肺岩宁方对肺癌干细胞Wnt信号通路的影响

实验中医
肺岩宁方对肺癌干细胞Wnt 信号通路的影响
王
爽
1
王立芳
1
徐振晔
1
沙慧芳
2
1．上海中医药大学附属龙华医院肿瘤科
（上海200032）
2．上海交通大学附属胸科医院胸部肿瘤研究所（上海200030）
【摘要】目的：分离、鉴定肺癌干细胞，并探讨肺岩宁方对肺癌干细胞Wnt 信号通路的干预作用。

方法：
分离、鉴定肺癌干细胞；将分离出的SP +
肺癌干细胞分为对照组（空白血清+生理盐水）、单纯化疗（空白血
清+DDP 组）、
肺岩宁方组（肺岩宁方含药血清+生理盐水）、综合治疗组（肺岩宁方含药血清+DDP ），予体外药物干预后检测β-catenin 蛋白表达及SP +肺癌干细胞凋亡情况。

结果：分离的SP +、CD24+IGF-1R +
、CD133+细胞具有肺癌干细胞特性，分离的β-catenin 蛋白完整；综合治疗组诱导SP +
干细胞凋亡优于其他组，各组凋亡率分别为综合治疗组79．2%、肺岩宁方组21．3%、DDP 组33．7%、对照组0．3%。

结论：本课题组已掌握分离、鉴定肺癌干细胞的技术，中药肺岩宁方联合化疗具有一定的诱导肺癌干细胞凋亡的作用。

【关键词】肺岩宁方；肺癌干细胞；Wnt 信号通路；β-连环蛋白
【中图分类号】R285．5；R734．2【文献标志码】A 【文章编号】1008-861X （2012）06-0077-06
［基金项目］国家自然科学基金资助项目（30973822）［作者简介］王爽，女，在读博士生，主要从事中医药抗肿瘤临床及基础研究。

［通讯作者］徐振晔，教授，博士生导师。

E-mail ：xuzhenye1947@126．com
自从Bonnet 等［1］
于1997年第一次发现白血病
干细胞，并证实其具有自我更新、增殖、分化功能以来，肿瘤干细胞的作用不断被认识，而且它的存在可
能导致肿瘤细胞增殖的加速［2］
，是肿瘤形成、生长、
转移和复发的根源［3-7］。

随着研究的深入，人们已
经意识到肺癌可能是一种干细胞疾病，具有自我更新和无限增殖能力的肺癌干细胞是肺癌发生的“根
源”
，肺癌的复发、侵袭转移、耐药、抗辐射等恶性表型特征都与肺癌干细胞有关。

因此，
针对肺癌干细胞的治疗
［8-9］
可能效果更持久，同时能阻止肿瘤的复发、转移，这对于肺癌的治疗有深远的意义。

中医理论认为，肿瘤的发生、发展是由于机体正气亏损，导致邪毒凝聚、阴阳失衡的病理变化，肿瘤
侵袭转移的根本原因在于肾精亏虚、
阴阳失衡，临床上中晚期肺癌患者常具有精气两亏之证候，而扶助肾中精气结合解毒散结法抗癌的确具有良效。

据此徐振晔教授研制出具有益气养精、解毒散结之功的肺岩宁方。

前期临床研究表明该方联合化疗具有良
好的治疗进展期非小细胞肺癌的作用［10］
，
实验研究表明该方具有干预细胞周期G1/S 检测点调控信号
抗Lewis 肺癌细胞增殖的作用［11］。

本研究旨在前期研究基础上，首先对肺癌干细胞进行分离、鉴定，并初步探讨肺岩宁方对肺癌干细胞的干预作用，为
肺岩宁方干预肺癌干细胞的进一步研究奠定基础。

1
材料与方法
1．1实验材料
1．1．1实验动物BALB /C 裸鼠，雄性，体质量（20ʃ2）g ，购自中国科学院上海实验动物中心，动
物合格证号：SCXK （沪）2007-0005，饲养于上海中医药大学附属龙华医院SPF 级动物房。

