骨碎补提取工艺的实验研究
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16
11 卷
辽宁中医药大学学报
nm 处测定并计算柚皮苷的含量。见表 2。
2.4 骨碎补总黄酮的含量测定 [4]
2.4.1 标准曲线的制备 分别吸取对照品 0.0、0.5、
1.0、1.5、2.5、3.0mL 于 10mL 容 量 瓶 中，甲 醇 定 容 至
刻 度，在 283nm 处 测 定 吸 收 度，经 回 归 得 标 准 曲
乙醇浓度、溶媒用量提取时间提取次数 4 个因素进 行考察，每个因素取 3 个水平，按 L9(34) 正交表进行
实验，见表 1。 表 1 骨碎补醇提工艺因素水平
水平
1 2 3
A 乙醇浓度 (%)
45 50 55
B 溶媒用量 (倍)
10 12 14
C 提取时间 (时)
1 2 3
D 提取次数 (次)
1 2 3
21 2
2
2 7.85 26.7374 12.9032
31 3
3
3 8.21 27.0413 14.7170
42 1
2
3 7.75 26.5892 12.1113
52 2
3
1 5.32 25.9004 9.3120
62 3
1
2 6.48 26.5012 11.7131
73 1
3
2 7.25 26.3542 10.6013
40%、50%、60%、70%、80%、90% 的乙醇提取 2 次，每
次 2min，结果表明选用 50% 的乙醇提取时柚皮苷的
含量明显高于其他浓度，故正交试验中选择 45%、
50%、55%3 个浓度水平进行试验。
（4）骨碎补中主要成分柚皮苷的熔点为 83℃，
故在浓缩及干燥过程中控制温度在了 70℃，以防止
有效成分的损失。◆
参考文献
[ 1 ] 周铜水，周荣汉，刘晓东 . 骨碎补对大鼠实验性骨折损伤愈合 的影响 [ J ] . 中草药，1994，25 ( 5 )：249.
总 k1 11.942 10.307 11.114 9.076
黄 k2 11.045 11.879 11.575 11.739
酮 k3 11.244 12.046 11.543 13.416
R 0.897 1.739 0.461 4.340
表 3 柚皮苷的方差分析
方差来源 偏差平方和 自由度 平均偏差平方和 F 比 显著性
Referring to the content of total flavonoids and Naringin，we study the condition of the extraction of Drynaria fortunei(Kunze) J. Sm. with the method of Orthogonal design. Results:The extraction times is the key fator; the dosage of menstruum is the subordination factor; the time cost in extraction and consitence of etnanol is the most subordination factor.Conclusions: The optimum extraction is as follows adding 14 times of 55% ethanol into Drynaria fortunei(Kunze) J. Sm.，boiling for 2 hours each time and extracting three times in all.
