第四章 植物细胞培养方法(修改)
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植物细胞培养
植物细胞培养一、定义●在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行振荡培养，得到分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的一种技术。
●植物中含有数量极为可观的次生代谢物质，是各种色素、药物、香精、酶等天然产物的主要来源。
●植物细胞培养具有以下优点：1、提高产率2、缩短周期3、提高产品质量4、易于管理，减轻劳动强度因此主要用于生产色素、药物、食品、酶、精细化工产品等次生代谢物。
二、培养基常用MS培养基，另外还有B5、N6、NT、AA、KM8p等培养基三、单细胞培养1、制备方法（1）机械法（机械磨碎、切割）（2）酶解法（目前最有效的获得单细胞方法）（3）愈伤组织诱导法（高频振动愈伤组织）2、培养方法（1）平板法（似微生物平板培养）（2）看护培养与饲养层培养法看护培养：将单个细胞接种到滤纸上再置于愈伤组织之上进行培养。
饲养层培养：用处理过（如X射线）的无活性的或分裂很慢、不具分裂能力的细胞来饲养细胞。
（3）液体浅层静置培养法：将一定密度的悬浮细胞在培养皿中形成浅薄层，封口静止培养。
（4）细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。
植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。
①低温法：冷处理可提高培养体系中细胞同步化程度。
②分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。
③饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。
④抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，如尿苷等，使细胞滞留在DNA 合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期—G1期的同步化细胞。
3、保存（1）继代培养（高等植物、海藻等）（2）低温（ 5℃～10℃）（3）冷冻（ -20℃或液氮）植物细胞冷冻保存方法：在冰浴条件下加入预冷的冰冻保护剂，密封，继续冰浴15min，在-40℃停留2h后投入-196℃液氮罐中保存。
植物细胞培养技术
（1）饲养细胞与靶细胞共同混合于琼脂培养基中。 （2）饲养细胞与靶细胞分别混合于琼脂培养基中，前者
放于下层，后者位于上层。 （3）饲养细胞与靶细胞一起培养于液体培养基中。 （4）双层滤纸植板培养：在饲养细胞层和靶细胞层之间 放两张滤纸，上面一层滤纸用于将靶细胞转移到其他培养 基上继续培养。
有分裂能力。通过外植体诱导愈伤组织形成是细 胞脱分化的过程，可以获得分散的具有分裂能力 的植物细胞。
1.2 植物单细胞的初步培养
1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.2.4 看护培养 饲养层培养 液体浅层静置培养 细胞同步化培养
1.2 植物单细胞的初步培养
1.2.1 看护培养
1 将生长活跃的愈伤组 织接种在固体培养基上 2 在愈伤组织块上方放 置一片面积为1cm2的无 菌滤纸，滤纸下方紧贴 愈伤组织
植物单细胞分离与初步培养 继代培养
1.植物单细胞的分离与初步培养
1.1 植物单细胞的分离
1.1.1 从外植体直接分离单细胞 1.1.2 从愈伤组织分离单细胞 1.1.3 通过原生质体再生法获得单细胞
1.1植物单细胞的分离
1.1.1 从外植体直接分离单细胞
机械法：
通过机械磨碎、切割等操作获得游离的细胞，效 率低，容易对细胞造成损伤。
2.3 液体培养
采用液体培养基可以进行细胞培养可以保证细胞 与营养比较充分地接触，操作方便，生长速度较 快。
2.继代培养
愈伤组织随外植体生长一段时间后需要进行继代 培养达到增殖的目的。 培养工具与微生物细胞培养类似，关键仪器包括 光照培养箱、控温摇床等。
2.1 平板培养法
1 单细胞悬浮液的制备
单细胞来源：
外植体(叶肉细胞) 愈伤组织 原生质体
放于下层，后者位于上层。 （3）饲养细胞与靶细胞一起培养于液体培养基中。 （4）双层滤纸植板培养：在饲养细胞层和靶细胞层之间 放两张滤纸，上面一层滤纸用于将靶细胞转移到其他培养 基上继续培养。
有分裂能力。通过外植体诱导愈伤组织形成是细 胞脱分化的过程，可以获得分散的具有分裂能力 的植物细胞。
1.2 植物单细胞的初步培养
1.2.1 1.2.2 1.2.3 1.2.4 看护培养 饲养层培养 液体浅层静置培养 细胞同步化培养
1.2 植物单细胞的初步培养
1.2.1 看护培养
1 将生长活跃的愈伤组 织接种在固体培养基上 2 在愈伤组织块上方放 置一片面积为1cm2的无 菌滤纸，滤纸下方紧贴 愈伤组织
植物单细胞分离与初步培养 继代培养
1.植物单细胞的分离与初步培养
1.1 植物单细胞的分离
1.1.1 从外植体直接分离单细胞 1.1.2 从愈伤组织分离单细胞 1.1.3 通过原生质体再生法获得单细胞
1.1植物单细胞的分离
1.1.1 从外植体直接分离单细胞
机械法：
通过机械磨碎、切割等操作获得游离的细胞，效 率低，容易对细胞造成损伤。
2.3 液体培养
采用液体培养基可以进行细胞培养可以保证细胞 与营养比较充分地接触，操作方便，生长速度较 快。
2.继代培养
愈伤组织随外植体生长一段时间后需要进行继代 培养达到增殖的目的。 培养工具与微生物细胞培养类似，关键仪器包括 光照培养箱、控温摇床等。
2.1 平板培养法
1 单细胞悬浮液的制备
单细胞来源：
外植体(叶肉细胞) 愈伤组织 原生质体
植物细胞培养的技术
• 大多数氮常以铵盐或硝酸盐形式提供。
• 钾、镁、钙、离子对细胞代谢必不可少，镁离子 参与多种辅酶和激活子的合成；钾离子、钙离子 可抑制某些酶的活性，有时钙离子也可保持某些 酶的活性或稳定性。微量元素的作用是参与辅酶 的形成，并可诱导酶的合成
2、碳源
• 植物细胞培养物通常为异养细胞。人们常 用碳源为碳水化合物、肌醇、甘油、乳糖 和半乳糖。有时培养基固化物（如琼脂） 也作为碳源。
常用灭菌剂有次氯酸钙、次氯酸钠和氯 化汞。
次氯酸钙为工业漂白粉过滤后的饱和溶 液，适用于草本植物和柔软组织的灭菌处 理，时间为5-30min。
氯化汞灭菌效果好，但不易除去，时间 不易过长，以免杀死植物细胞，当其用于 休眠种子的灭菌剂最为理想，适用浓度为 0.1%，2-10min，种子皮较厚时可延长至 20min以上。
三、培养方法
• 培养对象：原生质体培养和单倍体细胞 培养等
• 培养基类型：固体培养和液体培养 • 培养方式：悬浮细胞培养和固定化细胞
培养
固体培养
• 包括利用琼脂作为支撑物的固体培养和固定化 细胞培养
• 特点：简便易行、培养所占空间少。 • 缺点：愈伤组织生长不平衡；阻碍组织呼吸、
堆积有害物质；细胞间极化现象；测定生理生 化指标时会改变其形态生理状态 • 最常用的固化剂：琼脂 • 一般温度保持为（25±1）℃
悬浮培养
• 分为静止和振荡两类 • 静止液体培养具有简便易行的特点，还不
会出现营养物质浓度差的现象。
● 振荡液体培养，使 悬浮细胞在液体培养 基中，不断振动下进 行培养。可以克服静 止培养的许多缺点。
成批培养法
