

文章从赖氨酸的生产现状、生物合成途径、代谢调控，育种等方面阐述了微生物生产赖氨酸的研究进展。

关键词：赖氨酸；发酵；生物合成；代谢调控中图分类号：Q93-91文献标志码：A文章编号：1005-9369（2010）01－0157－04Research progress on microbial production of Lysine/LIUXiaofei 1,GAOXuejun 1,LIU Ying 2,AO Jinxia 2,WANG Qingzhu 1(1.Key Laboratory of Dairy Sciences ,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China ;2.Research Center of life Sciences and Biotechnique ,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China )Abstract:As one of the essential amino acids for human beings and animals,Lysine is widely usedin many fields,such as pharmaceutical,food and forage.The fermention is the frequently used method of Lysine production at present.This paper stated the research evolution focused on aspects of production situation,biosynthetic pathways,metabolic controland regulation and breeding of Lysine.Key words:Lysine;fermentation;biosynthesis;metabolic control and regulation 赖氨酸（Lysine ）的化学名称为2，6-二氨基己酸，有L-型（左旋）、D-型（右旋）和DL 型（消旋）三种旋学异构体。

人类和动物可吸收利用的只有L-型。

它对调节体内代谢平衡、提高体内对谷类蛋白质的吸收、改善人类膳食营养和动物营养、促进生长发育均有重要作用。

饲料中添加赖氨酸对单胃动物极其重要，如豆粕中添加适量的赖氨酸，可以大大提高蛋白质的利用率，促进禽畜生长。

赖氨酸还决定断奶仔猪体内蛋白质合成、沉积以及其他氨基酸的利用率，赖氨酸转化为体蛋白的效率高达86%[1]。

赖氨酸应用范围较广目前，有90%的赖氨酸应用于饲料工业，尤其是2003年以后，我国已成为全球最大的赖氨酸生产国。

本文从赖氨酸生产现状、生物合成途径、发酵调节机制、微生物应用等方面综述了微生物产赖氨酸的研究现状及应用前景。

1赖氨酸生产现状L-赖氨酸最初是从蛋白质水解物中分离得到的，蛋白质水解法一般以动物血粉为原料，此法特点是工艺简单，但原料来源有限，仅适合小规模生产。

后又出现了化学合成法、酶法，使用的合成法主要有荷兰的DMS（Dutch State Mijinen ）法和日本的东丽法，此法最大缺点是使用剧毒原料光气，可能残留催化剂，产品安全性差，存在严重的环保问题[2]。

1960年，日木首先采用微生物发酵法生产。

微生物发酵生产氨基酸是人为地解除氨基酸生物合成的代谢控制机制，使其积累大量所需氨基酸。

氨基酸的L-型立体专一性决定了发酵法生产氨基酸较化学合成的工艺更简单、快捷。

我国于20世纪60年代中第41卷第1期东北农业大学学报41(1):157~1602010年1月Journal of Northeast Agricultural UniversityJan.2010期开始进行赖氨酸菌株选育和发酵的研究，但因产量较低难以工业化。

直到70年代末80年代初世界赖氨酸实现工业化后我国研究才取得突破。

目前，世界约2/3的赖氨酸企业采用发酵法生产，生产的为L-型赖氨酸，生产工艺已基本成熟。

近年来，赖氨酸的需求逐年增加，全世界每年大概80万t 赖氨酸通过发酵生产的方式获得。

用于工业上发酵生产赖氨酸的菌株主要是棒状杆菌和短杆菌等细的变异株，棒状杆菌具有极高的经济价值[3]，其中谷氨酸棒状杆菌应用最为广泛[4]。

此外，赖氨酸生产还有应用大肠杆菌[5]、黄色短杆菌[6]、酿酒酵母[7]、乳酸发酵短杆菌[8]、假丝酵母[9]等的报道。

生产赖氨酸的微生物主要有四类：野生型、营养突变型、调节突变型和营养调节突变型。

工业上通过优化发酵菌种（诱变和基因工程手段）和改变发酵条件（搅拌速度、pH、溶氧、温度和CO2）来提高赖氨酸产量。

获得高产微生物菌株的方法主要有传统诱变方法（紫外线、X射线、氮芥和亚硝基酯等）、原生质体融合和基因工程方法等。

据报道，经过诱变菌株产生的赖氨酸提高40%～50%。

诱变菌株以价格低廉的碳源为发酵原料，如各种淀粉水解糖、蜜糖、醋酸和乙醇等，发酵生产赖氨酸，通过分离、浓缩、蒸发、结晶、干燥生产工艺获得饲料级赖氨酸、再精制可得到食品级、医药级产品[10]。