雄性Wistar
大鼠18只，清洁级，体质量为（200ʃ15）g ，合格证
号：SCXK （沪）2007-0001。

1．1．2药品与试剂肺岩宁方，由生黄芪、黄精、仙
灵脾、重楼、山慈菇等组成，龙华医院中药房提供。

常规水煎，水浴浓缩至生药含量为2．0g /ml ，
4ħ保存备用。

顺铂（DDP ），齐鲁制药厂（批号：95062015），临用时注射用水配制成0．1mg /ml 水溶
液。

胎牛血清（FBS ）、
F12k 培养基，Gibco 公司产品；荧光染料Hoechst33342，
Sigma 公司产品；0．25%胰酶，Gibco 公司产品；纤维细胞生长因子（FGF ）、重组人表皮生长因子（EGF ），购自Sigma 公司。

1．1．3肺癌细胞A549人肺腺癌细胞株，购自中国科学院上海生命细胞库，在含10%FBS 的F12k 培养基中传代培养，取活跃增殖期细胞进行实验。

1．2肺癌干细胞分离及鉴定实验
1．2．1流式细胞仪分离SP +肺癌干细胞取对数
期生长的A549细胞，0．25%胰酶消化，按照试剂说
明书及流式细胞仪操作指南，分选出SP 细胞及Non SP 细胞，其中SP 细胞分别用于接种裸鼠及体外增殖实验。

1．2．2免疫磁珠分离CD24+IGF-1R +、CD133+
肺癌干细胞取对数期生长的A549细胞，0．25%胰酶消化，分别按照操作指南用MiniMACS分离柱分选，并收集得到的CD24+IGF-1R+、CD133+细胞，用于接种裸鼠及体外增殖实验。

1．2．3体内致瘤性观察收集分离得到的肺癌细胞，SP+细胞浓度设为1ˑ103、5ˑ103、5ˑ104个，CD24+IGF-1R+与CD133+细胞浓度均分别设为100、500、2000个。

分别将不同浓度的肺癌细胞接种于4周龄裸鼠左腋下，10只/组；同时以1ˑ107个A549细胞接种，作为阴性对照。

接种后每天观察一次肿瘤生长情况。

取第2周、第4周，分别统计肿瘤形成情况；于观察第4周，将小鼠断颈处死，拍照后摘取肿瘤，测量后用于检测。

1．2．4“成球”能力观察收集分离得到的SP+、CD24+IGF-1R+、CD133+细胞，用含20ng/ml重组人酸性成纤维细胞生长因子（FGF）、20ng/ml重组人表皮生长因子（EGF）、20%FBS的F12接种于24孔培养板，于37ħ5%CO
2
培养箱中培养，每天于显微镜下观察，直到形成“肿瘤球”。

同条件下培养A549细胞作为阴性对照。

1．2．5免疫荧光检测肿瘤组织将裸鼠处死，剖取肿瘤，在10%福尔马林溶液中进行固定。

肿瘤组织经脱水、透明后用石蜡包埋，将包埋好的组织进行切片，切片厚度为5μm。

切片常规脱蜡至水，按照免疫荧光检测步骤及试剂盒说明书操作染色，CD24+ IGF-1R+细胞抗体为Rabbit Anti-human CD24单克隆抗体（FITC标记，1ʒ200稀释，稀释液为含1% BSA PBST）、Rat Anti-human IGF-1R单克隆抗体（TRITC标记，1ʒ500稀释），CD133+细胞抗体为Rabbit Anti-human CD133单克隆抗体（TRITC标记，1ʒ250稀释，稀释液为含1%BSA PBST），染色后在共聚焦显微镜下观察并拍照（400倍）。

1．3肺岩宁方含药血清制备及干预
1．3．1含药血清制备将雄性Wistar大鼠按体质量每日灌胃给予中药药液（1．5ml/kg），连续给药3d，于最后1次给药1h后（灌药前12h禁食），乙醚麻醉，腹主动脉采血，室温放置待血凝之后，5000r/min，离心7min。