• 将培养基一次性加入反应器中，接 种、培养一定时间后收获细胞的操 作方式。
• 反应器：气升式反应器 • 方法：两步培养法
• 钾、镁、钙、离子对细胞代谢必不可少，镁离子 参与多种辅酶和激活子的合成；钾离子、钙离子 可抑制某些酶的活性，有时钙离子也可保持某些 酶的活性或稳定性。微量元素的作用是参与辅酶 的形成，并可诱导酶的合成
2、碳源
• 植物细胞培养物通常为异养细胞。人们常 用碳源为碳水化合物、肌醇、甘油、乳糖 和半乳糖。有时培养基固化物（如琼脂） 也作为碳源。
常用灭菌剂有次氯酸钙、次氯酸钠和氯 化汞。
次氯酸钙为工业漂白粉过滤后的饱和溶 液，适用于草本植物和柔软组织的灭菌处 理，时间为5-30min。
氯化汞灭菌效果好，但不易除去，时间 不易过长，以免杀死植物细胞，当其用于 休眠种子的灭菌剂最为理想，适用浓度为 0.1%，2-10min，种子皮较厚时可延长至 20min以上。
三、培养方法
• 培养对象：原生质体培养和单倍体细胞 培养等
• 培养基类型：固体培养和液体培养 • 培养方式：悬浮细胞培养和固定化细胞
培养
固体培养
• 包括利用琼脂作为支撑物的固体培养和固定化 细胞培养
• 特点：简便易行、培养所占空间少。 • 缺点：愈伤组织生长不平衡；阻碍组织呼吸、
堆积有害物质；细胞间极化现象；测定生理生 化指标时会改变其形态生理状态 • 最常用的固化剂：琼脂 • 一般温度保持为（25±1）℃
悬浮培养
• 分为静止和振荡两类 • 静止液体培养具有简便易行的特点，还不
会出现营养物质浓度差的现象。
● 振荡液体培养，使 悬浮细胞在液体培养 基中，不断振动下进 行培养。可以克服静 止培养的许多缺点。
成批培养法
• 将培养基一次性加入反应器中，接 种、培养一定时间后收获细胞的操 作方式。
• 反应器：气升式反应器 • 方法：两步培养法
植物细胞培养的基本过程和方法
植物细胞培养的基本过程和方法植物细胞培养是一种将植物细胞体外培养的技术，其主要目的是为了研究细胞的生理、生化过程以及植物的生长发育等方面的问题，也可以用于植物遗传改良、利用细胞培养生产植物品种等领域。
下面将对植物细胞培养的基本过程和方法进行详细介绍。
1.材料准备：选择合适的植物组织作为培养材料，如茎段、叶片、根尖等。
同时还需要准备一些基本的实验仪器和培养基成分。
2.细胞分离：将选取的植物组织进行表皮剥离、细胞壁酶解等操作，将细胞分离出来。
可以使用显微镜观察细胞的分离程度。
3.培养基配制：根据不同的培养目的和植物类型，调配适合的培养基。
培养基通常包括无机盐、有机物、维生素、激素等成分，用于提供细胞生长所需的养分。
4.细胞培养：将分离得到的细胞悬浮在培养基中，将其培养在恒温恒湿的培养箱中。
培养箱中的温度和光照条件可以根据植物的特性进行调节。
5.观察和保存：定期观察细胞的生长情况，包括细胞的形态、分裂情况等。
同时可以进行细胞生长速率、物质代谢等方面的研究。
对于需要保存的细胞，可以使用液氮冷冻或低温贮藏的方法保存。
1.组织培养：将植物组织培养在含有适当激素的培养基上，促使其分化和增殖。
常用的组织培养方法包括愈伤组织培养、种子发芽培养、胚培养等。
2.悬浮细胞培养：将植物细胞分散在培养基中形成悬浮细胞。
可以利用悬浮细胞进行物质代谢、遗传变异等研究。
3.离体培养：将完整的植物器官（如茎尖、叶片等）切分成适当大小的组织块，培养在含有激素的培养基上，使其分化为根、茎、叶等组织。
4.离体器官培养：将完整的植物器官（如拟南芥的花蕾、水稻的胚等）取出，培养在含有细胞分裂素和植物生长素的培养基中，经过适当的处理后，可以使其分化为新的植株。
5.基因转化：将外源基因导入植物细胞中，使其产生新的表型特征。
常用的基因转化方法包括农杆菌介导的转化、基因枪轰击法等。
总之，植物细胞培养是一种重要的实验手段和研究方法，通过培养和处理植物细胞，可以为植物生物学和生物技术研究提供重要的理论基础和实验依据。
植物细胞培养-文档资料
四、悬浮细胞的同步化
细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细 胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的 分裂、代谢以及生理、生化状态等更趋复杂化， 所以人们一直希望通过一定的技术途径，使同一 培养体系中的细胞能保持相对一致的细胞学和生 理学状态，工作中常用的处理方法： 1、物理方法 1）分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处 于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的 细胞继代培养于同一培养体系中。
2）抑制剂法 通过一些DNA 合成抑制剂处理细胞，使细 胞停留在DNA 合成前期，当解除抑制后，即可 获得处于同一细胞周期的细胞。 常用的抑制剂有5-氟脱氧尿苷，5-氨基尿 嘧啶、羟基尿等。 3）有丝分裂阻抑 用秋水仙素处理指数生长的悬浮培养物，浓度 一般控制在0.2%，处理时间以4-6小时为宜。
3、悬浮培养细胞数目的增殖变化
细胞生长各个时期的特点：
滞后期（延迟期）:细胞很少分裂，其长短与接种 量大小和继代时原种细胞所处的生长期有关 对数生长期:细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长 速率保持不变直线生长期:细胞生长和发育最明显 的时期 缓慢期:生长逐渐缓慢,培养液消耗将尽，有毒代 谢物质增多，氧气减少。 静止期:生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极 少,甚至开始死亡。
机械搅拌式培养系统
气压搅拌式培养系统 考虑到机械搅拌式反应器的剪切作 用难以避免，同时搅拌器转动的中轴往 往是容易使培养物污染的部位，因此， 发展出空气提升式生物反应器，但其缺 点是搅拌不均匀
旋转式培养系统： 一般用于产品中 试或某些必需裂 解细胞才能获得 目的产物的培养， 其优点是控制精 确，处理灵活， 缺点是培养体积 较小。
第二部分 细胞培养 定义 ：植物细胞培养（plant cell
第4章植物细胞培养
第四章 植物细胞培养
二、悬浮系的建立与继代
悬浮培养物分散性良好，细 胞团较小；均一性好，细 胞形状和细胞团大小大致 相同；细胞生长迅速，悬 浮细胞的生长量一般2-3天 增加1倍。
第四章 植物细胞பைடு நூலகம்养
四、悬浮培养细胞的同步化
• 细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同 时通过细胞周期的某一特定时期。
其它
有机酸
酪醇 花青素 紫草宁 青蒿素 人参皂甙 莨菪碱 AA类似物 苦杏仁苷
类别
黄酮
酚 类 化 合醌 物
简单酚类
次生代谢产物 用途
银杏黄酮，大豆黄酮 治疗心血管疾病
芦丁，槲皮素
食品添加剂和化妆品
胡桃醌 紫草宁
抗菌，镇静 抗菌、抗炎、抗病毒、止血
香豆素
香料，抗菌消炎
萜
类
生物碱
紫杉醇 青蒿素
长春新碱 奎宁
●细胞平板培养 ●看护培养 ●微室培养 ●纸桥培养法
植物单细胞培养方法：
（一）平板培养法
• 分散的植物细胞接种于含薄层固体培养基的培 养皿内的培养过程称为平板培养法。
• 优点：①单细胞在培养基中分布均匀，便于在 显微镜下对细胞进行定点观察。
• ②由于它具有筛选效率高、操作简便等优点， 被广泛应用于细胞分裂、分化、生理生化、遗 传变异、次生代谢产物合成等。
具体方法:
撕去下表皮
露出叶肉细胞 用解剖刀刮下细胞
