抗血清的制备
抗血清的制备
抗血清的制备在资讯栏目看到有关免疫血清的制备，跃跃欲试，希望能够和大家分享一下我关于抗血清的制备的实验，希望高手可以指点指点．(一)实验目的(1)了解抗血清制备的基本原理。
(2)掌握抗血清制备的操作步骤及方法。
(二)实验原理用具有抗原性的物质注入健康动物机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。
抗体主要存在于血清中，经一定次数注射，使血清中的抗体组达到要求浓度，然后采集动物血液，再从血液中分离出血清，从而获得抗血清。
为了获得特异性强，效价高的抗血清，除了抗原的因素外，还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、次数、间隔时间及注射途径等。
对于免疫原性较弱的可溶性抗原(如蛋白质类抗原)要加入佐剂，以增强免疫性。
本次实验是用颗粒性抗原(苏云金芽胞杆菌鞭毛及菌体抗原)制备相应的抗血清，这类抗原的免疫原性较强，不需加入佐剂也能获得特异性强、效价高的抗血清。
（三）实验器材(1)活材料：1)苏云金芽胞杆菌醋螟亚种(Bacillus thuringiensis subsp.galleria血清型H5ab)、加拿大变种(Bacillus thuringiensis var.canadensis 血清型H5ac)、库斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp.kurstaki血清型H3abc)未知血清型的苏云金芽胞杆菌。
2)动物家免(大耳白，2—3kg),健康雄性或未孕雌免。
(2)培养基：供试培养基的配方如表1所示。
表1 三种培养基配方培养基培养基配方牛肉膏/% 蛋白胨/% 氯化钠/% 琼脂/% pH值软琼脂培养基1.0 1.0 0.2 0.5 7.2摇瓶培养基1.0 1.0 0.2 / 7.2斜面培养基1.0 1.0 0.2 2.0 7.2(3)器材：注射器(5Ml)、针头(5号、12号)、剪刀、胶布、纱布、离心管、止血钳、刀片、l0mL吸管、带橡皮塞无菌试管、平皿、接种环、100mL三角瓶(带橡皮塞)、量筒、小动物解剖台、青霉素瓶、镊子、甲醛、碘酒棉球、酒精棉球、干棉球、麦氏比浊管、生理盐水等。
抗血清制备原理、步骤及应用
抗血清制备原理、步骤及应用抗血清是一种含有高效价特异性抗体的血清，一般为动物被人工注射某类抗原后制备的动物血清。
通过注射抗血清可以传递被动免疫治疗许多疾病。
一、抗血清制备原理：将抗原注射于动物体，将引起免疫应答。
可刺激动物的淋巴细胞转化为浆细胞并产生特异性抗体，待血清中积累大量抗体时，采集动物血液并分离析出血清，此即含抗体的免疫血清（抗血清）。
抗血清包括抗细菌、抗毒素、抗病毒血清。
二、抗血清制备步骤：1、选择免疫动物➢免疫动物一般选择青壮年期、健壮雌性个体。
➢抗原与免疫动物的种属差异越远越好。
➢针对不同性质的免疫原选择相应的动物。
➢制备H血清用马，制备R血清用兔，制备补体用豚鼠血清。
２、抗原制备➢抗原剂量：用灭菌生理盐水将抗原稀释为2mg/mL，与佐剂混合制成乳剂后用于动物免疫。
➢免疫原的注射剂量应考虑其抗原性的强弱、分子量大小、动物的个体状态和免疫时间。
通常小鼠首次抗原剂量为50～100μg/次，大鼠为100～200μg/次，兔为100～1mg/次，合成免疫原为2mg（半抗原约为20～200μg），一般需要与等量的福氏完全佐剂混合。
加强免疫原与福氏不完全佐剂混合或不用免疫佐剂，剂量为首次计量的1/2。
➢抗原乳剂的配制：将等量的佐剂与抗原溶液倒入钵内，经过反复碾磨，形成油包水乳剂。
制成的油包水乳剂直接影响免疫效果，因此使用前需进行质量检查。
检查方法是将制成的乳剂滴一滴在自来水表面，质量合格的乳剂滴入水面保持滴珠完整不分散，不合格的乳剂立即扩散，水面油亦逐渐扩大。
若检查不合格，则须继续操作至质量合格为止。
３、确定免疫方案➢根据免疫目的的要求、抗原性质、佐剂种类来制定免疫方案。
可采用全量免疫法、微量免疫法或混合免疫法。
免疫接种途径通常有静脉、腹腔、肌肉、皮下、淋巴结等接种途径，对抗原的吸收速度为静脉=腹腔=淋巴结＞肌肉＞皮下＞皮内。
若抗原宝贵可采用淋巴结内微量注射法；半抗原宜皮内多点注射。
免疫接种剂量应根据分子量大小、免疫原性强弱、动物个体状态和免疫时间决定。
免疫原和抗血清的制备
免疫原和抗血清的制备免疫原和抗血清的制备抗原和抗体是免疫反应的基本条件也是免疫检验的两大重要因素。
抗原是制备特异性抗体的前提条件，抗体可用于纯化抗原和检测抗原，也是医学检验中用于疾病诊断和研究的重要物质。
免疫原的制备免疫佐剂抗血清的制备抗血清的鉴定和保存抗血清的纯化颗粒性抗原的制备颗粒性抗原主要是指细胞抗原和细菌抗原,制备的方法较简单,通过分离或纯培养即可得到。
细胞抗原——绵羊红细胞。
细菌抗原——菌体O抗原。
可溶性抗原的制备可溶性抗原：蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、补体、细菌外毒素等。
