第四章 植物细胞培养方法(修改)

二.单细胞培养技术
• • • • 2.由组织培养分离单细胞 步骤： ①诱导产生愈伤组织； ②愈伤组织反复继代，使组织不断增 殖，提高愈伤组织的松散性。 • ③将愈伤组织在液体培养基中培养，建立 悬浮培养系。
二.单细胞培养技术
• 在植物的组织培养中，从一块外植体形成典型的 愈伤组织，大致要经历三个时期：启动期、分裂 期和形成期。 启动期是指细胞准备进行分裂的时期。外源植物 生长素对诱导细胞开始分裂效果很好。 常用的有：2,4－D、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸 （IAA）、吲哚丁酸（IBA）等。通常使用细胞分 裂素和生长素比例在1:l或是小于1来诱导植物愈伤 组织的形成。
二.单细胞培养技术
• 分裂期是指外植体细胞经过诱导以后脱分 化，不断分裂、增生子细胞的过程。分裂 期愈伤组织的特点是：细胞分裂快，结构 疏松，颜色浅而透明。 • 分化期是指在分裂的末期，细胞内开始出 现一系列形态和生理上的变化，从而使愈 伤组织内产生不同形态和功能的细胞。这 些细胞类型有薄壁细胞、分生细胞、色素 细胞、纤维细胞等等。
二.单细胞培养技术
• （2）看护培养基本技术 • ①制培养基：在一个培养瓶中加入一定量厚的固 体培养基，灭菌后备用。 • ②接种愈伤和滤纸：在无菌的条件下，先将一小 块（1cm）活跃生长的愈伤组织接种到培养基上， 再在愈伤组织块上放一片（1cm² ）已灭菌的滤纸， 然后放置一个晚上。 • ③接种单细胞：将分离出的单个细胞接种到培养 基的滤纸上。 • ④恒温培养。
一.概述
• 3、植物细胞培养技术的优点 （1）可控制条件下生产有价值次级代谢产物； （2）细胞增殖速度快； （3）生产力不受自然条件的影响； （4）产品的产量和质量稳定，并具生产灵活性； （5）可进行特定的生物转化反应，即把各中初级 化合物转化成医药等更有效的化合物。
一.概述
• 例如：两种不同方式生产紫草宁的比较
Think over what the advantages and disadvantages are for it.
二.单细胞培养技术
• （3）平板培养的基本技术 • ①培养基配制 • 1.4%琼脂基本培养基+等量细胞培养液=0.7 % 琼脂条件培养基。 • ②悬浮细胞密度的调制 • 平板培养要求最初细胞密度（即初始植板密 度）为1×10 ³ 100×10 ³个/ml 。 ~ • 初始植板密度：单细胞固体平板培养时，细 胞悬浮液接种到琼脂培养基上最初细胞密度。
周围加石蜡油
旁边加石蜡油
盖盖玻片
盖盖玻片
置培养皿中26~28 ℃恒 温培养
平视图
二.单细胞培养技术
• （3）微室培养特点： ①能在显微镜下追踪单细胞分裂增殖形成 细胞团的全过程 ②培养基少，营养和水分难以保持，pH值 变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。
二.单细胞培养技术
• （4）微室培养要求：
• ①微室内不能有气泡。
二.单细胞培养技术
• 外植体的细胞经过启动、分裂和分化等一 系列变化，形成了无序结构的愈伤组织。 如果在原来的培养基上继续培养愈伤组织， 会由于培养基中营养不足或有毒代谢物的 积累，导致愈伤组织停止生长，甚至老化 变黑、死亡。如果要让愈伤组织继续生长 增殖，必须定期地（2～4个星期）将它们 分成小块“接种到新鲜的培养基上，这样 愈伤组织就可以长期保持旺盛的生长。这 个过程就叫继代培养。
常用的外植体及接种方法
从叶片上诱导出愈伤组织
从芽上诱导出愈伤组织
从茎段上诱导出愈伤组织
愈伤组织增殖与分化
各种各样的愈伤组织
愈伤组织的继代培养
分离
二.单细胞培养技术
• (3)通过原生质体再生获取植物细胞
二.单细胞培养技术
• (三)单细胞培养的方法
1、固体平板培养法 • （1）概念及用途： • ①概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的 细胞密度，接种在1mm左右的薄层固体培养基上 进行培养，称之为固体平板培养 。 • 或者是将单个细胞与融化的琼脂培养基均匀混合 后平铺一薄层在培养皿底上的培养方法。该方法 是Bergmann(1960年)首创。