第二种方法：叶片研碎、离心
加研磨介质
研碎成粉 过滤、离心
只有薄壁组织排列松散，细胞间结 触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能 取得成功。
酶解法
Takebe等（1968）最早报道：用果胶酶处 理可以分离大量的叶肉细胞
植物细胞培养ppt课件
• 外植体：用来进行离体无菌培养的离体材料。
• 愈伤组织：外植体在离体培养条件下，细胞经脱分
化等一系列过程，产生一团不定型的疏散排列的薄 壁细胞（具有未分化细胞的特性）。
• 胚状体：由愈伤组织细胞诱导分化出具有胚芽，胚
根和胚轴的胚状结构。
• 不定芽：愈伤组织中的细胞发生分化，形成
不同的器官原基，再逐渐形成芽和根。
植物生长调节物质：
生长素类：NAA、IAA、IBA、2,4-D
细胞分裂素类：BAP, KT，TDz，ZT
pH值（5.8）
琼脂
精选ppt
15
• 封口：接种后，瓶，管用无菌药棉或盖封
口，培养皿用无菌胶带封口
• 温度（25度），pH（5-6）和氧气（5%）
• 增殖：在新梢（愈伤组织）等形成后，分
株或切段转入增殖培养基中继代培养。
3）分化期：分化期是指在分裂期的末期，细胞 内开始出现一系列形态和生理上的变化，从而 使愈伤组织内产生不同形态和功能的细胞。分 化出形态和功能不同的细胞，分生细胞、色素 细胞、纤维细胞等 。
精选ppt
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• 愈伤组织要求：松散性好、增殖快、再生能力强 。
外观一般为鲜艳的乳白或淡黄色，呈小颗粒状， 疏松易碎。
总的原则：健康无病的年幼组织。
精选ppt
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2）培养材料的消毒
材料
自来水和蒸 馏水冲洗
酒精中浸泡 30-60秒
无菌水 冲洗3遍
0.01%升汞 （HgCl2)消毒10 分钟
精选ppt
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3） 制备外植体
在无菌条件下将材料切成0.2-0.5cm厚的小片， 剥去芽的鳞片，嫩枝的外皮或种皮胚乳。
精选ppt
苗后用自来水冲洗干净；再移栽到准备好 的基质中。
细胞工程：植物细胞培养
抗癌化合物（Antitumor compounds） 喜树碱Camptothecin Homoharringtonine 鬼臼毒Podophyllotoxin 紫杉醇（Taxol）
西洋参（Ginseng）* 迷迭香酸Rosmarinic acid
对苯二酚葡糖苷Arbutin
植物细胞培养产物 ——食品添加剂Food additives
Glycine max；Nicotiana tabacum
Berberis wilsone；Catharanthus roseus；Tirptergium
wildordii（雷公藤）
Lithospermum erythrorhizon （紫草）；Vinca rosea
传统反应器
转筒反应器
适合于慢反应
0.1-1
Ca-Pantothenate -
Glycine
2
-
-
0.5
-
0.1
-
0.1
1
1
-
3
-
1,000 0.5 0.5 5 -
微量无机盐
组分
Murashige-Skoog (1962)
FeSO4× 7H2) Na2EDTA MnSO4× 4H2O ZnSO4× 7H2O CuSO4× 5H2O Fe2(SO4)3 NiC12× 6H2O CoC12× 6H2O A1C13 FeC13× 6H2O K1
Sucrose(g)
Murashige-Skoog White Heller
(1962)
(1963) (1953)
370 440 1,900 1,650 170
720
Байду номын сангаас
250
西洋参（Ginseng）* 迷迭香酸Rosmarinic acid
对苯二酚葡糖苷Arbutin
植物细胞培养产物 ——食品添加剂Food additives
Glycine max；Nicotiana tabacum
Berberis wilsone；Catharanthus roseus；Tirptergium
wildordii（雷公藤）
Lithospermum erythrorhizon （紫草）；Vinca rosea
传统反应器
转筒反应器
适合于慢反应
0.1-1
Ca-Pantothenate -
Glycine
2
-
-
0.5
-
0.1
-
0.1
1
1
-
3
-
1,000 0.5 0.5 5 -
微量无机盐
组分
Murashige-Skoog (1962)
FeSO4× 7H2) Na2EDTA MnSO4× 4H2O ZnSO4× 7H2O CuSO4× 5H2O Fe2(SO4)3 NiC12× 6H2O CoC12× 6H2O A1C13 FeC13× 6H2O K1
Sucrose(g)
Murashige-Skoog White Heller
(1962)
(1963) (1953)
370 440 1,900 1,650 170
720
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第四章 植物细胞培养方法(修改)
Байду номын сангаас
• ②最好微室的厚度不要超过20微米，盖
玻片 的厚度要在0.17~0.18毫米左右。 • ③观察时要保持温度和培养时的一致。
二.单细胞培养技术
• 5、饲养层培养基技术
• 其方法是：作饲喂层的细胞经射线照射后．核失 活不能分裂，但细胞仍存活。饲喂层细胞用平板
技术制成一琼脂(糖)平板．此平板亦即“伺喂
周围加石蜡油
旁边加石蜡油
盖盖玻片
盖盖玻片
置培养皿中26~28 ℃恒 温培养
平视图
二.单细胞培养技术
• （3）微室培养特点： ①能在显微镜下追踪单细胞分裂增殖形成 细胞团的全过程 ②培养基少，营养和水分难以保持，pH值 变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。
二.单细胞培养技术
• （4）微室培养要求：
• ①微室内不能有气泡。
二.单细胞培养技术
• • • • （3）特点： ①效果好，易于成功。 ②简便易行。 ③不能在显微镜下直接观察细胞的生长过 程。 • 注意：要得到单细胞系必须保证接种材料 是真正的单细胞。
二.单细胞培养技术
• （4）要求： • ①看护愈伤组织处于活跃生长状态； • ②愈伤组织和所要培养的细胞可以是同一个物种也 可以不同。 • 离体单细胞在直接培养技术下不分裂，看护培养 下则分裂，为什么？ • A.愈伤组织的存在给单细胞传递了某些生物信息； • B.愈伤组织为细胞的生长繁殖提供了某些物质条件， 主要是提供了营养物质和促进细胞分裂物质。
• （4）平板培养必须注意的方面
• ①选用的培养基，无论是否条件培养基，必须是能够在 低的初始植板密度下使细胞生长。 • ②不要选用处在静止期过久的细胞。因为处在分裂旺盛 时期的细胞才有最高的植板率。 • ③在固体培养基中适宜的初始植板密度因植物种类而不 同。如：烟草细胞适宜的为5~10 ×10 ³个/ml,若低于此 数则植板率显著下降。 • ④接种时培养基的温度要控制，一般不超过35 ℃ 。
• ②最好微室的厚度不要超过20微米，盖
玻片 的厚度要在0.17~0.18毫米左右。 • ③观察时要保持温度和培养时的一致。