（一）组织可溶性抗原的粗提（二）可溶性抗原的纯化（三）纯化抗原的鉴定（一）组织可溶性抗原的粗提1.组织均浆的制备：高速组织捣碎机法、研磨法；2.细胞的破碎：反复冻融法、超声破碎法、自溶法、酶处理法、表面活性剂处理法。
（二）可溶性抗原的提取和纯化1.超速离心法；2.选择性沉淀法：核酸去除法、盐析法、有机溶剂沉淀法、聚合物沉淀法；3.凝胶过滤法；4.离子交换层析法；5.亲和层析法；6.电泳法。
（三）纯化抗原的鉴定主要包括蛋白含量测定、分子量测定、纯度鉴定、免疫活性鉴定等。
半抗原性免疫原的制备半抗原只具有抗原性而无免疫原性；如某些多肽、多糖、激素、小分子量的药物等。
半抗原与蛋白质载体或高分子聚合物结合后才有免疫原性。
（一）载体1.蛋白质类：牛血白蛋白等；2.多肽聚合物：多聚赖氨酸等；3.大分子聚合物和某些颗粒：聚乙烯吡咯烷酮等。
（二）半抗原与载体的连接方法1.物理方法：通过电荷和微孔吸附半抗原，吸附的载体有淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、硫酸葡聚糖、羧甲基纤维素等。
2.化学方法：利用某些功能基团将半抗原连接到载体上。
如碳二亚胺法、戊二醛法等。
（三）半抗原性免疫原的鉴定与载体结合的半抗原数目与免疫原性密切相关。
所以，应测定半抗原与载体的比例，方法有：①吸收光谱分析法：②放射性核素标记半抗原渗入法。
免疫佐剂指先于抗原或与抗原同时注入体内，可增强机体对抗原的免疫应答的物质。
免疫原制备和抗血清的制备
免疫原制备和抗血清的制备免疫原制备和抗血清的制备是现代免疫学研究的重要内容之一、免疫原可以是一种物质，如微生物、细胞或其部分，也可以是一种化学物质，如蛋白质、糖类或核酸。
而抗血清则是通过动物体内或体外免疫方法获得的一种含有特异抗体的血清。
免疫原制备可以采用多种方法，最常见的方法之一是使用细菌或其他微生物制备免疫原。
先将目标微生物培养，然后进行离心、洗涤和破碎等处理，得到免疫原。
此外，还可以通过化学方法合成免疫原。
合成免疫原的方法通常是将所需的化学组分按照一定的顺序和比例进行化学反应，最终得到预期的免疫原。
免疫原的制备需要注意保持其生物活性和纯度，并进行适当的保存和贮存。
抗血清的制备需要选择适当的动物作为实验对象，如小鼠、兔等。
首先，将免疫原注入到动物体内，通过多次免疫，刺激动物产生特异性抗体。
其次，采集动物的血液，分离出血清，并进行清理和加工，最终得到抗血清。
清理和加工的过程主要包括疫苗净化、灭活处理、抗原提取和免疫原去除等步骤。
为了提高抗血清的特异性和效价，可以通过多次免疫和亲和层析等方法对抗血清进行增强。
免疫原制备和抗血清的制备在免疫学研究和临床诊断中具有重要的应用价值。
它们可以用于检测和诊断一些疾病的存在和发展，或用于治疗一些疾病。
例如，抗血清可以作为特异性抗体的源头，用于检测和鉴定病原体。
在流行病学调查中，通过检测血清中抗体的水平和类型，可以判断一些群体中其中一种病原体的暴露情况和传播链。
此外，利用抗血清可以对血型进行鉴定和配对，为输血和器官移植提供有力的支持。
总之，免疫原制备和抗血清的制备是现代免疫学研究中的关键技术。
通过合适的免疫原制备和动物免疫方法，可以获得高效的抗血清，并为疾病的检测、诊断和治疗提供重要的工具。
在未来的研究和应用中，我们可以期待这些技术的进一步发展和创新，以满足不断增长的免疫学需求。
抗血清制备
抗体是机体接受抗原刺激后产生的一种具有免疫特异性的球蛋白。
在免疫学实践，为制备抗体常以抗原性物质（细菌、病毒、类毒素、血清及其他蛋白质）给动物注射。
经过一定时间后，动物血清中可以产生大量的特异性抗体。
这种含有特异性抗体的血清称为免疫血清。
免疫血清不但对传染病的诊断、预防和治疗有重要意义，而且对器官移植，肿瘤以及某些科研工作也有重要意义。
抗体的产生通常与抗原的质和量、动物种类以及接种途径有密切关系。
因此在制备免疫血清时要根据抗原的不同选择适宜的动物种类和免疫方法。
一．抗菌血清的制备材料：1.动物：家兔2.菌种：伤寒杆菌H901，伤寒杆菌O9013.培养基：普通培养基4.其它：0.5%甲醛盐水，0.5%石灰酸盐水，无菌生理盐水，标准比浊管，离心机。
方法：1.抗原的制备：标准菌株的选择：所用的菌种伤寒杆菌H901和伤寒杆菌O901应具有典型形态菌落及生化反应。
在生理盐水中不发生自身凝集，与特异血清有高度凝集者可作为菌种。
2.菌液的制备Ⅰ.原液制备：H菌液的制备：将合格的伤寒杆菌H菌株接种于普通琼脂的克氏瓶或大试管内37℃孵育18—24小时。
肉眼观察有无杂菌生长，必要时作镜检。
用无菌甲醛生理盐水洗下菌苔，将洗下液体装入无菌试管内，置37℃恒温箱18—24小时以杀菌。
得到原液。
用作无菌试验即将菌液接种于肉汤及琼脂培养基培养4天，无活菌生长者才可使用。
O菌液的制备：将合格的伤寒杆菌H菌株依上法培养后，用无菌0.5%石灰酸盐水将菌苔洗下，洗液装入无菌试管置于37℃温箱中18—24小时杀菌得原液。