B
5.527
2
2.7635
4.149
C
0.398
2
0.199
0.299
D
28.745
2
14.3725 21.580 P<0.01
E
1.33
9
注：F0.05(2,9)=4.26，F0.01(2,9)=8.02。
柚皮苷的方差结果分析表明，因素 B、D 对骨碎
补中柚皮苷的提取具有极显著的影响，因素 A、C 则
83 2
1
3 8.22 26.9894 13.4211
93 3
2
1 7.05 26.1332 9.7091
柚 k1 26.395 26.116 26.299 25.813
皮 k2 26.330 26.542 26.487 26.531
苷 k3 26.492 26.559 26.432 26.873
R 0.162 0.443 0.188 1.060
摘 要：目的：优选骨碎补提取的最佳工艺条件。方法：以骨碎补中柚皮苷及骨碎补总黄酮的含量为指标，采
用 L9(34) 正交设计法对骨碎补的提取条件进行研究。结果：提取次数是骨碎补有效成分提取的关键因素 , 其次是
溶媒用量，提取时间和乙醇浓度为最次要因素。结论：最佳提取工艺条件是 14 倍量 55% 乙醇回流提取 3 次 ,2 h/ 次。
仪器 752 型分光光度计 ;Waters 600-2487 高效 液 相 色 谱 仪 ;METTLER TOLEDO AG135 型 电 子 天 平。 2 试验方法与结果
2.1 色谱条件 色 谱 柱：Kromasil C18 5μm(4.6mm×200mm);
流 动 相：甲 醇 - 醋 酸 - 水（35：4：65）；流 速：1.0 mL·min-1；检测波长 :283nm; 柱温 :27℃。 2.2 正交实验方法 2.2.1 实验因素与水平 通过预试验考察，确定以
线 方 程 为：A=16.98C+0.16(r=0.9995), 线 性 范 围 为
0~0.036mg/mL。
2.4.2 样品溶液的制备及测定 分别精密称取骨碎
补细粉 3mg 于 10mL 的容量瓶中，甲醇溶解并定容至
刻度，精密吸取 1mL 于 10mL 容量瓶中，甲醇定容至
刻度，于 283nm 处测定吸收度 A, 按回归方程计算骨
2.2.2 L9(34) 正交实验 每份取砂烫骨碎补（过 40 目筛）50g，按 L9(34) 正交表进行提取，将提取液合并， 过滤，回收乙醇并干燥成膏，计算出膏率。（见表 2）
2.3 柚皮苷的含量测定
《中 华 人 民 共 和 国 药 典》2005 年 版 Ⅰ 部 骨 碎 补药材项下的柚皮苷的含量测定规定 [3]，以 Waters
关键词：骨碎补；柚皮苷；骨碎补总黄酮；HPLC；正交设计
中图分类号：G424.31
文献标识码：A
文章编号：1673-842X (2009) 12-0016- 02
Reserch on Extraction of Drynaria Fortunei(Kunze) J. Sm. with Method of Orthogonal Design QUAN Hong，GUO Chun-qiu，QU Qian-wen，WANG Shu-ping
3 结果与讨论
（1）现代研究表明，骨碎补能增强成骨细胞活
性、提高骨密度、维持骨微结构的完整程度，是肾主
骨生髓的物质基础之一 [5]。骨碎补经砂烫、酒制、盐
制后 , 并不影响总黄酮及柚皮苷含量 , 却有利于有效
成分的溶出 [4]，故笔者选择砂烫的骨碎补来进行提
取，以便提高骨碎补中柚皮苷的提取率。
（2）结果表明 , 工艺 A3B3C2D3 的柚皮苷含量
600-2487 高效液相色谱仪测定骨碎补各样品中的
柚皮苷含量。
2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取在 105℃下干
燥至恒重的柚皮苷对照品 6mg，置 50mL 容量瓶中， 加甲醇适量使其溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照
品溶液。
取对照品溶液 5mL 至 10mL 容量瓶中，甲醇定
容至刻度（浓度为 60μg/mL），摇匀即得对照品溶液
A
0.040
2
0.020
1.000
B
0.377
2
0.1885 9.425 P<0.05
C
0.056
2
0.028
1.400
D
1.757
2
0.8785 43.925 P<0.01
E