二.单细胞培养技术
• 5、饲养层培养基技术
• 其方法是：作饲喂层的细胞经射线照射后．核失 活不能分裂，但细胞仍存活。饲喂层细胞用平板
技术制成一琼脂(糖)平板．此平板亦即“伺喂
周围加石蜡油
旁边加石蜡油
盖盖玻片
盖盖玻片
置培养皿中26~28 ℃恒 温培养
平视图
二.单细胞培养技术
• （3）微室培养特点： ①能在显微镜下追踪单细胞分裂增殖形成 细胞团的全过程 ②培养基少，营养和水分难以保持，pH值 变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。
二.单细胞培养技术
• （4）微室培养要求：
• ①微室内不能有气泡。
二.单细胞培养技术
• • • • （3）特点： ①效果好，易于成功。 ②简便易行。 ③不能在显微镜下直接观察细胞的生长过 程。 • 注意：要得到单细胞系必须保证接种材料 是真正的单细胞。
二.单细胞培养技术
• （4）要求： • ①看护愈伤组织处于活跃生长状态； • ②愈伤组织和所要培养的细胞可以是同一个物种也 可以不同。 • 离体单细胞在直接培养技术下不分裂，看护培养 下则分裂，为什么？ • A.愈伤组织的存在给单细胞传递了某些生物信息； • B.愈伤组织为细胞的生长繁殖提供了某些物质条件， 主要是提供了营养物质和促进细胞分裂物质。
• （4）平板培养必须注意的方面
• ①选用的培养基，无论是否条件培养基，必须是能够在 低的初始植板密度下使细胞生长。 • ②不要选用处在静止期过久的细胞。因为处在分裂旺盛 时期的细胞才有最高的植板率。 • ③在固体培养基中适宜的初始植板密度因植物种类而不 同。如：烟草细胞适宜的为5~10 ×10 ³个/ml,若低于此 数则植板率显著下降。 • ④接种时培养基的温度要控制，一般不超过35 ℃ 。
植物细胞培养
1、连续培养的特点 （1）由于不断加入新鲜培养基，保证了养分的充 分供应，不会出现悬浮培养物发生营养不足的现象。 （2）可在培养期间使细胞保持在对数生长期中。 细胞增殖速度快。 （3）适于大规模工业化生产。
2、连续培养的种类
封闭式连续培养：系统中的细胞数目不断增加。
开放式连续培养：系统中的细胞密度保持恒定。
二、培养类型和方法
（一）成批培养 指把细胞分装在一定容积的培养基中进行培养， 当培养物增殖到一定量时，转接继代，建立起单细 胞培养物。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生 化研究常用的培养方法。
1、成批培养法
（1）细胞生长在固定体积的培养基上，直至培养基中的 养分为细胞耗尽为止。 （2）用适当搅拌的方法增加和维持游离细胞和细胞团在 培养基中的均匀分布。 （3）在整个培养过程中，细胞数目会不断发生变化，呈 现出明显的慢-快-慢，最后增长停止的细胞生长周期。 （4）成批培养结束后，若要进行下一批培养，必须另外 进行继代培养，其方法是用注射器吸取一定量的含单细胞 和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养 瓶里，继续进行培养。
细 胞 数 目 静止期 缓慢期
直线生长期
对数增长期
延滞期
时间
细胞生长周期
（二）半连续培养
指每隔一定时间后倒出一半的悬浮液， 并同时补充加入等量新鲜培养液。能重复 地取得大量、均一的培养细胞，供生物研 究之用。
（三）连续培养
是利用特制的培养容器进行大规模细胞培 养的一种方式。 在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并 注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分 补充，保持其恒定体积的培养。
封闭型连续培养：在培养过程中，排除的旧培养基 由加入的新鲜培养基进行补充，进出数量保持平衡， 从而使培养系统中营养物质的含量总是超过细胞生 长的需要。 悬浮在排除液中的细胞经机械方法收集后再放回培 养系统中，因此在这样培养方式中，随着培养时间 延长，细胞密度不断增加。
植物组织细胞培养
植物组织细胞培养步骤：植物组织培养的简单过程如下：剪接植物器官或组织——经过脱分化（也叫去分化）形成愈伤组织——再经过再分化形成组织或器官——经过培养发育成一颗完整的植株。
培养步骤第一步，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。
把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放入为宜。
置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。
易漂浮或细小的材料，可装入纱布袋内冲洗。
流水冲洗在污染严重时特别有用。
洗时可加入洗衣粉清洗，然后再用自来水冲净洗衣粉水。
洗衣粉可除去轻度附着在植物表面的污物，除去脂质性的物质，便于灭菌液的直接接触。
当然，最理想的清洗物质是表面活性物质—吐温。
第二步是对材料的表面浸润灭菌。
要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、无菌水、手表等。
用70%酒精浸10～30秒。
由于酒精具有使植物材料表面被浸湿的作用，加之70%酒精穿透力强，也很易杀伤植物细胞，所以浸润时间不能过长。
有一些特殊的材料，如果实、花蕾、包有苞片、苞叶等的孕穗，多层鳞片的休眠芽等等，以及主要取用内部的材料，则可只用70%酒精处理稍长的时间。
处理完的材料在无菌条件下，待酒精蒸发后再剥除外层，取用内部材料。
第三步是用灭菌剂处理。
表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取1—2种使用见表。
第四步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，涮洗3-l0次左右。
无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用注意：①酒精渗透性强，幼嫩材料易在酒精中失绿，所以浸泡时间要短，防止酒精杀死植物细胞。
②老熟材料，特别是种子等可以在酒精中浸泡时间长一些，如种子可以浸泡5分钟。
③升汞的渗透力弱，一般浸泡10分钟左右，对植物材料的杀伤力不大。
④漂白粉容易导致植物材料失绿，所以对于幼嫩材料要慎用。
⑤在消毒液中加入浓度为0.08—0.12%的吐温20或80（一种湿润剂），可以降低植物材料表面的张力，达到更好的消毒效果。
植物细胞培养
优点：
简便、成功率高
缺点：
不能在显微镜 下直接观察
此法适用于难于培养的植物种类
3、液体浅层培养
技术：先将细胞制成一定密度的细胞悬浮液，用吸
管将悬浮液移到培养皿中形成浅层，一般1mm左右，
石蜡膜封口，静置培养。 优点：、培养物与空气接触面大，通气性好； 、细胞代谢产物容易扩散，不会造成有害 物质的危害； 、继代培养方便、便于观察。 缺点：由于细胞可以游动，不能进行定点观察
3、生物反应器培养系统
悬浮培养系统 固定化培养系统
1）、悬浮培养系统
类型 气升搅拌式 机械搅拌式 鼓泡式 溶氧 高 中 中 破坏性 混合度 低 强 低 均匀 较均匀 不均匀 限制因素 细胞浓度高时有死角 细胞浓度高时混合不匀 有死角，发生细胞沉降
悬浮培养系统
机械搅拌式
气升搅拌式
2）、固定化培养系统
六、悬浮细胞培养方法
分批培养法 半连续培养法 连续培养法
分批培养法： ● 是一种封闭的培养体系，培养过程 中不放出培养液，也不补加培养液； ● 培养方法：旋转培养；往返培养； 旋转振动；搅动培养；