经检查无菌时可以使用（如无伤寒杆菌O菌株也可用H菌株制备O抗原。
即用0.5%石灰酸生理盐水洗下H菌菌液置100℃水浴60分钟，破坏其H抗原即为O菌液。
Ⅱ.应用液的制备：合格的原液用标准比浊管计算含菌落数目后，用生理盐水稀释至每毫升含菌10亿。
是为了应用液加入适量甲醛使其为0.25%，制备好的原液及应用液均保存在2—10℃冰箱中备用，有效期为1年。
常规抗血清的制备方法
离心
37。C摇动、 离心
1000rpm 由慢渐快1min、 1000rpm
10min 静止1.5min 7min
常规抗血清的制备方法
加入HAT培养 液悬浮细胞， 置于培养孔内
第21页
选择性培养
随机融合后细胞类型 HAT选择培养原理
常规抗血清的制备方法
第22页
随机融合后细胞类型
细胞组合
淋巴细胞 + 骨髓瘤 淋巴细胞 + 淋巴细胞 骨髓瘤 + 骨髓瘤 未融合淋巴细胞 未融合骨髓瘤常规抗血清的制备方法来自第28页多抗与单抗制剂比较
多抗
单抗
单抗
（血清） （腹水） （培养上清）
特异性抗体含量（mg/ml） 0.1-1
0.5-5 0.005-0.025
无关Ig含量（mg/ml）
10
0.5-1
—
其它血清蛋白
大量
极少
—
均一性
—
+
+
特异性
多决定簇 单决定簇 单决定簇
稳定性
很好
略差
略差
重复性
HGPRT
+ + — + —
生长状态
长久生长 短期生长 不能生长 短期生长 不能生长
常规抗血清的制备方法
第23页
核苷酸从头合成路径 （de novo synthesis）
核苷酸补救合成路径 （salvage synthesis）
氨基碟呤 （A）
HAT 核苷酸
次黄嘌呤 （H）
胸腺嘧 啶核苷 （T）
常规抗血清的制备方法
搜集时间：末次接种后72h
常规抗血清的制备方法
第18页
骨髓瘤细胞准备
抗血清制备 - 添加
抗血清制备抗原以常规的方法免疫家兔或小鼠获得相应的抗血清为多克隆抗体，不同的抗原和不同的动物，其免疫途径及抗原用量和免疫程序存在一定的差异，但步骤及方法大致类似。
初次免疫时，纯化的病毒以生理盐水稀释，与等量的弗氏完全佐剂进行乳化使之形成油包水乳剂，再次免疫使用弗氏不完全佐剂乳化，最后一次注射不需要佐剂乳化。
一．佐剂乳化将抗原（如病毒）按注射剂量用生理盐水稀释后加入等量的佐剂，漩涡震荡20min,超声波200w,工作时间2s,间歇时间10s,处理2-3次，取出20ul,滴到冰水混合物上，如果油滴三分钟内不扩散，则说明乳化成功。
二．免疫流程实验室437小鼠注射量按照60μg-60μg -60μg -90μg。
三．取血一般第三次免疫后隔两周采血，取阴性血清胃对照，以1/200 μg/μl浓度的病毒抗原包被，利用ELISA测其效价。
血清初次的稀释可按1/100 1/1000 1/10000 1/10000.....如果效价较低可按流程再加强免疫一次。
取血可用间断式割尾法或一次性摘眼球法，取后将血置于37℃保温1h,然后5000rpm 离心10min,取上清，加入万分之一的叠氮化钠-60℃保存。
腹腔注射【定义】：腹腔注射是将药物注入胃肠道浆膜以外，腹膜以内．其吸收速度较快（2小时左右）。
【适应症】：人不常应用，有时可以作为特殊治疗手段，如多巴胺、速尿联合腹腔注射治疗肝硬化顽固性腹水。
当猪只较小而难以寻找耳静脉时，或天冷皮肤血管收缩或猪处于贫血消瘦情况血管不明显时，可以通过腹腔注射补液．以防脱水死亡，因下痢脱水1/3以上即有生命危险．【操作步骤】：小鼠腹腔注射腹腔注射是常见的给药方式，尤其是在麻醉时。
常见的麻醉方法均是麻醉药物腹腔注射。
1. 小鼠腹腔注射可以用1ml的注射器，配合4号针头。
2. 腹腔注射时右手持注射器，左手的小指和无名指抓住小鼠的尾巴，另外三个手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下。
这样腹腔中的器官就会自然倒向胸部，防止注射器刺入时损伤大肠、小肠等器官。
第3章免疫原和抗血清的制备
第3章免疫原和抗血清的制备免疫原是指能够引起机体免疫反应并激发产生特异性抗体的物质。
抗血清是指动物或人体经过免疫后所产生的含有抗体的血清。
免疫原和抗血清的制备是研究免疫学和生物制剂开发的重要环节。
本文将探讨免疫原和抗血清制备的一般原则和步骤。
1.免疫原的选择选择合适的免疫原对于制备高效的抗血清至关重要。
一般来说，免疫原应具备以下特点：(1)纯度：免疫原应具有尽可能高的纯度，以避免其他成分对免疫反应的干扰。
(2)特异性：免疫原应具有与所需抗体特异性结合的能力，以激发特异性抗体的产生。
(3)免疫原性：免疫原应具有足够的免疫原性，即能够引起机体的免疫反应。
(4)安全性：免疫原应具备足够的安全性，避免潜在风险。
根据不同的应用需求，免疫原可以是多种类型的物质，如蛋白质、多肽、核酸和糖类等。
选择合适的免疫原需要根据研究目的和预期应用来确定。
2.免疫原的制备免疫原的制备通常分为化学合成和生物提取两种方式。
(1)化学合成：对于小分子的免疫原，可以通过化学合成的方法合成。
