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初步检菌的阳性克隆接种提质粒，供后续酶 切分析以及测序检测。
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20
酶切检测阳性克隆
另外酶切后纯化前，均需热灭活，以免残余的限 制性内切酶干扰后续连接反应，降低阳性率。
.
15
回收前
酶切载体带 酶切目的条带
.
Fra Baidu bibliotek
回收后
16
连接
催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二 酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。
PCR产物最好进行切胶回收纯化，以去除PCR产物中的非 特异性片段和引物等杂质。
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17
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18
转化
基本步骤： （1）将100μl感受态细胞于冰上解冻。 （2）取5μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以
混匀内容物。 在冰上放置30分钟。 （3）将管放入预加温到42℃的水浴中，热激90秒。快速将
管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2分钟。 （4）每管中加700μl LB培养基，37℃振荡培养1小时，进行
根据不同的目的，可有三类引物选择
.
5
.
6
PCR得到目的基因
刚开始摸条件时，
都会先做一个梯
度PCR，选出最
适条件。
94
由于此步为获
温
度 72
取正确的目的基 （℃）
因，所以尽量避
55
免PCR的突变格
外重要。其中所
采取的措施有：
22
使用高保真酶、
循环次数控制在
300cycle左右、
引物设计合理等。
1
延伸)。
什么条带都没有，其原因可能是少加东西，酶已经失活了，或退火温 度太高等。解决方法：检查是否少加东西了，换一下酶，降低退火温 度或做个梯度，摸一下条件。
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10
PCR产物纯化
倘若直接对PCR产物进行酶切，体系的杂 蛋白、离子等会造成酶切困难或星活性， 残余的聚合酶也会填平粘性末端，造成克 隆失败。
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4
RT
由于真核基因是由非编码的内含子将ORF分隔开 来的断裂基因，若以基因组为模板PCR得到的片 段克隆进载体，不能在原核细胞剪接内含子，也 不能在非对象真核细胞中正确剪接表达。所以要 克隆真核蛋白基因，需以不含内含子的连续编码 的mRNA为模板。
PCR耐热酶不能直接以mRNA为模板扩增，必须 通过逆转录酶将mRNA逆转录为cDNA,再以cDNA 为模板扩增目的基因。
2
3
高温变性 低温退火 适温延伸
形
DNA 2
成
条变 单性
子链延伸 DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
1
2
3
4
时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
5
.
7
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8
PCR常出现的问题
1.假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条
带一致， 有时其条带更整齐，亮度更高 2.出现非特异性扩增带：PCR扩增后出现的条带 与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现 特异性扩增带与非特异性扩增带 3.什么条带都没有
注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出 现星号活性，可通过增加反应体系的总体积的方 法实现这一要求。
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13
酶切常见问题
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14
纯化酶切产物
通常此步是必要的，可以对比未经纯化的酶切产 物进行连接后获得的阳性克隆大大低于胶回收酶 切产物连接所得阳性克隆。
此步的目的是去除多余的片段，得到单一纯化的 目的基因与载体骨架，使之连接不受其他序列干 扰。
经典载体构建流程
.
1
I 载体构建流程
RT
PCR
提取mRNA
cDNA
得到目的基因
PCR产物纯化
菌落PCR 转化 连接
纯化酶切产物
酶切目的基因和载体
保菌
挑取阳性克隆去测序
测序正确的摇菌提质粒
.
导入表达宿主 测试表达情况2
.
3
提取mRNA
如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心 机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保 持清洁，并定期进行消毒。.操作过程中应自始至 终佩戴口罩和手套，并经常更换，以避免将手、 臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带 入试管或污染用具。操作过程所用器材都要经过 特殊处理。一次性枪头、离心管等塑料制品 采用 连续灭菌两次来灭活RNA酶。研钵 180℃ ，4h。
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9
解决方法
假阳性的原因及解决方法：可能引物设计不合适：选择的扩增序列与 非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产 物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需 重新设计引物。还有就是靶序列或扩增产物的交叉污染 。
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引 物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及 PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出 现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特 异性扩增。 其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调 换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。 ④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与
切胶回收PCR产物时，避免DNA在紫外线下暴露时间过长 从而形成嘧啶二聚体，造成PCR产物不能连接。
凝胶电泳检测纯化后的PCR产物的浓度，优化连接反应时 插入片段与载体摩尔比例为2:1~10:1（通常为3:1）。
PCR产物及载体应尽量避免反复冻融，否则易造成3’末端 残基的丢失。
一般连接25度2小时，16或4度过夜。
复苏。 （5）室温4,000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl
培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。注意： 细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。 （6）将平板置于室温直至液体被吸收。 （7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
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19
菌落PCR
此步以适应现代分子生物学实验室批量工作 的高效性，通常只需挑半个菌落直接作为模 板进行常规PCR就能初步检测阳性克隆。
所以此步对整个分子克隆都至关重要，可 适当用酚抽提、柱纯化，必要的话也可以 胶回收。
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酶切目的基因和载体
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12
酶切注意事项
两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切 完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温 要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同， 先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。 只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反 应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的 活性。