半连续培养法
在培养过程中，每隔一定时间更换一部 分培养液或添加某种营养成分。
连续培养法
(4)高密度的细胞群体，可建立细胞间的物理、化 学联系，细胞位置的相对固定，有利于物化梯度的
建立，更有利于产物的合成;
(5)环境条件易于控制，次生代谢物易于释放。
存在的问题：a 产物释放 b 氧、养分传递
固定化细胞活力的测定：
染色法：
如用二乙酸荧光素（FDA）：活细胞能吸
收并降解产生荧光，死亡细胞则无此现象。
(2) 前提条件： a 添加的有机物无毒害作用 b 产物溶于有机物或被其吸收 c 两相易分离，有利于产物回收 d 有机物等不吸收培养基中的有效成分
植物细胞工程课件第四章细胞规模化培养技术
培养条件的控制与调节
温度
大多数细胞的最佳生长温度为37°C ，但不同细胞可能有所差异。
湿度
培养环境中的湿度对细胞的生长也有 影响，通常需要维持一定的湿度水平 。
pH值
培养基的pH值对细胞的生长至关重 要，大多数细胞的最佳pH值为7.27.4。
气体环境
细胞培养过程中的气体环境，如氧气 和二氧化碳的浓度，也会影响细胞的 生长和代谢。
产物检测分析
利用植物细胞规模化培养技术，可以对产生的代谢产物进行检测和分析 ，了解产物的性质和作用机理，为后续的应用研究提供依据。
THANKS。
高效性
规模化培养技术可以获得大量的细胞，提高了生产效率和 经济效益。
可控性
通过调节培养条件，如温度、pH、营养物质等，可以控 制细胞的生长和代谢过程。
灵活性
可以根据需要选择不同的细胞类型、培养基和培养条件， 以适应不同的应用需求。
培养技术的历史与发展
历史
细胞规模化培养技术始于20世纪50年代，最初是用于生产疫苗和单克隆抗体。 随着技术的不断发展和改进，现在已广泛应用于生物医药、农业、环保等领域 。
培养基的组成与优化
01
02
03
营养成分
培养基中需要包含细胞生 长所需的营养成分，如碳 源、氮源、无机盐等。
生长因子
某些细胞还需要特定的生 长因子才能正常生长，这 些生长因子通常由血清或 胰蛋白酶抑制剂等提供。
优化培养基
根据具体的细胞类型和培 养目的，需要对培养基的 组成进行优化，以满足细 胞的特定需求。
03
细胞规模化培养技术的操作流 程
细胞培养的准备阶段
确定培养目标
明确细胞培养的目的，如 生产次生代谢产物、细胞 生长研究等。
植物细胞培养及原生质体培养
•植物细胞培养及原生质体培养
3.单细胞培养：对单离的细胞进行培养的方 法。
（1）平板培养法：分散的植物细胞接种于含薄层固 体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。。
方法是将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶酶 等)消化分散的细胞，洗涤离心除酶，细胞浓缩物经 计数及稀释，接种到加热熔化而刚冷却至35℃左有 的固体培养基中充分混匀，倾入培养皿中，石蜡密 封，于25℃含5％CO2空气的培养箱中培养，细胞即 可生长成团。
(3) 悬浮培养特点：
培养过程中细胞总数不断增加，一定时间后产量达 最高点，生长趋于停止。然后进行移植继代培养，其过 程表现出严格可重复周期性变化，细胞增长规律与微生 物相同，有延迟期、对数生长期、减慢期及静止期等阶 段。植物细胞接种时要达到一定细胞浓度，通常为0. 25 x l0‘细胞／ml 一0. 5 x 10‘细胞／m1。
•植物细胞培养及原生质体培养
（四）细胞培养过程： 1. 择适宜的外植体； 2. 诱导疏松愈伤组织； 3. 选择适宜的培养基； 4. 悬浮培养； 5. 悬浮细胞的继代与选择； 6. 悬浮细胞的同步化； 7. 悬浮愈伤组织形成及植株再生。
•植物细胞培养及原生质体培养
水稻细胞悬浮培养及植株再生：
1.愈伤组织的诱导： (1)取水稻种子，人工去皮后用70％酒精表面消毒2 分钟，再用2．5％次氯酸钠水溶液浸泡并轻轻搅动 30分钟。 (2)将种子用无菌蒸馏水冲洗3次，按每瓶3粒接入 附加2mg／L 2，4—D、3％蔗糖、0．3％酵母提取 物的Ms固体培养基中，25℃黑暗下培养、诱导愈伤 组织。 (3) 3周后，将从胚部长出的愈伤组织切割，并转移 到新鲜培养基上继代培养，每2周继代1次。 (4)挑选疏松、易碎的愈伤组织进行继代、增殖．
•植物细胞培养及原生质体培养
3.单细胞培养：对单离的细胞进行培养的方 法。
（1）平板培养法：分散的植物细胞接种于含薄层固 体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。。
方法是将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶酶 等)消化分散的细胞，洗涤离心除酶，细胞浓缩物经 计数及稀释，接种到加热熔化而刚冷却至35℃左有 的固体培养基中充分混匀，倾入培养皿中，石蜡密 封，于25℃含5％CO2空气的培养箱中培养，细胞即 可生长成团。
(3) 悬浮培养特点：
培养过程中细胞总数不断增加，一定时间后产量达 最高点，生长趋于停止。然后进行移植继代培养，其过 程表现出严格可重复周期性变化，细胞增长规律与微生 物相同，有延迟期、对数生长期、减慢期及静止期等阶 段。植物细胞接种时要达到一定细胞浓度，通常为0. 25 x l0‘细胞／ml 一0. 5 x 10‘细胞／m1。
•植物细胞培养及原生质体培养
（四）细胞培养过程： 1. 择适宜的外植体； 2. 诱导疏松愈伤组织； 3. 选择适宜的培养基； 4. 悬浮培养； 5. 悬浮细胞的继代与选择； 6. 悬浮细胞的同步化； 7. 悬浮愈伤组织形成及植株再生。
•植物细胞培养及原生质体培养
水稻细胞悬浮培养及植株再生：
1.愈伤组织的诱导： (1)取水稻种子，人工去皮后用70％酒精表面消毒2 分钟，再用2．5％次氯酸钠水溶液浸泡并轻轻搅动 30分钟。 (2)将种子用无菌蒸馏水冲洗3次，按每瓶3粒接入 附加2mg／L 2，4—D、3％蔗糖、0．3％酵母提取 物的Ms固体培养基中，25℃黑暗下培养、诱导愈伤 组织。 (3) 3周后，将从胚部长出的愈伤组织切割，并转移 到新鲜培养基上继代培养，每2周继代1次。 (4)挑选疏松、易碎的愈伤组织进行继代、增殖．
•植物细胞培养及原生质体培养
植物细胞培养方法
植物细胞培养方法
2013-8-6 1
植物细胞培养根据不同的方法可分为不 同的类型。 1.按对象分： （1）单倍体细胞培养 主要用花药在人工培 养基上进行培养，可以从小孢子（雄性生 殖器官）直接发育成胚状体，然后长成单 倍体植株；或者通过愈伤组织诱导分化出 牙和根，最终长成植株。
2013-8-6
2
目前，单倍体细胞培养已在植物育种中取 得了很大成就花药Leabharlann 养2013-8-63
辣 椒 花 药 培 养 单 倍 体 育 种
2013-8-6 4
（2）原生质体培养 一般用植物细胞(二倍体 细胞）经纤维素酶和果胶酶去掉细胞壁， 去壁的细胞即为原生质体。原生质体在良 好的无菌培养基上可以生长、分裂，最终 可长成植株。 原生质体培养可用于蔬菜育种。
2013-8-6
2013-8-6
9
固 体 培 养
2013-8-6
10
（2）液体培养 分静止和震荡两类 禁止培养 不需任何设备，适合于某些原生 质体培养。 震荡培养 需要摇床或转床等设备，使培养 物和培养基保持充分混合以利于气体交换。
2013-8-6
11