例如，对于多肽免疫原，可以设计并合成相应的多肽序列。
化学合成的优势在于可以精确控制免疫原的结构和纯度。
(2)生物提取：对于大分子的免疫原，如蛋白质和核酸，通常采用生物提取的方法。
蛋白质可以通过基因工程技术在大肠杆菌等表达系统中表达并纯化得到。
核酸可以通过DNA重组技术合成。
3.免疫反应的诱导免疫反应的诱导是指向机体注射免疫原以激发免疫反应。
免疫反应的诱导通常包括以下步骤：(1)免疫原的给药：将免疫原通过注射、给药或吸入等方式引入机体内。
(2)辅助剂的使用：为了增强免疫反应效果，通常会添加辅助剂。
辅助剂可改变免疫原的物理性质和免疫反应的过程。
(3)免疫程序的设计：根据需求设计免疫程序，包括免疫原的剂量、注射间隔和免疫次数等。
抗血清的制备是通过免疫动物或人体以获得抗体，从而制备含有抗体的血清。
一般来说，抗血清的制备包括以下步骤：(1)免疫动物的选择：选择合适的免疫动物，如小鼠、兔子或猴子等。
临床检验技师-临床免疫学和免疫检验(2019)讲义第三章免疫原和抗血清的制备
第三章免疫原和抗血清的制备第一节免疫原的制备免疫原指能诱导机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能在体内外与抗体或致敏淋巴细胞发生特异性反应的物质。
一、颗粒性抗原的制备细胞、细菌、寄生虫等皆为颗粒性抗原。
细胞抗原（如绵羊红细胞）一般情况下经生理盐水或其他溶液洗净，配制一定浓度即可。
细菌抗原多用液体或固体培养物，经集菌后处理。
颗粒性抗原大多用静脉内注射免疫法。
二、可溶性抗原的制备和纯化（一）组织和可溶性抗原的粗提蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶、补体、细菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等皆为良好的可溶性抗原。
1组.织匀浆的制备（1）高速组织捣碎机法；（2）研磨法：组织匀浆液要离心沉淀，沉淀物为组织和细胞碎片，上清液为提取可溶性抗原的材料。
2细.胞的破碎（）反复冻融法：℃冷冻，〜7融化。
（2）超声破碎法（3）自溶法（4）酶处理法：胃蛋白酶或胰酶。
（5）表面活性剂处理法：十二烷基硫酸钠。
3免.疫球蛋白片段的制备（）非共价键解离法：改变环境或用变性剂。
（2）共价键解离法：还原法或氧化法解离二硫键。
（3）溴化氰裂解法：溴化氰裂解蛋白质肽链。
（4）酶解法：木瓜蛋白酶、胃蛋白酶或胰蛋白酶。
（二）可溶性抗原的提纯和纯化超速离心法：适用于少数大分子抗原或比重较轻的抗原，不适用于大多数中小分子抗原。
选择性沉淀法：（1）核酸去除法：核糖核酸降解法更简便。
（2）盐析法：常采用硫酸铵使蛋白抗原进行粗筛、提取丙种球蛋白及抗原浓缩。
（3）有机溶剂沉淀法：常采用乙醇或丙酮。
（）聚合物沉淀法：常用非离子型聚合物，如聚乙二醇（）G凝胶过滤法：根据分子大小进行分离纯化。
离子交换层析法：利用一些带电离子基团的凝胶或纤维素，吸附带有相反电荷的蛋白质抗原。
5亲.和层析法：与生物分子间不同的亲和性进行分离。
如抗原和抗体、酶和酶抑制物、酶蛋白和辅酶、激素和受体等。
电泳法：蛋白质在同一环境中，分子量和电荷不同，在电场中迁移速率不同进行分离。
（三）纯化抗原的鉴定蛋白质含量测定：常用的是紫外光吸收法，该法测定和的吸光度（）值。
抗血清 的制备
抗血清的制备抗血清制备是一种常见的免疫学实验技术，用于检测特定物质的存在和数量。
下面将对抗血清制备的原理、步骤及注意事项进行详细介绍。
一、原理抗血清是由动物免疫某种抗原制备得到的一种免疫血清，其中包含了特异性抗体。
抗血清制备的原理是通过注射一定量的特异性抗原到动物体内，使其产生特异性抗体，然后收集抗血清。
二、材料和试剂1.抗原：需要制备抗血清的特定抗原。
2.兔、小鼠等动物。
3.盐酸：用于调整兔抗血清的pH值。
4.取血器：用于采集动物血液。
5.离心管、离心机：用于收集血清。
6.不含菌的容器：用于保存抗血清。
三、步骤根据实验要求，制备特定抗原，可以是蛋白质、细胞、病毒、细菌等。
2.制作与抗原相应的抗体兔/小鼠选择适宜种类的动物，注射免疫原，隔一段时间后，在动物体内试验特异性抗体的出现，出现后即可采血制血清。
一般来讲，兔子被认为是制备抗血清的最佳动物，而小鼠常常会出现交叉反应。
3.采集兔血液注射完最后一次免疫原后一周左右，在一个清洁的容器上臂处用取血器采血2-3ml。
离心采集到的兔血液，定量将其分离出血清，再加入盐酸，调节pH值，即可得到兔抗血清。
5.评价抗血清的质量评价抗血清的质量，主要是通过测定抗体滴度来判断抗血清的特异性和强度。
四、注意事项1.严格控制免疫原和免疫过程，确保抗原和抗体的特异性和纯度。
2.合理选择免疫动物种类，不同种类免疫动物会对抗原产生不同反应。
3.采血时要注意安全和卫生，防止感染病毒和细菌。
4.在制备抗血清的过程中需要注意保护动物的健康和福利，并严格按照实验室安全规范操作。
抗血清制备
抗血清制备抗血清是一种广泛应用于医学、生物学、农业等领域的重要抗体。