将血清过滤除菌，56ħ灭活30min，密封，－20ħ保存备用。

1．3．2体外实验将分离出的SP+肺癌干细胞分为对照组（模拟用药）、DDP组（单纯化疗）、肺岩宁方组（单纯中药）、综合治疗组（中药+化疗），第3天给药后2h取材进行检测。

给药方法如下：①对照组：空白血清+生理盐水；②DDP组：空白血清+ DDP；③肺岩宁方组：肺岩宁方含药血清+生理盐水；④综合治疗组：肺岩宁方含药血清+DDP。

均每日1次。

1．4检测指标与方法
1．4．1Western blot法检测β-catenin蛋白按照试剂盒说明提取总蛋白，然后加入抽提试剂去除非蛋白成分，离心、干燥，得到总蛋白，BCA方法检测蛋白浓度。

取等量蛋白样品进行SDS聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳，按照湿法电转印方法操作，电转电压100V，恒压，最后用ECL化学发光法显色，以CAPDH作为对照。

1．4．2流式细胞仪法检测肺癌干细胞凋亡取用药干预后的肺癌干细胞，0．25%胰酶消化，按照试剂说明书及流式细胞仪操作指南，采用annexin v/PI 双染法检测肺癌干细胞凋亡率。

1．5统计学方法采用SPSS18．0统计软件，对实验数据进行分析，计数资料使用卡方检验，计量资料采用方差分析。

2结果
2．1致瘤性分析
2．1．1SP+肺癌干细胞至观察第2周，除A549细胞株外，不同浓度的SP+肺癌干细胞均有肿瘤形成；第4周，除A549细胞株外，各浓度的SP+肺癌干细胞均致裸鼠形成肿瘤。

结果表明，接种时细胞浓度越大则第2周形成肿瘤的比例越高，第4周形成的肿瘤越大，即仅需要103个SP+肺癌干细胞便可在较短时间内导致肿瘤的发生，并且其致瘤性呈浓度正相关。

见表1。

表1SP+肺癌干细胞致瘤性分析
细胞浓度（个）肿瘤形成比肿瘤大小（g）1ˑ1033/101．23ʃ0．05
5ˑ1038/101．64ʃ0．05
5ˑ10410/102．05ʃ0．05 2．1．2CD24+IGF-1R+及CD133+肺癌干细胞第2周，除A549细胞株外，不同浓度的CD24+IGF-1R+及CD133+肺癌干细胞均有肿瘤形成；第4周，除A549细胞株外，各浓度的CD24+IGF-1R+及CD133+肺癌干细胞均致裸鼠形成肿瘤。

结果表明，其致瘤性呈浓度正相关。

见表2，图1、图2。

表2CD24+IGF-1R+及CD133+肺癌干细胞致瘤性分析
细胞浓度
（个）
CD24+IGF-1R+
肿瘤
形成比
肿瘤大小
（g）
CD133+
肿瘤
形成比
肿瘤大小
（g）1005/101．53ʃ0．044/101．04ʃ0．08
5006/102．03ʃ0．057/101．78ʃ0．02
200010/102．27ʃ0．0710/102．17ʃ0．02
图2CD24+IGF-1R +肺癌干细胞形成肿瘤的组织免疫荧光检测（DAPI 染核，FITC 染膜和TRITC 染膜）
2．2“成球”能力监测
2．2．1SP +
肺癌干细胞除A549细胞株外，3种
不同浓度SP +
肺癌干细胞于培养后5 10d 内均形成
“肿瘤球”，但其所需时间并不相同，高浓度“成球”
所需时间最短、“肿瘤球”直径最大。