0.04
9
表 4 总黄酮的方差分析表
方差来源 偏差平方和 自由度 平均偏差平方和 F 比 显著性
A
1.332
2
0.666
1.000
碎补总黄酮的含量。见表 2。
2.5 实验结果及分析
2.5.1 正交实验结果进行方差分析 见表 2~ 表 4。
表 2 骨碎补提取的正交实验表 L9(34)
试验号 A B
CD
出膏率 柚皮苷 总黄酮
(﹪) (C,μg·mL-1) (C,mg·mL-1)
11 1
1
1 4.99 25.4056 8.2070
的稀释液。
2.3.2 供 试 品 溶 液 的 制 备 及 测 定 分 别 精 密 称 取
骨碎补细粉 3mg 于 10mL 的容量瓶中，加甲醇适量使 其溶解并稀释至刻度，摇匀即得。分别吸取对照稀
释液和供试品溶液各 10μL 注入液相色谱仪，于 283
收稿日期：2009-06-01 作者简介：全红（1950-），女，研究员，研究方向：中药新剂型、新工艺研究。 通讯作者：王术平（1957-），女，教授，主要从事中医工程研究及妇科的教学、科研与临床工作。
1.1 试药 砂 烫 骨 碎 补 [ 购 自 哈 尔 滨 市 药 材 公 司，经 本
校生药教研室的专家鉴定确认为水龙骨科植物 槲 蕨Drynaria fortunei(Kunze) J.Sm. 的 干 燥 根 茎 ]； 柚 皮 苷 对 照 品（中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所，批 号： 110722-20610）; 乙腈 ( 色谱纯，天津市科密欧化学 试剂有限公司 ); 甲醇（优级醇，天津市科密欧化学试 剂有限公司）；乙醇（分析纯，哈尔滨市新达化工厂）。 1.2 仪器
及 总 黄 酮 的 含 量 优 于 工 艺 A1B3C2D3，故 确 定 骨
碎 补 的 最 佳 工 艺 条 件 为 A3B3C2D3，即 乙 醇 浓 度
为 55%，乙醇用量为骨碎补的 14 倍，提取 3 次，每次
2min。
（3）在 正 交 试 验 前 笔 者 曾 单 因 素 考 察 骨 碎 补
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
醇提的乙醇最佳浓度范围，用 10 倍量、浓度分别为
Key words：Drynaria fortunei(Kunze) J. Sm.; Naringin; Total flavonoids; HPLC; Orthogonal design
骨 碎 补 属 水 龙 骨 科 植 物 槲 蕨 [Drynaria fortunei(Kunze) J. Sm.)] 的干燥根茎。性温，味苦，归 肝、肾经，补肾强骨，续伤止痛，临床应用广泛。其活 性成分是以柚皮苷为主的二氢黄酮类化合物 [1]。现 代药理研究表明骨碎补具有降血脂、降低胺基糖苷 类抗生素的毒性和促进骨吸收等作用 [2]。本研究以 骨碎补总黄酮及柚皮苷的含量为指标，采用正交设 计方法对骨碎补的提取工艺进行优选。 1 实验材料
第11卷 第12期 2009 年 12 月
辽宁中医药大学学报
JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM
Vol. 11 No. 12 Dec .，2009
骨碎补提取工艺的实验研究
全 红，郭春秋，曲倩文，王术平
（黑龙江中医药大学中医药研究院 , 黑龙江 哈尔滨 150040）
（Chinese Medical Institute of Heilongjiang University of TCM, Harbin 150040, Heilongjiang, China） Abstract：Objective:To study the optimum extraction of Drynaria fortunei(Kunze) J. Sm. Methods:
无显著性影响，影响强度依次为 D ＞ B ＞ C ＞ A，如
以柚皮苷的含量为指标，骨碎补的最佳提取工艺为
A3B3C2D3; 如以总黄酮的含量为指标，骨碎补的最佳 提取工艺为 A1B3C2D3，综合两种分析结果，因素 D 为 最重要影响因素，其次是因素 B, 因素 A 和 C 为最次
要因素。故确定最佳提取工艺条件应为 A3B3C2D3 或 A1B3C2D3。 2.5.2 验证与比较实验 称取 100g 砂烫骨碎补，按