它可以通过对动物实验的刺激来制备，具有较高的特异性和灵敏性。
本文将介绍抗血清的制备过程和应用领域。
一、抗血清的制备抗血清的制备需要对动物实验进行免疫刺激，让其产生免疫反应，生成相应的抗体。
制备抗体的方法有多种，包括:1. 多次免疫法：将抗原与适当的佐剂混合后注射给动物，每次注射间隔时间大于1个星期。
免疫周期主要根据抗原型以及免疫状态来确定。
一般情况下，需要多次免疫才能达到所需的浓度。
2. 单次免疫法：在抗原一侧布局NMDA表达杂交的细胞，给兔子单偏免疫或初免疫后再进行免疫，以提高抗体效价。
3. 聚集物制备法：将抗原加入雄鹰蛋白中，然后注射到家兔或小猪体内，以选育出抗体。
以上三种方法都有它们的优缺点，适用于不同的条件下。
二、抗血清的应用抗体在医学、生物学、农业等领域都有广泛的应用。
以下是一些常见的应用领域：1. 诊断：通过抗血清与疾病相关物质的特异性结合可以进行诊断，如HIV、狂犬病、乙肝等病毒感染的检测。
2. 治疗：抗体被广泛应用于治疗各种疾病，如肿瘤、自身免疫性疾病、传染病等。
3. 细胞学：抗体可用于细胞学实验，用于检测细胞内、细胞表面或细胞核内的成分，如检测肿瘤细胞、细胞分离、特定蛋白识别等。
4. 农业：抗血清可用于畜牧业和农业生产，如检测动物或植物病毒感染、食品中添加的污染物等。
三、注意事项在制备抗血清时，需要注意以下几点：1. 选择优质的抗原，并进行适当的保护、存储。
2. 用药量应适当，尽量不要过多。
3. 对免疫动物的饲养和体温要求高。
4. 在注射时要注意卫生和安全问题，防止交叉感染。
5. 制备后需要进行充分的检测和鉴定，以确定抗体的特异性和效价。
抗血清的制备是一项重要的实验技术，应用领域广泛，但同时也需要谨慎和责任心。
只有严格遵守操作规定和注意事项，才能制备出优质的抗血清，促进科学的发展。
免疫学实验论文——抗血清的制备及效价测定
免疫学实验抗血清的制备及其效价测定班级：生物技术1401小组：11姓名：2016年11月抗血清的制备及免疫小鼠效价检测摘要：本试验以牛血清白蛋白为抗原，对小鼠和家兔进行免疫，以制备高效价抗血清。
采用多次中程免疫使产生免疫应答小鼠的血清中抗体达到实验所需的要求，然后采集小鼠血液，从中分离出血清，从而获得抗血清。
利用间接ELISA 方法测得抗血清效价。
关键词：抗血清；间接法ELISA ；抗体效价前言：用具有抗原性的物质（牛血清白蛋白BSA ）注入到健康小鼠的机体后，将引起免疫应答，并会形成浆细胞，分泌抗体。
抗体主要存在于血清中，经三次免疫，使血清中的抗体量达到要求浓度，然后采集小鼠血液，再从血液中分离析出血清，从而获得抗血清。
酶联免疫吸附实验（ELISA ）是一种新型的免疫测定技术，利用间接ELISA 法，将抗原BSA 包被在酶标板上，加入待测的抗体，再加相应的二抗，生成复合物后再加入底物显色，借助仪器测得的光吸收值计算抗体效价。
材料与方法：实验主线：实验材料：包被缓冲液（0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液）、10ug/ml 抗原（牛血清白蛋白）、0.01M PBS 溶液、5%（w/v ）脱脂奶粉、PBST 洗涤液（含0.05%Tween 20的0.01M 的PBS ）、2M H2SO4、待测抗体、HRP 标记的羊抗小鼠IgG （二抗）、底物溶液TMB 、健康小鼠酶标板、酶标仪、保鲜膜、排枪、离心管、玻璃棒、烧杯、离心机、恒温箱动物免疫抗血清的采集与分离中程免疫3次间隔一周间接法ELISA 测定抗血清的效多克隆抗体实验内容与方法：一．动物的免疫：1.1实验动物的选择选择实验动物应考虑抗原与动物的种属关系、抗原性质与动物种类、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及动物个体等因素。
选择与抗原亲缘关系远的动物，尤其在制备抗免疫球蛋白（Ig）抗体时；根据抗体的需要量选择动物，制备一抗常用动物为小鼠和家兔，制备二抗常用动物为羊和马；常用青壮年期的雄性动物。
实验一抗血清制备
磷酸盐缓冲液用于调节溶液的酸碱度，维持实验环境的稳定。
04
实验步骤
免疫原制备与注射
免疫原制备
根据实验需求，选择适当的抗原，进行适当的处理和纯化，确保抗原的纯度和浓度符合实验要求。
详细描述
本实验采用了ELISA方法，将抗血清与抗原进行反应，通过酶标仪检测反应后的吸光度值，计算出抗血清的效价。 实验结果表明，制备的抗血清具有较高的效价，能够与抗原特异性结合。
抗血清的纯度分析
总结词
通过电泳、色谱等技术分析抗血清中杂 蛋白的含量，评估抗血清的纯度。
VS
详细描述
本实验采用了SDS-PAGE电泳和离子交换 色谱技术，对抗血清进行纯度分析。实验 结果表明，制备的抗血清中杂蛋白含量较 低，纯度较高，符合实验要求。
免疫注射
将制备好的免疫原注射到实验动物体内，通常采用皮下注射或肌肉注射的方式，注射后观察动物反应 ，确保免疫原安全有效。
免疫血清的分离与收集
血清分离