见表3，图3。

表3不同浓度SP +
肺癌干细胞“成球”时间及“肿瘤球”直径
细胞浓度（个）
成球时间（d ）
球径（μm ）
1ˑ1039605ˑ103890
5ˑ104
4
250
图3SP +肺癌干细胞体外增殖形成的肿瘤球（ˑ400）
2．2．2CD24+IGF-1R +及CD133+肺癌干细胞除
A549细胞株外，不同浓度CD24+IGF-1R +及
CD133+肺癌干细胞，于培养后5 10d 内均形成“肿瘤球”，但其所需时间并不相同，高浓度“成球”
所需时间最短、“肿瘤球”直径最大。

见表4，图4、
图5。

表4不同浓度CD24+
IGF-1R +及CD133+肺癌干细胞
“成球”时间及“肿瘤球”直径细胞浓度（个）CD24+IGF-1R +形成球时间
（d ）
球径（μm ）
CD133+
成球时间
（d ）球径（μm ）
100108010505007120
71002000
5
230
5
200
图4CD24+IGF-1R +肺癌干细胞体外增殖形成的肿瘤球（ˑ400）
图5CD133+肺癌干细胞体外增殖形成的肿瘤球（ˑ400）
2．3对β-catenin蛋白的影响Western blot法检测结果显示，分离的β-catenin蛋白完整。

见图6。

1：对照组；2：DDP组；3：肺岩宁方组；4：综合治疗组图6各组β-catenin蛋白检测
2．4对肺癌干细胞凋亡的影响流式细胞仪法检测显示，凋亡率分别为：综合治疗组79．2%、肺岩宁方组21．3%、DDP组33．7%、对照组0．3%，结果表明：综合治疗组及肺岩宁方组、DDP组具有一定的诱导肺癌干细胞凋亡的作用，综合治疗组诱导肺癌干细胞凋亡优于其他组。

见图7。

1：对照组；2：DDP组；3：肺岩宁方组；4：综合治疗组
图7各组细胞凋亡结果
3讨论
肺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤，在中国及
世界范围内其病死率都居恶性肿瘤死亡率之首，目
前已成为人类因癌症死亡的主要原因［12］。

近十多
年来，虽然手术、放化疗及靶向药物的应用，癌症的
治疗取得了长足的进步，一些常见肿瘤（如乳腺癌
和前列腺癌等）患者的5年生存率得到显著提高，
可肺癌却无明显进展。

目前肺癌患者的5年生存率
在发展中国家不足9%［13］，美国最高，但仍未超过
15%［14］。

近年来肿瘤干细胞的作用不断被认识，它的存
在可能导致肿瘤细胞增殖的加速［2］，它是肿瘤形
成、生长、转移和复发的根源［5-7］。

随着研究的深
入，人们已经意识到肺癌可能是一种干细胞疾病。

肺癌干细胞的研究［15］是目前国际肿瘤界研究的热
点和重点。

具有自我更新和无限增殖能力的肺癌干
细胞是肺癌发生的“根源”，肺癌的复发、侵袭转移、
耐药、抗辐射等恶性表型特征都与肺癌干细胞有关。

因此，针对肺癌干细胞的治疗［9］可能效果更持久，
同时能阻止肿瘤的复发、转移，这对于肺癌的治疗有
深远的意义。

肿瘤干细胞的增殖分化是受相关信号通路调控
的，如Wnt，Notch，Shh（Sonichedgehog）和Bmi-1等。

Wnt信号通路作为细胞信号转导系统之一，与肺癌
的发生发展以及在肺癌干细胞特性维持过程中有着
重要作用［16-18］，Wnt/β-catenin信号转导途径是经典
的Wnt信号转导途径［19］。

越来越多的证据表
明［20-21］，Wnt信号通路的不恰当激活，参与了肿瘤的
发生及其侵袭转移的过程，该通路可能通过作用于
肺癌干细胞而促使肺癌细胞复制更新或转移复发，
因此，针对肺癌干细胞Wnt通路的研究及药物调控
可为肺癌治疗提供新的突破口。