3.按培养方式不同分： （1）悬浮培养 将植物细胞或较小的 细胞团 悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过 程中能够保持良好的分散状态。 （2）固定化培养 将植物细胞包埋于高分子 化合物（如海藻盐、卡拉胶等）网络中， 然后进行培养。 这种培养方法使细胞位置固定，已获得 高密度细胞群体，利于细胞组织分化，易 于控制培养条件易获得代谢产物。
5
薯 类 育 种
2013-8-6
6
植物体细胞杂交 过程： 去壁→ 融合→ 筛选→ 培养 优点：克服了远缘杂交不亲和性的障碍 。
2013-8-6
2013-8-6 1
植物细胞培养根据不同的方法可分为不 同的类型。 1.按对象分： （1）单倍体细胞培养 主要用花药在人工培 养基上进行培养，可以从小孢子（雄性生 殖器官）直接发育成胚状体，然后长成单 倍体植株；或者通过愈伤组织诱导分化出 牙和根，最终长成植株。
2013-8-6
2
目前，单倍体细胞培养已在植物育种中取 得了很大成就花药Leabharlann 养2013-8-63
辣 椒 花 药 培 养 单 倍 体 育 种
2013-8-6 4
（2）原生质体培养 一般用植物细胞(二倍体 细胞）经纤维素酶和果胶酶去掉细胞壁， 去壁的细胞即为原生质体。原生质体在良 好的无菌培养基上可以生长、分裂，最终 可长成植株。 原生质体培养可用于蔬菜育种。
2013-8-6
2013-8-6
9
固 体 培 养
2013-8-6
10
（2）液体培养 分静止和震荡两类 禁止培养 不需任何设备，适合于某些原生 质体培养。 震荡培养 需要摇床或转床等设备，使培养 物和培养基保持充分混合以利于气体交换。
2013-8-6
11
3.按培养方式不同分： （1）悬浮培养 将植物细胞或较小的 细胞团 悬浮在液体培养基中进行培养，在培养过 程中能够保持良好的分散状态。 （2）固定化培养 将植物细胞包埋于高分子 化合物（如海藻盐、卡拉胶等）网络中， 然后进行培养。 这种培养方法使细胞位置固定，已获得 高密度细胞群体，利于细胞组织分化，易 于控制培养条件易获得代谢产物。
5
薯 类 育 种
2013-8-6
6
植物体细胞杂交 过程： 去壁→ 融合→ 筛选→ 培养 优点：克服了远缘杂交不亲和性的障碍 。
2013-8-6
高中生物精品资源第四章 植物细胞培养与次生代谢产物的生产课件高中生物竞赛
•世界现代制药工业起步于第二次世界大战后的国际经济复兴。 •药品的巨大的社会效益和经济效益，刺激了制药工业在50-70年代以较高
的速度蓬勃发展。
药用植物及其制成保健食品、化妆品等每年进,药用植物细胞大量培养技术正成为 国际上名贵珍稀天然药物开发的新目标,目前已经从400多种植物建立了组 织和细胞培养体系,从中分离出600多种代谢产物,其中40多种化合物在数量 上超过或等于原植物
玫瑰鲜花在清晨摘下后24小时内即取出黄褐色的玫瑰精油，大约五吨 重的花朵只能提炼出两磅的玫瑰油，所以是全世界最贵的精油之一
茉莉精油被称为“精油之王”。茉莉精油产量 极少因而十分昂贵，其具有高雅气味，可舒缓 郁闷情绪、振奋精神、提升自信心，同时可护 理和善肌肤干燥、缺水、过油及敏感的状况， 淡化妊娠纹与疤痕，增加皮肤弹性，让肌肤倍 感柔嫩。
悬浮培养基本分为：分批式、流加式、连续式、半连续式培养
1)分批培养(batch culture) 是指在培养过程中，既不向系统中补加培养基， 也不从系统中排出培养物（包括培养基和细胞），也就是说一次性加入培养 基，在一定条件下培养一段时间后，一次性收获。
国内外细胞培养的研究进展
1）重点放在细胞培养上（过去） 细胞培养的优点是生物量生长快，但也有次生代谢产物的含量不稳定
和不易与大田栽培接轨等明显的缺点。
2）植物组织和器官培养具有更重要的意义。
初级代谢物、次生代谢物对细胞、植物的意义 植物合成次生代谢产物的目的是其自身生理代谢的需要，在细胞阶段，往往不 需要合成，但到了组织和器官阶段，合成的需要就会加强。因此，培养药用植 物的组织和器官，更容易获得次生代谢产物。
第四章 植物组织培养生产次生代谢产物
一、植物组织培养生产次生代谢物质的目的意义 二、植物细胞培养生产次生代谢产物
的速度蓬勃发展。
药用植物及其制成保健食品、化妆品等每年进,药用植物细胞大量培养技术正成为 国际上名贵珍稀天然药物开发的新目标,目前已经从400多种植物建立了组 织和细胞培养体系,从中分离出600多种代谢产物,其中40多种化合物在数量 上超过或等于原植物
玫瑰鲜花在清晨摘下后24小时内即取出黄褐色的玫瑰精油，大约五吨 重的花朵只能提炼出两磅的玫瑰油，所以是全世界最贵的精油之一
茉莉精油被称为“精油之王”。茉莉精油产量 极少因而十分昂贵，其具有高雅气味，可舒缓 郁闷情绪、振奋精神、提升自信心，同时可护 理和善肌肤干燥、缺水、过油及敏感的状况， 淡化妊娠纹与疤痕，增加皮肤弹性，让肌肤倍 感柔嫩。
悬浮培养基本分为：分批式、流加式、连续式、半连续式培养
1)分批培养(batch culture) 是指在培养过程中，既不向系统中补加培养基， 也不从系统中排出培养物（包括培养基和细胞），也就是说一次性加入培养 基，在一定条件下培养一段时间后，一次性收获。
国内外细胞培养的研究进展
1）重点放在细胞培养上（过去） 细胞培养的优点是生物量生长快，但也有次生代谢产物的含量不稳定
和不易与大田栽培接轨等明显的缺点。
2）植物组织和器官培养具有更重要的意义。
初级代谢物、次生代谢物对细胞、植物的意义 植物合成次生代谢产物的目的是其自身生理代谢的需要，在细胞阶段，往往不 需要合成，但到了组织和器官阶段，合成的需要就会加强。因此，培养药用植 物的组织和器官，更容易获得次生代谢产物。
第四章 植物组织培养生产次生代谢产物
一、植物组织培养生产次生代谢物质的目的意义 二、植物细胞培养生产次生代谢产物
植物细胞培养
植物细胞培养植物细胞培养是一项重要的生物学研究技术，通过将植物细胞放入适宜的培养基中，提供适宜的养分和生长条件，使其在无菌条件下进行繁殖和生长。
这项技术在植物生物技术和植物育种研究中有着广泛的应用，可以用于植物组织培养、植物再生、基因工程、植物病毒研究等方面。
接下来，我将详细介绍植物细胞培养的原理、步骤、方法及其应用。
一、植物细胞培养的原理植物细胞培养的原理是利用植物细胞的分裂和再生能力，在培养基上形成功能完整的植株。
培养基中提供的养分和生长因子可以满足植物细胞的营养需求，而适宜的温度和光照条件则有利于细胞分裂和再生。
在无菌条件下进行培养，可以避免外界的微生物污染和干扰，保证细胞培养的成功率。
二、植物细胞培养的步骤植物细胞培养主要包括材料准备、杀菌、建立无菌培养条件、组织处理、细胞培养和植株再生等步骤。
1.材料准备：选择适宜的植物材料，如幼苗的茎尖、子叶、胚乳、花药等作为外植体。
同时准备培养基、培养器具和培养条件所需的试剂和设备。
2.杀菌：将外植体浸泡在含有杀菌剂的溶液中，进行表面消毒，以去除外植体表面的细菌和真菌。
3.建立无菌培养条件：在无菌操作台上进行操作，使用无菌培养器具和培养基，保持操作环境的无菌状态。
4.组织处理：将外植体切割成适当的大小，要求每个组织片段都含有足够的细胞和组织分化能力。
5.细胞培养：将组织片段放置在含有适宜濃度的培养基中，提供适宜的养分和生长因子，调节温度和光照条件，使细胞进一步分裂和分化。
6.植株再生：当细胞分裂和分化达到一定程度时，可以通过调节培养基的成分和添加适宜的激素来诱导细胞形成胚乳、芽和愈伤组织，最终形成功能完整的植株。
三、植物细胞培养的方法植物细胞培养可以通过不同的方法来实现，包括愈伤组织培养、悬浮细胞培养、胚愈伤组织培养等。