2赖氨酸的生物合成途径2.1天冬氨酸途径天冬氨酸途径又称二氨基庚二酸途径，此途径多存在细菌、绿藻、原虫和高等植物中，以天冬氨酸为起始物质，还可以合成苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸[11]。

2.2α-氨基己二酸途径α-氨基己二酸途径存在于酵母和霉菌中。

酵母主要是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisia），霉菌主要是粗糙脉孢菌（Neurspora crassa）。

3赖氨酸的代谢调控与育种3.1添加结构类似物抗类似物突变株也称为代谢拮抗无抗性突变株。

选育抗类似物突变株，是目前代谢控制发酵育种的主流。

选育抗类似物突变株，因为代谢调节可被遗传性地解除，在发酵时可不再受培养基成分的影响，代谢较为稳定。

另外，抗类似物突变株还具有不易发生回复突变的优点。

添加赖氨酸的结构类似物是采用切断或减弱支路代谢的方法来增加赖氨酸的积累。

由于限制高丝氨酸（H omaserine，Hom）的补给量，使苏氨酸（T hreonine，Thr）和蛋氨酸（M ethionine，Met）的生成有限，从而解除了Thr和Lys对天冬氨酸激酶（A spartate Kinase，AK）的协同反馈抑制，使Lys得以积累。

s-（β-氨基乙基）L-半胱氨酸（S-（β-aminoethyl）-L-cysteine hydrochloride，AEC）是生产赖氨酸常用的结构类似物。

Aida等从日本土壤中分离得到的野生型枯草芽孢杆菌产赖氨酸2.5g·L-1[12]。

Chaudhurl等使用从印度土壤中分离得到的枯草芽孢杆菌[13]，依照Adelberg的方法加入浓度为300μg·mL-1N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍[14]（N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine（carcinogen，mutagen），MNNG），在培养基中加入20mmol·L-1AEC后得到的突变株产赖氨酸16g·L-1，再经60s的紫外线照射后的突变株产赖氨酸21g·L-1。

Sands等使用乳酸杆菌经过AEC四次诱变，原始菌株的赖氨酸产量不足1μg·mL-1，而突变株赖氨酸产量达到72μg·mL-1[15]。

张伟国等以黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）ATCC14067出发，经过亚硝基胍（Nitrosoguanidine，NTG）、硫酸二乙酯（Diethyl Sulfate，DES）逐级诱变处理，用AEC、磺胺胍（Sulfaguanidine，SG）等氨基酸结构类似物及琥珀酸为唯一碳源平板定向育种，获得1株L-赖氨酸高产菌，L-赖氨酸盐酸盐产量达77～82 g·L-1[16]。

Jose等以酿酒酵母为出发菌株，加入赖氨酸的结构类似物AEC，以脯氨酸为氮源，得到的突变株产赖氨酸是野生株的3～7倍[17]。

3.2改变膜的通透性改变细胞膜透性选育赖氨酸高产菌株是行之有效的选育途径，赖氨酸是在菌体内合成后，通过细胞膜渗透到发酵液中的。

如果能够改变细胞膜的通透性，一方面可以使产物易于提取，另一方面可以降低产物在菌体中浓度，使产物不能引起反馈抑制或阻遏作用。

齐秀兰等利用L-赖氨酸产生菌钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）D60-95经紫外线诱变，使用七叶苷筛选抗性菌株，获得高产稳定菌株E0.9-37，L-赖氨酸产量为82.0g·L-1，较出发株提·158·东北农业大学学报第41卷高20.6%。

通过优化发酵培养基使菌株E0.9-37L-赖氨酸产量高达111.0g·L-1，较出发菌株提高了63.2%[18]。

试验证明，七叶苷对于改善细胞的通透性有一定作用。

潘中明等以乳酸发酵短杆菌AL039为出发株，经亚硝基胍诱变，筛选到一株氟丙酮酸敏感型突变株FP094，其赖氨酸产量比出发菌株提高37.5%，当添加生物素的量在200～500μg·L-1时，可以明显地提高赖氨酸的产量和转化率，证明高浓度的生物素对乳酸发酵短杆菌高产赖氨酸是有利的，因为添加过量生物素会导致生物细胞膜中更多的磷脂分子合成，限制了谷氨酸和天冬氨酸向胞外的分泌，从而使细胞内的谷氨酸对谷氨酸脱氢酶等产生反馈抑制，迫使代谢流向合成天冬氨酸的方向进行，天冬氨酸进而合成赖氨酸[19]。

3.3增加前体物增加天冬氨酸浓度，天冬氨酸激酶与底物的亲和力协同性增大，能够抵消变构抑制剂的影响，使前体物（丙酮酸、草酰乙酸、天冬氨酸等）充分地用于合成赖氨酸。

从葡萄糖形成赖氨酸的过程中，依赖于天冬氨酸生成的量。