二.单细胞培养技术
• • • • （3）特点： ①效果好，易于成功。 ②简便易行。 ③不能在显微镜下直接观察细胞的生长过 程。 • 注意：要得到单细胞系必须保证接种材料 是真正的单细胞。
二.单细胞培养技术
• （4）要求： • ①看护愈伤组织处于活跃生长状态； • ②愈伤组织和所要培养的细胞可以是同一个物种也 可以不同。 • 离体单细胞在直接培养技术下不分裂，看护培养 下则分裂，为什么？ • A.愈伤组织的存在给单细胞传递了某些生物信息； • B.愈伤组织为细胞的生长繁殖提供了某些物质条件， 主要是提供了营养物质和促进细胞分裂物质。
二.单细胞培养技术
• ②用途：是为了分离单细胞无性系，研究 其生理、生化遗传上的差异而设计的一种 单细胞培养技术。广泛应用于细胞、原生 质体及融合产物的培养。
二.单细胞培养技术
• （2）特点：可以定点观察；分离单细胞系 比液体浅层培养容易；培养细胞气体交换 不畅。
One of the most widely used method for single cell cultrue
• （4）平板培养必须注意的方面
• ①选用的培养基，无论是否条件培养基，必须是能够在 低的初始植板密度下使细胞生长。 • ②不要选用处在静止期过久的细胞。因为处在分裂旺盛 时期的细胞才有最高的植板率。 • ③在固体培养基中适宜的初始植板密度因植物种类而不 同。如：烟草细胞适宜的为5~10 ×10 ³个/ml,若低于此 数则植板率显著下降。 • ④接种时培养基的温度要控制，一般不超过35 ℃ 。
二.单细胞培养技术
• 4、微室培养
• （1）微室培养的概念及用途 • ①概念：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室 中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方 法，称微室培养。 • ②用途：主要用来观察细胞生长、分裂、形成细胞 团的过程。
• （2）微室培养的技术
凹穴载玻片
1滴含单细胞培养 液
培养在浅层液体培养基中
液体培养基 用途：主要用来增殖细胞。
3、看护培养
恒温 培养 1个 月
Single cell Filter paper
Nurse callus
2~3月
单细胞无性系
用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，并使 其生长和增殖。这个愈伤组织称块为看护愈伤组织
二.单细胞培养技术
• （1）看护培养的含义及用途 • 概念：指用一块活跃生长的愈伤组织来看 护单个细胞，并使其生长和增殖的方法。 • 用途：诱导形成单细胞系。 • Muir(1954)首先用此法培养出烟草单细胞株。 Sharp(1972)成功将此法用于番茄的花粉培 养，诱导花粉形成单倍体细胞系。
• • 完整植株 收获时间 紫草宁浓度（％干重） 2～3年 1～2 14
• 植物细胞培养 3周
单细胞培养 根据培养对象 单倍体培养 原生质体培养 悬浮培养（液体培养） 根据培养基类型
固体培养(固相化培养)
一.概述
细胞培养与组织培养不同的是： 细胞培养的目的不是使细胞形成组织以 致更多的植物体，而是通过大规模的细 胞培养已获得人类所需的细胞次生代谢 产物。
Leabharlann Baidu
二.单细胞培养技术
• (一)植物单细胞培养的意义 • 1、有利于获得纯细胞系，悬浮培养细胞间细胞间在遗传、 生理和生化上存在差异，这些差异反映在它们的产量、品 质、抗病虫性和抗逆性等方面。如果能将高抗、高产、高 品质的细胞株筛选出来，无疑会带来巨大的经济效益。 2、有利于排除体细胞的干扰，进行细胞特性、细胞生长 规律、细胞代谢过程及其调节控制规律等方面的研究； 3、有利于对细胞活动跟踪观察，观察细胞个体的分裂、 分化、生长和繁殖情况； 4.有利于生物转化和天然化合物的生产。
一.概述