1.愈伤组织培养：将外植体的某些部位培养在含有适宜生长因子的培养基上，刺激组织的分裂和分化，形成愈伤组织，进而形成植株。
2.悬浮细胞培养：将植物细胞分散在液体培养基中，进行无瓶培养。
植物细胞培养技术
植物单细胞的获取
一、从外植体直接分离细胞
（一）、机械捣碎法 先将叶片等外植体轻轻捣碎，然后 通过过滤和离心分离细胞。
优点： 1、获得的植物细胞没有经过酶 的 作用，不会受伤害。 2、不需要经过质壁分离，有利于进行生 理生化研究。
缺点： 由于受到机械作用，细胞结构会受到一 定的伤害，获得完整的细胞团或细胞数量少。
B、成批培养的方法
(1)旋转培养 (2)往返震荡培养 (3)旋转震荡培养 (4)搅动培养
（2）、连续培养 含义：指在培养过程中，以不断抽取悬
浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培 养物不断得到养分补充，保持其恒定体 积的培养。
A、连续培养的特点：
（1）新鲜培养基的不断加入,保证了
养分的充分供应； （2）可使细胞保持在增殖旺盛的对 数生长期中； （3）适于大规模工业化生产
植物下细胞培养技术
植物细胞培养技术的概念
植物细胞培养：是指从植物体中获 得 植物细胞，然后在一定的条件下培养， 以获得所需的细胞或各种产物的技术过 程。
植物细胞培养技术的理论 基础
植物细胞的全能性：植物的每个细胞都包 含着该物种的全部遗传信息，从而具备发育成完 整植株的遗传能力。 细胞分化：细胞在生长发育的过程中，在形 态、结构、生理功能等方面发生某些特异性差异 的过程。 脱分化：在某些特定条件下，分化细胞的基 因活动模式会发生可逆的变化，重新回到未分化 状态，这个过程成为脱分化。
细胞悬浮培养
（一）含义及特点 1、含义：将离体的植物细胞悬浮在液体培养
基中进行的无菌培养
2、特点
1）细胞可不断增殖，形成高密度的细胞群体， 适于大规模培养； 2）能够提供养类型和方法
成批培养 连续培养
（1）、成批培养/分批培养
修改第四章植物离体快速繁殖ppt课件
6. 鳞茎型 百合的鳞茎切块接种在不同激素配比的修改的MS培养
基上，鳞片基部近轴面或在边缘直接形成带根的小鳞茎。而 卷母的二、三年生幼嫩鳞片，可不经过愈伤组织直接形成小 瘤状或叶状体，再将其切块及时移入修改的ER培养基上，二、 三个月后诱导出与自然界条件下生长相同的贝母鳞茎。
系数高,首先证明 甘蔗、胡萝卜、
细胞的全能性
石刁柏等
原球茎型 球茎芽型
块茎型 鳞茎型
由茎尖或腋芽产生原 遗传稳定,原球茎可作
球茎
为繁殖系母体
兰花
叶柄表面产生圆球形 遗传稳定,球茎芽可直 球茎芽,一端出根另一 接放入土中种植
端出芽
观赏海棠
叶片叶柄上形成粒状 块茎芽可作为繁殖母体,
芋块,进一步分化出根 不断切割繁殖移栽,成
4. 球茎芽型 不同发育阶段的球茎都是茎或枝条的变态形式。由非
茎尖或侧芽的外植体不经脱分化的愈伤组织，直接从圆球茎 分化出芽和根器官的方式叫球茎芽型。
5. 块茎型 块茎是膨大的地下茎，其表面有芽眼。当花叶芋的
叶片或叶柄接种在培养基上，先形成类似愈伤组织的小硬突 起，并逐渐形成粒状的芋块。随着小芋块的增大，分化出的 芽也越密集并形成许多小苗，在小苗基部与芋块交接处分化 出白色的根，与正常块茎切块繁殖的幼苗相同，即首先形成 有分化能力的块茎（芋块），然后在块茎上分化出小芋块， 再在其上分化出芽和根，最后生长发育成小植株。
（4）利用2,4-D和IAA可延缓多酚合成，减轻褐化的产生， 但外植体在高浓度的2,4-D下培养时间过长，愈伤组织变得 松软、呈水渍状，失去分化能力。 （5）降低培养基中的pH值控制酚氧化酶活性和底物利用率， 因为这种酶在pH=6.5时活性最强。
（6）改变氧化-还原势常用的还原剂有维生素C、柠檬酸、 巯基乙醇、谷胱甘肽、二硫苏糖醇、半胱氨酸等。使用方法 可以在外植体材料消毒前快速浸入其中30秒～60秒，浸泡时 间不可过长，否则外植体褐变会更加严重，因为抗氧化剂对 外植体有一定毒害作用；或用它们浸湿滤纸并在其上进行外 植体的切割。
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一.概述
• 3、植物细胞培养技术的优点 （1）可控制条件下生产有价值次级代谢产物； （2）细胞增殖速度快； （3）生产力不受自然条件的影响； （4）产品的产量和质量稳定，并具生产灵活性； （5）可进行特定的生物转化反应，即把各中初级 化合物转化成医药等更有效的化合物。
一.概述
• 例如：两种不同方式生产紫草宁的比较
二.单细胞培养技术
• ③制平板：细胞悬浮液与融化状态（35 ℃ ） 条件培养基按一定比例均匀混合，倒成平 板，盖上培养皿盖。用封口膜封严培养皿。 • ④培养： 26℃置暗处培养21天。低倍显微 镜观察， 记数单细胞或小细胞团，计算置 板效率（也称植板率）。 • 植板效率（或植板率）：已形成细胞团的 百分数（即每100个铺在平板上的细胞中有 多少个能长出细胞团）。
二.单细胞培养技术
• • • • 2.由组织培养分离单细胞 步骤： ①诱导产生愈伤组织； ②愈伤组织反复继代，使组织不断增 殖，提高愈伤组织的松散性。 • ③将愈伤组织在液体培养基中培养，建立 悬浮培养系。
二.单细胞培养技术
• 在植物的组织培养中，从一块外植体形成典型的 愈伤组织，大致要经历三个时期：启动期、分裂 期和形成期。 启动期是指细胞准备进行分裂的时期。外源植物 生长素对诱导细胞开始分裂效果很好。 常用的有：2,4－D、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸 （IAA）、吲哚丁酸（IBA）等。通常使用细胞分 裂素和生长素比例在1:l或是小于1来诱导植物愈伤 组织的形成。
二.单细胞培养技术
• (一)植物单细胞培养的意义 • 1、有利于获得纯细胞系，悬浮培养细胞间细胞间在遗传、 生理和生化上存在差异，这些差异反映在它们的产量、品 质、抗病虫性和抗逆性等方面。如果能将高抗、高产、高 品质的细胞株筛选出来，无疑会带来巨大的经济效益。 2、有利于排除体细胞的干扰，进行细胞特性、细胞生长 规律、细胞代谢过程及其调节控制规律等方面的研究； 3、有利于对细胞活动跟踪观察，观察细胞个体的分裂、 分化、生长和繁殖情况； 4.有利于生物转化和天然化合物的生产。
二.单细胞培养技术
• 2. 液体浅层培养 • 将悬浮在培养液中的细胞过滤，得到游离单 细胞和小细胞团培养在浅层液体培养基中。 • 用途：主要用来增殖细胞 • 特点：有利于有毒物质的扩散； • 有利于气体交换； • 不利于定点观察； • 单细胞生长、分裂后，难以得到单细胞系。
液体浅层培养
将悬浮在培养液中的细胞过滤得到游离单细胞 和小细胞团
一.概述
• 4. 与微生物相比，植物细胞具有的特性 • 细胞大，细胞壁以纤维素主要成分，耐拉不耐 扭，抗剪切能力低； • 生长速率慢，为防止培养过程中染菌，需加抗生 素； • 细胞培养需氧，而培养液粘度大，且不能强力通 风搅拌； • 产物在细胞内且产量低； • 细胞常生长成各种大小的团块，增加了悬浮培养 的难度等。
二.单细胞培养技术
• • • • （3）特点： ①效果好，易于成功。 ②简便易行。 ③不能在显微镜下直接观察细胞的生长过 程。 • 注意：要得到单细胞系必须保证接种材料 是真正的单细胞。
二.单细胞培养技术