在免疫注射一定时间后，无菌采集动物血液，分离出血清，去除红细胞和杂质。
血清收集
根据实验需求，收集不同时间点的血清样本，记录采集时间和量，确保血清的质 量和可追溯性。
免疫原是指能够刺激机体免疫系统产 生特异性免疫应答的物质，通常为微 生物或其代谢产物、人工合成的多肽 等。
在抗血清制备实验中，免疫原需要经 过适当的处理和修饰，以提高其免疫 原性。常见的处理方法包括加热、化 学偶联、放射性标记等。
实验试剂：生理盐水、佐剂、磷酸盐缓冲液等
生理盐水是常用的稀释液，用于将免疫原和佐剂稀释到适当的浓度。
抗血清的制备
抗血清的制备原理：抗血清为含有某一类具有特异免疫功能的抗体分子的血清，一般为动物被人工注射某类抗原后制备的动物血清。
高效价的抗血清用于研究工作以及疾病的诊断和治疗。
一般完全抗原免疫动物需加用佐剂，使用佐剂后可增加抗原的免疫原性和延长抗原在机体内存留的时间，从而改变了抗原原有的免疫原性。
材料：1、苦味酸染料；2、1毫升注射器；3、EP管、刀片；4、福氏完全佐剂（Freund ’s complete adjuvant）；福氏不完全佐剂（Freund’s discomplete adjuvant）5、抗原（本课题组所用抗原为重组蛋白Eg-TPX(his)/rGST(his)/EPC1(his)）；6、无菌PBS，消毒用酒精、无菌棉球；7、实验动物（昆明白小鼠）。
步骤1、动物的选择课题组选用18g-20g昆明白小鼠进行免疫。
2、抗原制备1）抗原剂量:首次抗原剂量为20～25μg/次，与等量的福氏完全佐剂混合，抗原乳剂200ul。
加强免疫抗原与不完全福氏佐剂混合，剂量为首次计量的1/2。
2）抗原乳剂的配制将等量的佐剂和抗原溶液倒入容积内，经过蛋白搅拌器反复碾磨，可形成油包水乳剂。
制成的乳剂是否形成油包水乳剂直接影响免疫效果，检查方法是将制成的乳剂滴一滴在自来水表面，质量合格的乳剂滴入水面保持滴珠完整基本不分散，不合格的则立即扩散，水面油亦逐渐扩大，须继续操作至质量合格为止。
检查合格后，离心，2500r,5min.3、免疫途径，剂量和免疫周期免疫方案为抗原皮下多点注射进行基础免疫；再以免疫原作多次加强免疫，一般间隔2周，皮下或腹腔注射加强免疫。
具体时间如下表所示：免疫时间免疫次数免疫途径抗原免疫剂量第一周第一次背部皮下多点注射重组蛋白+福氏完全佐剂20~25ug 第三周第二次腹部皮下多点注射重组蛋白+福氏不完全佐剂10~12.5ug 第五周第三次腹腔注射重组蛋白+福氏不完全佐剂10~12.5ug 第七周第四次腹腔注射重组蛋白+福氏不完全佐剂10~12.5ug 第九周第五次腹腔注射重组蛋白+福氏不完全佐剂10~12.5ug ……腹腔注射重组蛋白+福氏不完全佐剂10~12.5ug 第N周第N次腹腔注射重组蛋白+福氏不完全佐剂10~12.5ug4、试血测定抗体效价一般在第三次免疫后3天即可小鼠尾尖取少量血，分离血清后通过间接法测定抗体效价。
抗血清的制备[整理版]
![抗血清的制备[整理版]](https://img.taocdn.com/s3/m/8eb8abc648649b6648d7c1c708a1284ac8500502.png)
植物病毒抗血清的制备一、目的制备植物病毒抗血清是用提纯病毒作为抗原，注射兔子后刺激产生免疫反应，形成抗体的过程。
分为抗原准备、免疫注射和抗血清的采集三部分。
本实验介绍常用方法，要求能基本掌握并获得抗血清。
二、材料和用具提纯病毒悬浮液、3kg公兔、高压灭菌锅、磁力搅拌器；医用羊毛脂、石蜡油、70%乙醇、二甲苯、NaN3、凡士林；用具：注射器、注射针头、小烧杯、三角瓶、透析袋、刀片、脱脂棉、青霉素小瓶、转子。
三、操作程序和方法1. 处理提纯病毒悬浮液：如用精提纯病毒，浓度为1mg/ml，如保存病毒时所用缓冲液浓度高或含有其他高渗透压物质如尿素等，则可用pH7.2的0.01M磷酸缓冲液透析三次（其中－次必须过夜），如病毒悬浮液中加过NaN3，则必须延长透析时间和增加次数。
2. 制备Freund's不完全佐剂：在小烧杯中放入1.5g羊毛脂和8ml石蜡油，在温水浴中化开，磁力搅拌器上混匀后经高压灭菌后4℃下保存备用。
3. 将佐剂倒入小烧杯中，在磁力搅拌下按1：1量逐滴加入病毒悬浮液，充分搅拌至乳化完全，病毒液1mg/ml含量每次用2－5mg。
(将病毒悬浮液和佐剂在小烧杯中１：１等量混合，用注射器和针头反复推吸以使乳化完全也可)。
检测乳化程度时可滴一滴乳化液至水面，如很快散开则乳化不完全，须继续乳化；如能持续片刻不散开则为乳化完全。
4. 兔子以个大(2－3kg)、健康、未经免疫的白兔为好，选用公兔或未交配过的母兔均可。
5. 免疫：根据不同病毒的稳定性和免疫原性，可有多种注射方法与不同间隔的方案，本实验采用肌肉注射。
在兔子后腿外或内侧肌肉上选肥厚处，剪毛后，用70%乙醇消毒、以9号针头注入病毒-佐剂乳化液，进针约深2cm。
注射剂量视其具体情况而定。
本实验免疫具体设计如下：第一周：(1).耳静脉取血，制备少量正常血清；(2) 肌肉注射乳化病毒2/3量，皮下三点注射1/3量。