A3B3C2D3 和 A1B3C2D3 条件各提取 3 次，结果见表 5。 表 5 验证与比较实验结果
实验条件 实验号 总黄酮含量 (C,mg·mL-1)
A3B3C2D3 1 2
19.0031 19.3120
3
18.9148
A1B3C2D3
1
2
19.1131 18.0891
3
18.3223
柚皮苷含量 (C,μg·mL-1) 28.3021 28.5110 27.7932 27.1312 27.4543 28.1103
11 卷
辽宁中医药大学学报
nm 处测定并计算柚皮苷的含量。见表 2。
2.4 骨碎补总黄酮的含量测定 [4]
2.4.1 标准曲线的制备 分别吸取对照品 0.0、0.5、
1.0、1.5、2.5、3.0mL 于 10mL 容 量 瓶 中，甲 醇 定 容 至
刻 度，在 283nm 处 测 定 吸 收 度，经 回 归 得 标 准 曲
乙醇浓度、溶媒用量提取时间提取次数 4 个因素进 行考察，每个因素取 3 个水平，按 L9(34) 正交表进行
实验，见表 1。 表 1 骨碎补醇提工艺因素水平
水平
1 2 3
A 乙醇浓度 (%)
45 50 55
B 溶媒用量 (倍)
10 12 14
C 提取时间 (时)
1 2 3
D 提取次数 (次)
1 2 3
21 2
2
2 7.85 26.7374 12.9032
31 3
3
3 8.21 27.0413 14.7170
42 1
2
3 7.75 26.5892 12.1113
52 2
3
1 5.32 25.9004 9.3120
62 3
1
2 6.48 26.5012 11.7131
73 1
3
2 7.25 26.3542 10.6013
40%、50%、60%、70%、80%、90% 的乙醇提取 2 次，每
次 2min，结果表明选用 50% 的乙醇提取时柚皮苷的
含量明显高于其他浓度，故正交试验中选择 45%、
50%、55%3 个浓度水平进行试验。
（4）骨碎补中主要成分柚皮苷的熔点为 83℃，
故在浓缩及干燥过程中控制温度在了 70℃，以防止
有效成分的损失。◆
参考文献
[ 1 ] 周铜水，周荣汉，刘晓东 . 骨碎补对大鼠实验性骨折损伤愈合 的影响 [ J ] . 中草药，1994，25 ( 5 )：249.
总 k1 11.942 10.307 11.114 9.076
黄 k2 11.045 11.879 11.575 11.739
酮 k3 11.244 12.046 11.543 13.416
R 0.897 1.739 0.461 4.340
表 3 柚皮苷的方差分析
方差来源 偏差平方和 自由度 平均偏差平方和 F 比 显著性
Referring to the content of total flavonoids and Naringin，we study the condition of the extraction of Drynaria fortunei(Kunze) J. Sm. with the method of Orthogonal design. Results:The extraction times is the key fator; the dosage of menstruum is the subordination factor; the time cost in extraction and consitence of etnanol is the most subordination factor.Conclusions: The optimum extraction is as follows adding 14 times of 55% ethanol into Drynaria fortunei(Kunze) J. Sm.，boiling for 2 hours each time and extracting three times in all.
B
5.527
2
2.7635
4.149
C
0.398
2
0.199
0.299
D
28.745
2
14.3725 21.580 P<0.01
E
1.33
9
注：F0.05(2,9)=4.26，F0.01(2,9)=8.02。
柚皮苷的方差结果分析表明，因素 B、D 对骨碎
补中柚皮苷的提取具有极显著的影响，因素 A、C 则
83 2
1