30余年来，研究表明中医中药能有效地抗肺癌
生长、侵袭转移和复发，可以明显改善生活质量，延
长生存期［22-27］，许多晚期肺癌患者可以长期带瘤生
存。

中药复方制剂由于多种活性成分并存，对肺癌
作用机制是多途径、多靶点的。

它能否对肺癌产生
的“根源”———肺癌干细胞有其特定作用？由于肺
腺癌在肺癌的发生中占有较大的比例，故本研究以
肺腺癌这一病例类型作为研究对象。

肺癌干细胞的表面标记虽然较多［12-13，28-36］，但是SP+［37-40］、CD24+ IGF-1R+［41］、CD133+［42-43］则为国内外较为公认的肺腺癌干细胞的表面标记，故本研究采用上述标记的肺癌干细胞作为观察对象。

本课题组前期实验研究证实，肺岩宁方具有防治肺癌生长、复发、转移的作用［44-47］，而最新理论认为肿瘤的生长、复发、转移均与相应的肿瘤干细胞有关，故本研究在此基础上首先分离、鉴定了肺癌干细胞，随后采用中药含药血清进行干预，并检测肺癌干细胞的凋亡率，结果表明我们所分选的SP+、CD24+ IGF-1R+、CD133+细胞在裸鼠体内具有致瘤性，并且致瘤能力与浓度呈正相关，即浓度越高致瘤性越强（形成肿瘤所需时间短、相同时间内形成的肿瘤越大）；在体外培养时，其成球能力与浓度亦呈正相关，即浓度越高形成肿瘤球的能力越强（形成肿瘤球所需时间短，相同时间内形成肿瘤球的直径越大）；免疫荧光检测时，不同的干细胞则呈现相应的染色。

在成功分离、鉴定肺癌干细胞后，我们探讨了肺岩宁方对肺癌干细胞Wnt信号通路影响的研究，实验结果表明我们可以完整的分离、检测β-catenin 蛋白，凋亡结果表明中药肺岩宁方联合化疗具有一定的诱导肺癌干细胞凋亡的作用，故我们认为益气养精中药对肺癌干细胞Wnt信号通路影响的研究理论及实践上均具有可行性，并且值得进一步的深入探讨，研究结果将为临床提供安全有效的治疗肺癌的方法。

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编辑：白玉金
收稿日期：2012-08-02
Influence of“Feiyanning Decoction”on Wnt
Signal Pathway of Lung Caner Stem Cell
WANG Shuang1WANG Li-fang1XU Zhen-ye1SHA Hui-fang2
1．Department of Oncology，Longhua Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine 2．Thoracic Tumor Research Institute，Chest Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University
ABSTRACT Objective：To separate and identify the lung cancer stem cells and explore the intervention of“Feiyanning
Decoction”on Wnt signal pathway of lung caner stem cell．Methods：The lung cancer stem cells were separated and identified．
The SP+lung cancer stem cells were divided into control group（treated with serum and saline），chemotherapy group（treated
with serum and DDP），“Feiyanning Decoction”group（treated with serum containing“Feiyanning Decoction”and saline），
combined therapy group（treated with serum containing“Feiyanning Decoction”and DDP）．The expression ofβ-catenin and the
apoptosis of SP+lung cancer stem cells were detected．Results：The separated SP+，CD24+IGF-1R+and CD133+lung cancer
cells had the characteristics of lung cancer stem cells，and theβ-catenin protein was integrity．The apoptosis of SP+lung cancer
cells in the combined therapy group was better than that in the other groups，and the apoptosis rates of combined therapy group，
“Feiyanning Decoction”group，chemotherapy group and control group were79．2%，21．3%，33．7%and0．3%respectively．
Conclusion：The technology of isolating and identifying the lung cancer stem cells has been obtained，and“Feiyanning Decoction”
combined with chemotherapy can induce the apoptosis of lung cancer stem cells．
KEY WORDS“Feiyanning Decoction”；lung cancer stem cell；Wnt signal pathway；β-catenin。