第二周：肌肉、皮下注射，用量如上。
抗血清制备教案范文
抗血清制备教案范文一、教学目标：1.了解抗血清的定义和制备的原理；2.掌握抗血清制备的步骤和操作方法；3.培养学生的实验技能和科学研究思维。
二、教学重点：1.抗血清的概念和制备原理；2.抗血清制备的步骤和操作要点。
三、教学内容：1.抗血清的概念与原理：抗血清是指人或动物体内产生的针对特定抗原的抗体。
抗体是机体免疫系统对抗原刺激产生的一种免疫物质，可以与抗原特异性结合并发生抗原-抗体反应。
制备抗血清的原理是通过注射抗原刺激免疫系统产生特异性抗体，然后收集免疫动物血清中的抗体。
2.抗血清制备的步骤：(1)抗原选择：根据需要制备抗体的种类和特定性，选择合适的抗原进行制备。
抗原可以是细菌、病毒等生物体或其部分。
(2)免疫动物选择：选择适合的免疫动物，如兔、小鼠等，进行免疫。
免疫动物应该具备强大的免疫功能，同时也要考虑到制备过程对动物的安全和福利。
(3)免疫方案制定：确定合理的免疫计划，包括抗原的剂量、免疫次数和免疫间隔时间。
在制定方案时需考虑到免疫动物的生理特点和个体差异。
(4)抗原注射：按照免疫方案将合适剂量的抗原注射到免疫动物体内。
注射部位可以选择腹腔、皮下等，注射后应观察动物是否出现免疫反应。
(5)血清收集：在免疫后适当的时间，通过静脉取血的方式收集免疫动物的血清。
血清应该保持无菌，避免出现任何污染。
(6)血清处理：将收集到的血清进行一定的处理，如离心去除细胞，收集上清液。
处理后的血清可以直接使用或进行冻存保存。
(7)抗血清效价测定：通过适当的方法测定抗血清的效价，评估抗体的含量和活性。
四、教学方法：1.讲授方法：通过课堂讲授的方式，讲解抗血清的定义、制备原理和步骤等内容。
2.实验操作方法：通过模拟实验或实际操作的方式，让学生学习抗血清制备的具体步骤和技巧。
五、教学评价：1.练习题：设计适当的练习题，考察学生对抗血清制备的理解和应用能力。
2.实验报告：要求学生针对抗血清制备实验进行实验报告，包括实验目的、步骤、结果和分析等内容。
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抗血清的制备
有了质量好的抗原，还必须选择适当的免疫途径，才能产生质量好（特异性强和效价高）的抗体。
用于免疫的动物
作免疫用的动物有哺乳类和禽类，主要为羊、马、家兔、猴、猪、豚鼠、鸡等，实验室常用者为家兔、山羊和豚鼠等。
动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量，如一般制备抗r-免疫球蛋白抗血清，多用家兔和山羊，因动物反应良好，而且能够提供足够数量的血清，用于免疫的动物应适龄，健壮，无感染性疾患，最好为///雄性，此外还需十分注意动物的饲养，以消除动物的个体差异以及在免疫过程中死亡的影响。
若用兔，最好用纯种新西兰兔，一组三只，兔的体重以2～3kg为宜。
免疫途径
免疫途径有多种多样，如静脉内、腹腔内、肌肉内、皮内、皮下、淋巴结内注射等，一般常用皮下或背部多点皮内注射，每点注射0.1ml左右。
途径的选择决定于抗原的生物学特性和理化特性，如激素、酶、毒素等生物学活性抗原，一般不宜采用静脉注射。
佐剂
由于不同个体对同一抗原的反应性不同，而且不同抗原产生免疫反应的能力也有强有弱，因此常常在注射抗原的同时，加入能增强抗原的抗原性物质，以刺激机体产生较强的免疫反应，这种物质称为免疫佐剂。
佐剂除了延长抗原在体内的存留时间，增加抗原刺激作用外，更主要的是，它能刺激网状内皮系统，使参与免疫反应的免疫活性细胞增多，促进T细胞与B细胞的相互作用，从而增强机体对抗原的细胞免疫和抗体的产生。
常用的佐剂是福氏佐剂（Freund adjuvant）,其成分通常是羊毛脂1份、石腊油5份，羊毛脂与石腊油的比例，视需要可调整为1：2～9（V/V），这是不完全福氏佐剂，在每毫升不完全佐剂加入1～20mg卡介苗就成为完全佐剂。
配制方法：按比例将羊毛脂与石蜡油置容器内，用超声波使之混匀，高压灭菌，置4℃下保存备用。
免疫前取等容积完全或不完全佐剂与免疫原溶液混合，用振荡器混匀成乳状，也可以在免疫前取需要量佐剂置乳钵中研磨，均匀后再边磨边滴加入等容积抗原液（其中加卡介苗3～4mg/ml或不加），加完后再继续研磨成乳剂，滴于冰水上5～10min内完全不扩散为止。
为避免损失抗原，亦可用一注射器装抗原液，另一注射器装佐剂，二者以聚乙烯塑料管连接，然后二者来回反复抽吸，约数十分钟后即能完全乳化。
检查合格后即以其中一注射器作注射用。
免疫方法
抗原剂量，首次剂量为300～500μg，加强免疫的剂量约为首次剂量为1/4左右。
每2～3周加强免疫一次。
加强免疫时用不完全佐剂，首次免疫时皮下注射百日咳疫苗0.5ml，加强免疫时不必注射百日咳疫苗。
在第2次加强免疫后2周，从耳缘静脉取2～3ml血，制备血清，检测抗体效价（见后）。
如未达到预期效价，需再进行加强免疫，直到满意时为止。
当抗体效价达到预期水平时，即可放血制备抗血清。