• 4. 与微生物相比，植物细胞具有的特性 • 细胞大，细胞壁以纤维素为主要成分，耐拉不耐 扭，抗剪切能力低； • 生长速率慢，为防止培养过程中染菌，需加抗生 素； • 细胞培养需氧，而培养液粘度大，且不能强力通 风搅拌； • 产物在细胞内且产量低； • 细胞常生长成各种大小的团块，增加了悬浮培养 的难度等。
问题？
• 如果在琼脂培养基或液体培养基中，植板细胞的 初始密度为1*105个/ml,植板后由相邻细胞形成的 细胞群落常混在一起。 • 如果降低植板密度或完全孤立培养单细胞，则可 避免这个问题，但是，当低于临界密度时，细胞 就不能分裂，原因是什么？
• 原因是植物细胞的生长繁殖需要一定浓度 的某些内源化合物。
• ②最好微室的厚度不要超过20微米，盖
玻片 的厚度要在0.17~0.18毫米左右。 • ③观察时要保持温度和培养时的一致。
二.单细胞培养技术
• 5、饲养层培养基技术
• 其方法是：作饲喂层的细胞经射线照射后．核失 活不能分裂，但细胞仍存活。饲喂层细胞用平板
技术制成一琼脂(糖)平板．此平板亦即“伺喂
二.单细胞培养技术
• (二)植物细胞的获取 • 1.从外植体直接分离植物细胞 • 外植体经过切割、捣碎或酶解，然后经过一定孔径的不锈 钢筛网过滤，得到细胞悬浮液。悬浮液中所含的完整细胞 数量较少，但分散性好。 • 要直接从植物器官中分离单细胞，通常采用机械法和酶解 法。 • 叶片是由从外植体分离单细胞的最好材料 • (1)机械法： • 第一种方法：用刀片刮叶片； • 第二种方法：先把叶片轻轻研碎； • 上述二种方法，都要通过过滤和离心净化细胞。
二.单细胞培养技术
植板率评估：它以能长出细胞团的单细胞 在接种单细胞中所占的比例来表示。 植板率(％)＝(形成的细胞团数/接种的细胞 数)×100％
二.单细胞培养技术
• 计算式中每个平板新形成的细胞团数的计 数方法有两种： • 一是直接计数法，注意计量时要掌握合适 的时间，即细胞团肉眼已能分辨，但尚未 长合到一起的时候。 • 二是感光法，在暗室的红光下将一印相纸 放于欲计数的培养皿下，其上放一光源使 培养皿中细胞团印到相纸上，冲洗照片计 数。
一.概述
• 5. 植物细胞培养的培养基 • 定义：含有一定营养成分，供组织培养植物生长 的基质 • 无机营养成分：C，H，O大量元素及部分微量元素 • 有机营养成分 ① 含N物质：包括维生素和氨基酸 ② 碳源：2%—5%的蔗糖 ③ 琼脂：起支持作用 ④ 生长激素：生长素，细胞分裂素和赤霉素 • PH值：5.0－6.0
二.单细胞培养技术
• 2. 液体浅层培养 • 将悬浮在培养液中的细胞过滤，得到游离单 细胞和小细胞团培养在浅层液体培养基中。 • 用途：主要用来增殖细胞 • 特点：有利于有毒物质的扩散； • 有利于气体交换； • 不利于定点观察； • 单细胞生长、分裂后，难以得到单细胞系。
液体浅层培养
将悬浮在培养液中的细胞过滤得到游离单细胞 和小细胞团
二.单细胞培养技术
• (2)酶解法： • 分离细胞是利用果胶酶、纤维素酶处理， 分离出具有代谢活性的细胞，该法不仅能 降解中胶层，而且还能软化细胞壁。所以 在用酶解法分解细胞的时候，必须对细胞 给予渗透压保护。常用的渗透压保护剂是 甘露醇。
二.单细胞培养技术
• ③机械法和酶解法比较 • 机械法：细胞不受到酶的伤害；不用质壁 分离，有利于进行生理和生化研究 ；容易 伤害细胞结构，获得完整细胞团或细胞数 量极低 ；细胞易破。 • 酶解法：细胞受到酶的伤害；要质壁分离； 细胞产量高；细胞不易破。
二.单细胞培养技术
• ③制平板：细胞悬浮液与融化状态（35 ℃ ） 条件培养基按一定比例均匀混合，倒成平 板，盖上培养皿盖。用封口膜封严培养皿。 • ④培养： 26℃置暗处培养21天。低倍显微 镜观察， 记数单细胞或小细胞团，计算置 板效率（也称植板率）。 • 植板效率（或植板率）：已形成细胞团的 百分数（即每100个铺在平板上的细胞中有 多少个能长出细胞团）。
第四章 植物细胞培养方法
杨柏云
南昌大学生命科学学院
一.概述
• 1、细胞培养技术的概念： • 是指在人工控制条件下，高密度地培养有 用细胞的技术。 • 2、细胞培养技术的目的： • 增殖由基因重组、细胞融合、细胞突变等 获得的新型有用细胞。 • 生产人类必需的、不可缺少的有用物质， 如药物和工业原料等。