3 8.22 26.9894 13.4211
93 3
2
1 7.05 26.1332 9.7091
柚 k1 26.395 26.116 26.299 25.813
皮 k2 26.330 26.542 26.487 26.531
苷 k3 26.492 26.559 26.432 26.873
R 0.162 0.443 0.188 1.060
摘 要：目的：优选骨碎补提取的最佳工艺条件。方法：以骨碎补中柚皮苷及骨碎补总黄酮的含量为指标，采
用 L9(34) 正交设计法对骨碎补的提取条件进行研究。结果：提取次数是骨碎补有效成分提取的关键因素 , 其次是
溶媒用量，提取时间和乙醇浓度为最次要因素。结论：最佳提取工艺条件是 14 倍量 55% 乙醇回流提取 3 次 ,2 h/ 次。
仪器 752 型分光光度计 ;Waters 600-2487 高效 液 相 色 谱 仪 ;METTLER TOLEDO AG135 型 电 子 天 平。 2 试验方法与结果
2.1 色谱条件 色 谱 柱：Kromasil C18 5μm(4.6mm×200mm);
流 动 相：甲 醇 - 醋 酸 - 水（35：4：65）；流 速：1.0 mL·min-1；检测波长 :283nm; 柱温 :27℃。 2.2 正交实验方法 2.2.1 实验因素与水平 通过预试验考察，确定以
线 方 程 为：A=16.98C+0.16(r=0.9995), 线 性 范 围 为
0~0.036mg/mL。
2.4.2 样品溶液的制备及测定 分别精密称取骨碎
补细粉 3mg 于 10mL 的容量瓶中，甲醇溶解并定容至
刻度，精密吸取 1mL 于 10mL 容量瓶中，甲醇定容至
刻度，于 283nm 处测定吸收度 A, 按回归方程计算骨
2.2.2 L9(34) 正交实验 每份取砂烫骨碎补（过 40 目筛）50g，按 L9(34) 正交表进行提取，将提取液合并， 过滤，回收乙醇并干燥成膏，计算出膏率。（见表 2）
2.3 柚皮苷的含量测定
《中 华 人 民 共 和 国 药 典》2005 年 版 Ⅰ 部 骨 碎 补药材项下的柚皮苷的含量测定规定 [3]，以 Waters
关键词：骨碎补；柚皮苷；骨碎补总黄酮；HPLC；正交设计
中图分类号：G424.31
文献标识码：A
文章编号：1673-842X (2009) 12-0016- 02
Reserch on Extraction of Drynaria Fortunei(Kunze) J. Sm. with Method of Orthogonal Design QUAN Hong，GUO Chun-qiu，QU Qian-wen，WANG Shu-ping
3 结果与讨论
（1）现代研究表明，骨碎补能增强成骨细胞活
性、提高骨密度、维持骨微结构的完整程度，是肾主
骨生髓的物质基础之一 [5]。骨碎补经砂烫、酒制、盐
制后 , 并不影响总黄酮及柚皮苷含量 , 却有利于有效
成分的溶出 [4]，故笔者选择砂烫的骨碎补来进行提
取，以便提高骨碎补中柚皮苷的提取率。
（2）结果表明 , 工艺 A3B3C2D3 的柚皮苷含量
600-2487 高效液相色谱仪测定骨碎补各样品中的
柚皮苷含量。
2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取在 105℃下干
燥至恒重的柚皮苷对照品 6mg，置 50mL 容量瓶中， 加甲醇适量使其溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照
品溶液。
取对照品溶液 5mL 至 10mL 容量瓶中，甲醇定
容至刻度（浓度为 60μg/mL），摇匀即得对照品溶液
A
0.040
2
0.020
1.000
B
0.377
2
0.1885 9.425 P<0.05
C
0.056
2
0.028
1.400
D
1.757
2
0.8785 43.925 P<0.01
E
0.04
9
表 4 总黄酮的方差分析表
方差来源 偏差平方和 自由度 平均偏差平方和 F 比 显著性
A
1.332
2
0.666
1.000
碎补总黄酮的含量。见表 2。
2.5 实验结果及分析
2.5.1 正交实验结果进行方差分析 见表 2~ 表 4。
表 2 骨碎补提取的正交实验表 L9(34)
试验号 A B
CD
出膏率 柚皮苷 总黄酮