• （4）要求： • ①看护愈伤组织处于活跃生长状态； • ②愈伤组织和所要培养的细胞可以是同一个物种也 可以不同。 • 离体单细胞在直接培养技术下不分裂，看护培养 下则分裂，为什么？ • A.愈伤组织的存在给单细胞传递了某些生物信息； • B.愈伤组织为细胞的生长繁殖提供了某些物质条件， 主要是提供了营养物质和促进细胞分裂物质。
周围加石蜡油
旁边加石蜡油
盖盖玻片
盖盖玻片
置培养皿中26~28 ℃恒 温培养
平视图
二.单细胞培养技术
• （3）微室培养特点： ①能在显微镜下追踪单细胞分裂增殖形成 细胞团的全过程 ②培养基少，营养和水分难以保持，pH值 变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。
二.单细胞培养技术
• （4）微室培养要求：
• ①微室内不能有气泡。
二.单细胞培养技术
• 分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分 化，不断分裂、增生子细胞的过程。分裂 期愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构 疏松，颜色浅而透明。 • 分化期是指在分裂的末期，细胞内开始出 现一系列形态和生理上的变化，从而使愈 伤组织内产生不同形态和功能的细胞。这 些细胞类型有薄壁细胞、分生细胞、色素 细胞、纤维细胞等等。
二.单细胞培养技术
植板率评估：它以能长出细胞团的单细胞 在接种单细胞中所占的比例来表示。 植板率(％)＝(形成的细胞团数/接种的细胞 数)×100％
二.单细胞培养技术
• 计算式中每个平板新形成的细胞团数的计 数方法有两种： • 一是直接计数法，注意计量时要掌握合适 的时间，即细胞团肉眼已能分辨，但尚未 长合到一起的时候。 • 二是感光法，在暗室的红光下将一印相纸 放于欲计数的培养皿下，其上放一光源使 培养皿中细胞团印到相纸上，冲洗照片计 数。
二.单细胞培养技术
• 4、微室培养
• （1）微室培养的概念及用途 • ①概念：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室 中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方 法，称微室培养。 • ②用途：主要用来观察细胞生长、分裂、形成细胞 团的过程。
• （2）微室培养的技术
凹穴载玻片
1滴含单细胞培养 液
第四章 植物细胞培养方法
杨柏云
南昌大学生命科学学院
一.概述
• 1、细胞培养技术的概念： • 是指在人工控制条件下，高密度地培养有 用细胞的技术。 • 2、细胞培养技术的目的： • 增殖由基因重组、细胞融合、细胞突变等 获得的新型有用细胞。 • 生产人类必需的、不可缺少的有用物质， 如药物和工业原料等。
二.单细胞培养技术
• ②用途：是为了分离单细胞无性系，研究 其生理、生化遗传上的差异而设计的一种 单细胞培养技术。广泛应用于细胞、原生 质体及融合产物的培养。
二.单细胞培养技术
• （2）特点：可以定点观察；分离单细胞系 比液体浅层培养容易；培养细胞气体交换 不畅。
One of the most widely used method for single cell cultrue
培养在浅层液体培养基中
液体培养基 用途：主要用来增殖细胞。
3、看护培养
恒温 培养 1个 月
Single cell Filter paper
Nurse callus
2~3月
单细胞无性系
用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使 其生长和增殖。这个愈伤组织称块为看护愈伤组织
二.单细胞培养技术
• （1）看护培养的含义及用途 • 概念：指用一块活跃生长的愈伤组织来看 护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。 • 用途：诱导形成单细胞系。 • Muir(1954)首先用此法培养出烟草单细胞株。 Sharp(1972)成功将此法用于番茄的花粉培 养，诱导花粉形成单倍体细胞系。
常用的外植体及接种方法
从叶片上诱导出愈伤组织
从芽上诱导出愈伤组织
从茎段上诱导出愈伤组织
愈伤组织增殖与分化
各种各样的愈伤组织
愈伤组织的继代培养
分离
二.单细胞培养技术
• (3)通过原生质体再生获取植物细胞
二.单细胞培养技术
• (三)单细胞培养的方法
1、固体平板培养法 • （1）概念及用途： • ①概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的 细胞密度，接种在1mm左右的薄层固体培养基上 进行培养，称之为固体平板培养 。 • 或者是将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合 后平铺一薄层在培养皿底上的培养方法。该方法 是Bergmann(1960年)首创。
二.单细胞培养技术
• (二)植物细胞的获取 • 1.从外植体直接分离植物细胞 • 外植体经过切割、捣碎或酶解，然后经过一定孔径的不锈 钢筛网过滤，得到细胞悬浮液。悬浮液中所含的完整细胞 数量较少，但分散性好。 • 要直接从植物器官中分离单细胞，通常采用机械法和酶解 法。 • 叶片是由从外植体分离单细胞的最好材料 • (1)机械法： • 第一种方法：用刀片刮叶片； • 第二种方法：先把叶片轻轻研碎； • 上述二种方法，都要通过过滤和离心净化细胞。
• • 完整植株 收获时间 紫草宁浓度（％干重） 2～3年 1～2 14
• 植物细胞培养 3周
单细胞培养 根据培养对象 单倍体培养 原生质体培养 悬浮培养（液体培养） 根据培养基类型
固体培养(固相化培养)
一.概述
细胞培养与组织培养不同的是： 细胞培养的目的不是使细胞形成组织以 致更多的植物体，而是通过大规模的细 胞培养已获得人类所需的细胞次生代谢 产物。
Think over what the advantages and disadvantages are for it.
二.单细胞培养技术
• （3）平板培养的基本技术 • ①培养基配制 • 1.4%琼脂基本培养基+等量细胞培养液=0.7 % 琼脂条件培养基。 • ②悬浮细胞密度的调制 • 平板培养要求最初细胞密度（即初始植板密 度）为1×10 ³ 100×10 ³个/ml 。 ~ • 初始植板密度：单细胞固体平板培养时，细 胞悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度。
二.单细胞培养技术
• 外植体的细胞经过启动、分裂和分化等一 系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。 如果在原来的培养基上继续培养愈伤组织， 会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的 积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化 变黑、死亡。如果要让愈伤组织继续生长 增殖，必须定期地（2～4个星期）将它们 分成小块“接种到新鲜的培养基上，这样 愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。这 个过程就叫继代培养。
问题？
• 如果在琼脂培养基或液体培养基中，植板细胞的 初始密度为1*105个/ml,植板后由相邻细胞形成的 细胞群落常混在一起。 • 如果降低植板密度或完全孤立培养单细胞，则可 避免这个问题，但是，当低于临界密度时，细胞 就不能分裂，原因是什么？