基因工程原理

基因工程原理

1、典型的DNA重组实验通常包括哪些步骤？（20分）

重组DNA技术一般包括四步：①获得目的基因；②与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；③用重组DNA分子转

化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；④对转化子筛选和鉴定。⑤对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，

获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。

2、在PCR扩增时，（1）PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或

小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，为什么？有何对策？

（2）PCR扩增后有时出现涂抹带或片状带，其原因是什么？应该如何改进？

（20分）

(1)其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，

及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与延伸)。

(2)出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数。

3、获得一个功能未知的基因克隆后，怎样研究该基因的功能？请提出具体的

研究方案。（20分）

基因功能的研究思路主要包括:

1.基因的亚细胞定位和时空(发育期或梯度药物处理浓度, 不同组织/器官)表达谱;

2.基因在转录水平的调控(可以通过genome walking PCR或通过已有的资源库寻找该基因的启动子等转录调控区域, 通过单杂交或ChIP

等技术, 寻找该基因的转录调控蛋白)

3.细胞生化水平的功能研究(也就是蛋白蛋白作用复合体的寻找验证,具体方法有酵母双杂交, GST pulldown, co-IP, BRET, FRET, BiFc等等,对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位)

4.gain-of-function & loss-of-function: 也就是分别在细胞和个体水平,做该基因的超表达和knockdown(或knockout), 从表型分析该基因的功能.

功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究, 综合分析.

4、在真核生物基因的DNA序列中，哪些部分的核苷酸序列的变异会影响其编

码的蛋白质的结构和功能？为什么？（20分）

外显子（exons）和启动子：既存在于最初的转录产物中，也存在于成熟的RNA分子中的核苷酸序列。术语外显子也指编码相应RNA外显子的DNA中的区域。启动子是基因（g ene）的一个组成部分，控制基因表达（转录）的起始时间和表达的程度。启动子（P romoters）就像“开关”，决定基因的活动。既然基因是成序列的核苷酸（nucleoti d es），那么启动子也应由DNA组成。启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录（transcription）因子的这种蛋白质（proteins）结合而控制基因活动的。转录因子就像一面“旗子”，指挥着酶（enzymes）(RNA聚合酶polymerases) 的活动。这种酶制造着基因的RNA复制本。基因的启动子部分发生改变（突变），则导致基因表达的调节障碍。这种变化常见于恶性肿瘤。启动子是位于结构基因5‘端上游的一段DNA列，能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合，活化RNA聚合酶，启动基因转录。

5、简述基因敲除的原理及应用价值。（20分）

基因敲除技术的原理是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，引入的新基因会随基因组DNA的复制而稳定复制，因而可在活体内对某一特定基因的功能进行研究。

基因敲除有以下应用价值：

①．建立生物模型。基因敲除技术就常常用于建立某种特定基因缺失的生物模型，从而进行相关的研究。

②.疾病的分子机理研究和疾病的基因治疗。通过基因敲除技术可以确定特定基因的性质以及研究它对机体的影响。这无论是对了解疾病的根源或者是寻找基因治疗的靶目标都有重大的意义。

③. 提供廉价的异种移植器官。如果能将产生异源分子的基因敲除，能够很大地降低排异反应。

④. 免疫学中的应用。同异源器官移植相似，异源的抗体用于人体时或多或少会有一定的免疫排斥，使得人用抗体类药物的生产和应用受阻。而如果将动物免疫分子基因敲除，换以人的相应基因，那么将产生人的抗体，从而解决人源抗体的生产问题。

⑤改造生物、培育新的生物品种。细菌的基因工程技术是本世纪分子生物学史上的一个重大突破，而基因敲除技术则可能是遗传工程中的另一重大飞跃。它为定向改造生物，培育新型生物提供了重要的技术支持。