(﹪) (C,μg·mL-1) (C,mg·mL-1)
11 1
1
1 4.99 25.4056 8.2070
的稀释液。
2.3.2 供 试 品 溶 液 的 制 备 及 测 定 分 别 精 密 称 取
骨碎补细粉 3mg 于 10mL 的容量瓶中，加甲醇适量使 其溶解并稀释至刻度，摇匀即得。分别吸取对照稀
释液和供试品溶液各 10μL 注入液相色谱仪，于 283
收稿日期：2009-06-01 作者简介：全红（1950-），女，研究员，研究方向：中药新剂型、新工艺研究。 通讯作者：王术平（1957-），女，教授，主要从事中医工程研究及妇科的教学、科研与临床工作。
1.1 试药 砂 烫 骨 碎 补 [ 购 自 哈 尔 滨 市 药 材 公 司，经 本
校生药教研室的专家鉴定确认为水龙骨科植物 槲 蕨Drynaria fortunei(Kunze) J.Sm. 的 干 燥 根 茎 ]； 柚 皮 苷 对 照 品（中 国 药 品 生 物 制 品 检 定 所，批 号： 110722-20610）; 乙腈 ( 色谱纯，天津市科密欧化学 试剂有限公司 ); 甲醇（优级醇，天津市科密欧化学试 剂有限公司）；乙醇（分析纯，哈尔滨市新达化工厂）。 1.2 仪器
及 总 黄 酮 的 含 量 优 于 工 艺 A1B3C2D3，故 确 定 骨
碎 补 的 最 佳 工 艺 条 件 为 A3B3C2D3，即 乙 醇 浓 度
为 55%，乙醇用量为骨碎补的 14 倍，提取 3 次，每次
2min。
（3）在 正 交 试 验 前 笔 者 曾 单 因 素 考 察 骨 碎 补
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
醇提的乙醇最佳浓度范围，用 10 倍量、浓度分别为
Key words：Drynaria fortunei(Kunze) J. Sm.; Naringin; Total flavonoids; HPLC; Orthogonal design
骨 碎 补 属 水 龙 骨 科 植 物 槲 蕨 [Drynaria fortunei(Kunze) J. Sm.)] 的干燥根茎。性温，味苦，归 肝、肾经，补肾强骨，续伤止痛，临床应用广泛。其活 性成分是以柚皮苷为主的二氢黄酮类化合物 [1]。现 代药理研究表明骨碎补具有降血脂、降低胺基糖苷 类抗生素的毒性和促进骨吸收等作用 [2]。本研究以 骨碎补总黄酮及柚皮苷的含量为指标，采用正交设 计方法对骨碎补的提取工艺进行优选。 1 实验材料
第11卷 第12期 2009 年 12 月
辽宁中医药大学学报
JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM
Vol. 11 No. 12 Dec .，2009
骨碎补提取工艺的实验研究
全 红，郭春秋，曲倩文，王术平
（黑龙江中医药大学中医药研究院 , 黑龙江 哈尔滨 150040）
（Chinese Medical Institute of Heilongjiang University of TCM, Harbin 150040, Heilongjiang, China） Abstract：Objective:To study the optimum extraction of Drynaria fortunei(Kunze) J. Sm. Methods:
无显著性影响，影响强度依次为 D ＞ B ＞ C ＞ A，如
以柚皮苷的含量为指标，骨碎补的最佳提取工艺为
A3B3C2D3; 如以总黄酮的含量为指标，骨碎补的最佳 提取工艺为 A1B3C2D3，综合两种分析结果，因素 D 为 最重要影响因素，其次是因素 B, 因素 A 和 C 为最次
要因素。故确定最佳提取工艺条件应为 A3B3C2D3 或 A1B3C2D3。 2.5.2 验证与比较实验 称取 100g 砂烫骨碎补，按
A3B3C2D3 和 A1B3C2D3 条件各提取 3 次，结果见表 5。 表 5 验证与比较实验结果
实验条件 实验号 总黄酮含量 (C,mg·mL-1)
A3B3C2D3 1 2
19.0031 19.3120
3
18.9148
A1B3C2D3
1
2
19.1131 18.0891
3
18.3223
柚皮苷含量 (C,μg·mL-1) 28.3021 28.5110 27.7932 27.1312 27.4543 28.1103