抗血清的采集与保存
家兔是最常用以产生抗体的动物，因此这里主要讨论兔血的收集。
羊等较大动物以颈静脉、动脉取血，鼠等小动物取血可参阅有关资料。
取兔血有两种方法，一是耳缘静脉或耳动脉放血，一是颈动脉入血，也可心脏采血。
取动脉或静脉放血时，将兔放入一个特造的木匣或笼内，耳露于箱（笼）外，也可由另一人捉住兔身。
剪去耳缘的毛，用少许二甲苯涂抹耳廓，30s后，耳血管扩张、充血。
用手轻拉耳尖，以单面剃须刀或尖的手术刀片，快速切开动脉或静脉，血液即流出，每次可收集30～40ml 。
然后用棉球压迫止血，凝血后洗去二甲苯。
二星期后，可在另一耳放血。
此法可反复多次放血。
颈动脉放血时，将兔仰卧，固定于兔台，剪去颈部的毛，切开皮肤，暴露颈动脉，插管，放血。
放血过程中要严格按无菌要求进行。
收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，过夜（切勿冰冻）析出血清，离心，4000rpm,10min。
在无菌条件，吸出血清，分装（0.05～0.2ml），贮于-40℃以下冰箱，或冻干后贮存于4。
C冰箱保存。
抗血清质量的评价
在免疫期间，不仅各个不同的动物，而且同一动物在不同的时间内抗血清效价、特异性、亲合力等都可能发生变化，因而必须经常地采血测试。
只有在对抗血清的效价、特异性、亲合力等方面作彻底的评价后，才可使用所取得的抗血清。
1．效价抗血清的效价，就是指血清中所含抗体的浓度或含量。
效价测定的方法常用的是放射免疫法，此法对所有的抗体均适用。
某些由大分子（如蛋白类）抗原所产生的抗体，可用双扩散等方法测定。
前者测定的效价极为精确。
而后者则粗糙得多。
（1）放射免疫法：以不同稀释度的抗血清与优质标记抗原混合，孵育24h后，测定其结合率。
通常以结合率为50%的血清稀度和为效价。
如某抗血清的结合率为50%时的稀释度为1：15000，则该血清的效价就是1：15000。
抗血清的效价，除由抗血清本身的性质决定外，还受标记抗原的质量、孵育时间，所用稀释液的成分及其pH等因素的影响，在工作中必须引起注意。
（2）双向扩散法：利用大分子抗原和抗体在琼脂平板上扩散，两者在相交处产生沉淀线，以观察和判断抗血清中是否有抗体及其浓度。
球脂板的制备：100ml pH7.1 的磷酸盐缓冲液加到15g的琼脂内，于水浴中加温，搅拌，使琼脂完全溶解，趁热用纱布过滤，待溶液冷却到65℃左右时，加入叠氮钠（NaN3），使其在溶液中的浓度为0.1%。
用移液管把琼脂放在干净平皿或玻片上，约3mm厚，待其冷却，
完全凝固后，用打孔器打孔。
中央孔内加适量抗原（容量为50μl），周围各孔内分别加入50μl 1：2、1：4、1：8、1：16、1：32及不稀释的抗血清，37℃下孵育24h，观察有无沉淀线产生，以判断血清的稀释度。
2．特异性测定抗血清的特异性或称专一性是指抗血清对相应的抗原及近似的抗原物质的识别能力。
特异性好就是抗血清的识别能力强。
通常，特异性是以交叉反应率来表示的。
交叉反应率低，表示抗血清的特异性好，反之则特异性差。
交叉反应率一般是用竞争抑制曲线来判断的。
以不同浓度的抗原和近似抗原物质分别做竞争抑制曲线，计算各自的结合率（B/T或B/B0），求出各自在IC50时的浓度，按下列公式计算交叉反应率。
S=y/Z×100%
S：交叉反应率，y：IC50时抗原浓度，Z：IC50时近似抗原物质的浓度。
如某抗原的IC50浓度为90Pg/管，而一些近似抗原物质IC50浓度几乎是无限大，可以说这一抗血清与其它抗原物质的交叉反应率近似零，即无交叉反应，该抗血清的特异性是好的。
3．亲合力在免疫学中，亲合力是指抗体与结合抗原体的活度或牢固度。
抗体与抗原结合疏松，结合后会迅速解离，称为亲合力低，反之，亲合力高。
亲合力的高低是由抗原分子的大小，抗体分子的结合位点与抗原的决定基之间的立体结构型的合适程度决定的。
亲合力常以亲合常数K表示。
K的单位是升/摩尔（L/mol）。
在RIA中，K是该抗血清能达到的最小检出量（灵敏度）的倒数，K=1/[H]，[H]是最小检出量，通常，K的范围在108～1012L/mol之间，也有高达1014L/mol的。
计算亲合常数的方法20余种，计算出的K都不能真实反映实验情况，只能作为参考。
免疫失败的可能原因及应采取的措施
有时不能获得满意的抗血清，可从下列几方面找原因，并改进之。
（1）免疫动物的种属及品系是否合适，可考虑改变动物的种属或品系，或扩大免疫动物的数量。
（2）抗原质量是否良好，可改用其它厂家的产品或改用同一厂家的其它批号，也可考虑改变抗原分子的部分结构，或改进提取方法。
（3）制备的免疫原是否符合要求，可从偶联剂，载体、抗原或载体的比例、反应时间等多方面去考虑，并加以改进。
（4）所用的佐剂是否合适，乳化是否完全，可改用其它佐剂，或加强乳化。
（5）免疫的方法、剂量，加强免疫的间隔时间和次数，免疫的途径是否合适。
（6）动物的饲养是否得当，如营养（饲料、饮水）、环境卫生（通风、采光、温度）是否符合要求，动物的健康情况是否良好等。