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酶切检测阳性克隆
另外酶切后纯化前，均需热灭活，以免残余的限 制性内切酶干扰后续连接反应，降低阳性率。
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回收前
酶切载体带 酶切目的条带
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Fra Baidu bibliotek
回收后
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连接
催化DNA中相邻的5′磷酸基和3′羟基末端之间形成磷酸二 酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接。
PCR产物最好进行切胶回收纯化，以去除PCR产物中的非 特异性片段和引物等杂质。
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转化
基本步骤： （1）将100μl感受态细胞于冰上解冻。 （2）取5μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以
混匀内容物。 在冰上放置30分钟。 （3）将管放入预加温到42℃的水浴中，热激90秒。快速将
管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2分钟。 （4）每管中加700μl LB培养基，37℃振荡培养1小时，进行
根据不同的目的，可有三类引物选择
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PCR得到目的基因
刚开始摸条件时，
都会先做一个梯
度PCR，选出最
适条件。
94
由于此步为获
温
度 72
取正确的目的基 （℃）
因，所以尽量避
55
免PCR的突变格
外重要。其中所
采取的措施有：
22
使用高保真酶、
循环次数控制在
300cycle左右、
引物设计合理等。
1
延伸)。
什么条带都没有，其原因可能是少加东西，酶已经失活了，或退火温 度太高等。解决方法：检查是否少加东西了，换一下酶，降低退火温 度或做个梯度，摸一下条件。
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PCR产物纯化
倘若直接对PCR产物进行酶切，体系的杂 蛋白、离子等会造成酶切困难或星活性， 残余的聚合酶也会填平粘性末端，造成克 隆失败。
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4
RT
由于真核基因是由非编码的内含子将ORF分隔开 来的断裂基因，若以基因组为模板PCR得到的片 段克隆进载体，不能在原核细胞剪接内含子，也 不能在非对象真核细胞中正确剪接表达。所以要 克隆真核蛋白基因，需以不含内含子的连续编码 的mRNA为模板。
PCR耐热酶不能直接以mRNA为模板扩增，必须 通过逆转录酶将mRNA逆转录为cDNA,再以cDNA 为模板扩增目的基因。
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3
高温变性 低温退火 适温延伸
形
DNA 2
成
条变 单性
子链延伸 DNA加倍
链
DNA单链
与引物复性
DNA双螺旋
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时间（min）
重复1~3步 25~30轮 目的DNA片段 扩增100万倍以上
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PCR常出现的问题
1.假阳性：出现的PCR扩增条带与目的靶序列条
带一致， 有时其条带更整齐，亮度更高 2.出现非特异性扩增带：PCR扩增后出现的条带 与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现 特异性扩增带与非特异性扩增带 3.什么条带都没有
注意将甘油的终浓度控制在10%以下，以避免出 现星号活性，可通过增加反应体系的总体积的方 法实现这一要求。
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酶切常见问题
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纯化酶切产物
通常此步是必要的，可以对比未经纯化的酶切产 物进行连接后获得的阳性克隆大大低于胶回收酶 切产物连接所得阳性克隆。
此步的目的是去除多余的片段，得到单一纯化的 目的基因与载体骨架，使之连接不受其他序列干 扰。
经典载体构建流程
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1
I 载体构建流程
RT
PCR
提取mRNA
cDNA
得到目的基因
PCR产物纯化
菌落PCR 转化 连接
纯化酶切产物
酶切目的基因和载体
保菌
挑取阳性克隆去测序
测序正确的摇菌提质粒
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导入表达宿主 测试表达情况2
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提取mRNA
如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心 机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保 持清洁，并定期进行消毒。.操作过程中应自始至 终佩戴口罩和手套，并经常更换，以避免将手、 臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带 入试管或污染用具。操作过程所用器材都要经过 特殊处理。一次性枪头、离心管等塑料制品 采用 连续灭菌两次来灭活RNA酶。研钵 180℃ ，4h。
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9
解决方法
假阳性的原因及解决方法：可能引物设计不合适：选择的扩增序列与 非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产 物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需 重新设计引物。还有就是靶序列或扩增产物的交叉污染 。
非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引 物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及 PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出 现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特 异性扩增。 其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调 换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。 ④适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性，65℃左右退火与
切胶回收PCR产物时，避免DNA在紫外线下暴露时间过长 从而形成嘧啶二聚体，造成PCR产物不能连接。
凝胶电泳检测纯化后的PCR产物的浓度，优化连接反应时 插入片段与载体摩尔比例为2:1~10:1（通常为3:1）。
PCR产物及载体应尽量避免反复冻融，否则易造成3’末端 残基的丢失。
一般连接25度2小时，16或4度过夜。
复苏。 （5）室温4,000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl
培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。注意： 细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。 （6）将平板置于室温直至液体被吸收。 （7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
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菌落PCR
此步以适应现代分子生物学实验室批量工作 的高效性，通常只需挑半个菌落直接作为模 板进行常规PCR就能初步检测阳性克隆。
所以此步对整个分子克隆都至关重要，可 适当用酚抽提、柱纯化，必要的话也可以 胶回收。
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酶切目的基因和载体
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酶切注意事项
两种酶切的条件不同时，分别进行两次酶切，切 完一个纯化后再切：温度要求不同，先酶切低温 要求的，再酶切高温要求的；若盐浓度要求不同， 先酶切低盐浓度要求的，再酶切高盐浓度要求的。 只要其中一种酶需要添加BSA，则应在双酶切反 应体系中加入BSA。BSA不会影响任何内切酶的 活性。